细胞DNA定量分析的其它用途.docx
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细胞DNA定量分析的其它用途
细胞DNA定量分析的其它用途
细胞DNA定量分析早期诊断肺癌
常规痰细胞学检查诊断肺癌敏感性很低
●肺癌发达国家中病死率最高
●没有广为接受的方法进行筛查及早期诊断
●常规痰细胞学检查仅能得到10%--23%的阳性结果,即使是最有经验的细胞学医师,阳性率只可能达到20%--30%。
常规痰细胞学检查和DNA定量分析的比较性研究
●痰标本来自833个体,其中
✧肺癌177例
✧非典型增生98例
✧无异常发现者558例
●标本来自5个不同城市的7家医院
✧临床诊断
✧无异常发现:
至少胸部x光检查正常
✧肺癌非典型增生者均由病理学检查证实
●双盲法分组研究,评估常规法、DNA定量法和两种方法联合使用可检出的痰细胞中
细胞DNA定量分析能提高肺癌的检出率
常规细胞学
敏感性特异性
DNA定量分析
敏感性特异性
腺癌
14%90%
60%90%
早期腺癌
14%90%
45%90%
细胞DNA定量分析早期诊断肺癌标本种类
●痰
●支气管灌洗物和刷取物
细胞DNA定量分析系统检测胸腹水中的癌细胞
腹水细胞学检查鉴别癌性和炎性腹水
●腹水细胞学检查在鉴别癌性腹水和炎性腹水中起着关键性作用
●63例腹水标本被包括在研究中
●50~100ml腹水经离心后制片,巴氏和DNA染色
●每例至少有4000个腹水细胞核接受DNA定量分析
细胞DNA定量分析用于炎性和癌性腹水的鉴别诊断
较常规细胞学方法更客观、敏感
腹水性质
例数
炎性细胞(%)
2倍体细胞(%)
异倍体细胞(%)
炎性腹水
急性炎症
4
46.8±6.6
46.0±8.0
0.4±0.1
慢性炎症
7
46.0±1.6
74.0±18.0
0.5±0.8
结核性
15
8.8±1.1
76.0±3.8
0.6±0.2
癌性腹水
恶性间皮瘤
4
5.8±1.0
66.0±11.0
3.4±1.6
转移性肿瘤
33
4.8±1.0
72.0±3.9
9.7±1.0
对炎性和癌性腹水的正确诊断率
炎性腹水
癌性腹水
常规细胞学检查
88%
84%
DNA定量分析
100%
92%
细胞DNA定量分析的其它用途
●使用细胞DNA定量分析对消化道、泌尿道、口腔及咽喉的脱落细胞进行肿瘤的诊断也已经获得令人满意的结果
●乳腺包块和甲状腺包块的细针穿刺物也是DNA定量分析的合适标本
核酸检测技术
基本概念
定义:
通过检测与疾病相关的DNA或RNA来检测和诊断疾病
简史:
核酸检测技术是分子诊断领域中的重要组成部分,经历了前多聚酶链(PCR)期,PCR期和后PCR期。
核酸技术的发展过程
分期时段主要技术平台
前PCR期1976-1985核酸杂交技术
PCR期1985-1995PCR扩增技术
后PCR期1995-今DNA芯片等高通量技术
最活跃的几大领域:
●传染病和感染性疾病
✧各种病原的检测、耐药基因检测及分子流行病学调查
●血液病学和肿瘤学
✧早期诊断、确诊、转移和复发的监测,预警,预后推测、耐药基因推测及化疗效果评估等
●遗传病
✧家谱分析、诊断及遗传趋势分析等
●鉴定试验
✧亲缘鉴定、移植物抗宿主免疫反应监测,刑事证据学等。
多聚酶链反应—PCR
基本原理:
多聚酶链反应是一项根据DNA互补原理,使用耐热DNA聚合酶催化由引物起始链延长反应而复制新DNA分子的体外核酸扩增技术。
PCR反应的精髓是在短时间内扩增出大量的特定DNA片片断。
30个1~3小时
扩增循环
十亿个扩增产物
PCR的使用引起病原学检测的一场革命:
●引起人类感染的病原仅有5%可以通过人工培养等常规方法进行检测
●以PCR和杂交技术为代表的分子诊断技术有望检测其它95%的感染病原
PCR是目前检测感染病原的最敏感技术
人类乳头状瘤病毒的检测
人类乳头状瘤病毒
人类乳头状瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)是一组包括100余个亚型的DNA病毒,很多亚型与皮肤粘膜的良性及恶性病变有关。
在人类生殖道已经分离和鉴定出40余个亚型,其中至少有15个亚型被确定与宫颈癌密切相
关,他们被称为高危人类乳头状瘤病毒(HighRiskHPV,简称HRHPV)
人类乳头状瘤病毒与宫颈癌
人类乳头状瘤病毒是最先被确定的致癌病毒之一,主要引起生殖道和肛门癌。
持续携带HRHPV诱发宫颈癌的病理学现象已经被广泛接受,而分子检测技术的使用证实5~20%女性携带HRHPV,35岁以上的女性多为持续携带,而HRHPV也与宫颈癌恶性变的程度密切相关。
因此,在英、美等发达国家,HPV的检测已经成为宫颈癌普查常规的一部分,HRHPV的检出被作为宫颈癌预警、监测、早期诊断及病情进展的重要指标。
高危亚型人类乳头状瘤病毒与宫颈癌细胞形态分期的关系
细胞形
态分形
例数
HPV(%)
HRHPV(%)
HRHPV:
LRHPV
正常和良性变(CIN0)
402
196
(48.8)
150
(83.3)
5:
1
轻度不典型增生(CIN1)
199
133
(66.8)
109
(88.6)
8:
1
重度不典型增生(CIN2)
119
119
(93.3)
103
(96.3)
26:
1
原位癌(CIN3)
147
144
(97.9)
139
(99.3)
139:
1
总计
864
581
(67.2)
501
(91.1)
10:
1
资料来自于对1699例在宫颈癌普查中发现或怀疑细胞学异常者中的864例进行的人类乳头状瘤病毒检测和病理学诊断的平行研究
人类乳头状瘤病毒对宫颈癌的“预警”作用
1、大量的研究表明在两年之内,近30%的HRHPV携带者可发展为轻或重度不典型增生,而仅有3%的低危亚型(LRHPV)携带者发生相应的变化。
2、60~70%宫颈细胞学检查正常的HRHPV携带者,在四年内可出现宫颈细胞检查异常。
3、连续两次HRHPV检测阴性者,在2~4年内一般不会出现宫颈细胞学检查异常。
万盖得建立的宫颈癌预警-监测-早期诊断系统
建立多重PCR技术检测全部15个HRHPV,用DNA定量分析进行宫颈细胞学检查。
HPV检测可以筛选出潜在的宫颈癌高发人群,对这一人群定期进行HPV检测和DNA定量分析将极大地提高宫颈癌的早期检出率,从而提高治愈率。
该系统基本流程如下:
宫颈标本采集、送检注意事项
1.与万盖得门诊部联系,领取配套的宫颈刷、固定液及标本管等取材必备物品。
2.以宫颈外口为圆心,用宫颈刷轻轻刷取3~5周,不要过分用力以免损伤引起出血。
若白带过多,应先用无菌干棉球轻试去,再刷取标本。
(见图)
3.刷取完毕后用镊子将刷头取下放入盛有10ml固定液的标本收集管内,使细胞样品存留在固定液中。
4.填写申请单,将条形码分别贴在标本管和申请单上。
5.标本收集管请放置于阴凉避光处保存。
当室温超过30℃,请放在冰箱内(4℃)保存。
6.完成上诉步骤后,通知万盖得物流部完成标本运送过程。
7.多重PCR检测人类乳头状瘤病毒(HPV)可以与DNA定量分析共用同一液基标本,也可单独采集宫颈分泌物送检。
慢性生殖道感染和性传播疾病病原检测
慢性生殖道感染和性传播性疾病
●是一组全球范围内非常多见的疾病
✧美国每年有120万性传播疾病新发病例
✧每年全球有超过2000万例新发生的生殖道溃疡性疾病(也称软性下疳)
●国内在过去20年中发病率明显上升,但缺乏系统的发病率和流行病学统计资料
●是一组可预防和可控制的疾病
✧行为改变:
可减少被感染和感染他人的机会
✧生物医学介入:
明确的诊断和恰当的治疗可治愈病人并减少传染来源
引起慢性生殖道感染和性传播疾病的常见病原
细菌和寄生虫类:
沙眼衣原体、淋病奈瑟球菌、苍白密螺旋体、杜克嗜血杆菌、解脲支原体、生殖道支原体及阴道毛滴虫等
病毒类:
1型和2型艾滋病毒(HIV-1和HIV-2),1型和2型单纯胞疹病毒(HSV-1和HSV-2),人类乳头状瘤病毒(HPV),乙型肝炎病毒(HBV)及巨细胞病毒(CMV)等
对两组疾病的诊断困难造成对发病率统计的困难
●较高比例的病人无明显临床症状
●绝大多数病人无特异性症状
●一定比例的病人为混合感染
●对多数病原缺乏可靠的实验室诊断方法
可选择的实验检测方法及优、缺点
●直接涂片镜检:
简便快捷但缺乏敏感性
●人工培养:
中等敏感性、高度特异性,仅部分病原可人工培养
●非扩增法
✧血清学抗体检查:
回顾性
✧EIA抗原抗体检查:
中等敏感度,仅为回顾性
✧直接荧光抗体检查:
中等敏感度
✧DNA探针检查:
中等敏感度
●分子扩增法:
高度敏感和特异性,正成为很多病原检测的金标准,需分子技术支持
分子扩增技术的应用促进了对性传播疾病的了解
以沙眼衣原体为例,多聚酶链反应(PCR)为主体的分子检测技术提供了如下信息:
●发病早:
在年轻人群开始发病,女性为15-19岁;男性为20-24岁
●携带率高:
人群中平均沙眼衣原体携带率为3-5%,美国育龄妇女携带率可高达25%
●性传播疾病患者中的高检出率:
因性病就诊者中20%可查出沙眼衣原体
●无症状携带者构成主要传染源:
80%女性和50%男性感染沙眼衣原体者无临床症状
PCR已成为检测性病病原的金标准
沙眼衣原体不同检测技术的比较
方法
敏感性
特异性
培养法
70%-80%
100%
直接荧光抗体
70%-80%
约100%
EIA
70%-80%
约100%
探针杂交
70%-80%
约100%
PCR
100%
约100%
万盖得开发的多重PCR技术检测性传播疾病病原
病原选择:
被测病原
临床和实验室特征
淋病奈瑟球菌
全世界每年约有7800万新发病例,最优化的培养条件可达80~95%阳性率
沙眼衣原体
占非淋病性病的30~50%,培养阳性率低
生殖道支原体
新确定的性病病原,无法人工培养
解脲支原体
人工培养生长缓慢,也引起新生儿呼吸道及中枢神经系统感染
杜克嗜血杆菌
新确定的性病病原,无法人工培养
苍白密螺旋体
传统的性病病原,目前仍不少见
阴道毛滴虫
常见生殖道感染病原,每年全球约有1亿3千万新发病例,培养要求高,生长慢
万盖得多重PCR性病病原检测的方法学特征:
●两套引物确保检测结果的可靠性
✧第一套引物检测上述七种病原
✧第二套引物证实第一套引物扩增的阳性结果
●敏感快捷
✧全部检测过程在24小时内完成
✧3×10-7ng的目的DNA可被测出
●检测标本
✧女性:
尿道和宫颈分泌物
✧男性:
尿道分泌物和前列腺液
万盖得多重PCR性病病原检测的适用人群:
●性传播疾病的高危人群
✧冶游史者
✧性工作者
●慢性泌尿生殖道感染人群
✧多数性病病原也可通过密切接触而发生慢性泌尿生殖系统感染
✧性病患者的性伴侣
●婚前体检
✧筛查年轻的无症状携带者
✧防止婚后交互感染
脑脊液中病原的检测
中枢神经系统感染和诊断
重症中枢神经系统感染的病死率高,常规实验室诊断不能为临床提供有效支持。
因此,需要新一代的实验诊断手段。
如下原因造成常规检测方法的低敏感性:
1、愈来愈多的病毒感染
2、部分细菌性和多数病毒性病原不能用人工培养法检测
3、采集标本前使用抗生素降低阳性检出率
人类疱疹病毒经常引起中枢神经系统感染
引起中枢神经系统感染的常见疱疹病毒如下:
1型和2型人类单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2),带状疱疹病毒(VZV),巨细胞病毒(CMV),和EB病毒(EBV)。
由于一些有效的抗病毒药已经用于临床,早期正确的诊断病毒性病原已经具有实际意义。
脑脊液中检测病毒的困难
●传统试验诊断技术的局限性
✧活体脑组织中分离病毒阳性率仅为40%-60%
✧脑脊液细胞培养的阳性率很低
✧脑脊液和血清ELISA病毒抗体检测阳性只能回顾性的证实感染曾经发生
✧脑脊液病毒抗原检测的敏感性还没有达到令人满意的程度
●脑脊液病毒病原的分子检测
✧在英、美等发达国家PCR技术检测脑脊液中的病毒已被广泛接受
✧PCR获得阳性结果的机会比传统法高88倍
PCR法检测脑脊液中疱疹病毒
(Mayoclinic,May1999-May2001)
病毒
检测例数
阳性例数(%)
人类单纯疱疹病毒
1型
2型
带状疱疹病毒
巨细胞病毒
EB病毒
总计
12864
1079
1258
892
16093
522(4.0)
164(1.2)
358(2.8)
128(11.9)
28(2.2)
64(7.2)
742(4.6)
万盖得多重PCR检测脑脊液中的疱疹病毒
●单管多重PCR同时检测7种疱疹病毒
✧人类单纯疱疹病毒1型和2型
✧带状疱疹病毒
✧巨细胞病毒
✧EB病毒
✧人类疱疹病毒6型和7型
●3×10-7ng的阳性对照DNA能被测出
●最小标本需求量仅为200微升
细菌性中枢神经系统感染
●细菌性脑膜炎仍为世界范围内的常见病
●可为轻症,也可为重症致死性感染
−单纯感染:
病死率2~3%
−伴中毒性休克:
病死率高于50%
●传统实验诊断的局限性
−显微镜下观察:
敏感性低
−细菌培养:
耗时长,阳性率低
−免疫抗原检查:
低敏感性
−免疫抗体检查:
“回顾性”
PCR法检测脑脊液中病原明显优于传统方法
不同方法检测CSF中脑膜炎双球菌的比较
方法标本数 阳性检出结果
用抗生素前(%) 用抗生素后(%) 总计(%)
涂片镜检73 16/47(34)5/18(27) 22/73(30)
CSF培养73 9/47(19)2/18(11) 11/73(13)
血培养103 17/66(25)6/28(21) 23/103(22)
CSFPCR56 31/33(93)14/16(87)50/56(89)
血PCR80 31/51(60)21/25(84)56/80(70)
服用抗生素对PCR检查不造成明显影响
用抗生素后不同时间采集标本阳性检出结果(%)
方法 <12h12~48h48~72h总计
培养 0/20(0)0/8(0)0/2(0)0/31(0)
镜检 6/20(30)3/8(38)0/3(0)9/31(29)
CSFPCR 1719(89)4/5(80)2/3(67)23/27(85)
血PCR 9/9(100)4/9(44)0/0(0)13/18(72)
万盖得建立的多重PCR同时检测6种以上细菌病原
●被检测的细菌性病原
−脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、无乳链球菌、嗜单核细胞李斯特菌和大肠杆菌
−其他细菌
●技术特征:
分两步三组多重PCR扩增鉴定上述病原
呼吸道感染病原的检测
呼吸道感染是人类最重要的感染之一
●肺炎在成人和儿童都是最常见的感染之一
●在发展中国家,病死儿童中30%是由于呼吸道感染
●典型和非典型性肺炎
−典型肺炎:
约2/3由肺炎双球菌引起
−非典型肺炎病原包括:
肺炎支原体,肺炎衣原体,军团菌,百日咳杆菌等
●病毒正成为呼吸道感染的优势病原
−70%儿童呼吸道感染
−30%成人呼吸道感染
检测呼吸道感染病原存在着不同的困难
●病原学诊断不能为流行病学和临床治疗提供足够的支持
−在部份分子方法使用后,仍有50%的呼吸道感染无法检测到病原
●常规监测技术的局限性
−直接涂片:
低敏感性(细菌)或无法检测(病毒)
−培养:
生长缓慢(非典病原)或不能生长(部分病毒)
−血清学检查:
低敏感性或“回顾性”
PCR检测细菌性非典型肺炎病原明显优于常规法
125份标本中肺炎双球菌、流感杆菌和结膜莫拉菌检测的比较性研究
●29%PCR和培养均为阳性
●没有培养阳性而PCR阴性的现象
●48%为PCR阳性但培养阴性
●77%至少一种细菌可以被PCR检出
PCR和培养法检测百日咳、副百日咳杆菌(532例)
标本总数PCR阳性(%)培养阳性(%)
53267(12.6%)17(3.2%)
万盖得多重PCR检测细菌性非典型肺炎病原
●被检测的主要病原
−肺炎支原体:
仅次于肺炎双球菌的肺炎病源,暴发流行常可发生,培养需要5周,发病2-3周后血清学可呈阳性
−肺炎衣原体:
占社区获得性肺炎的10%,难以人工培养
−军团菌:
条件致病菌,主要见于免疫功能低下者,占社区获得性非典型的3-8%,侵袭力增加使病死率达到30%,培养困难
−百日咳杆菌:
主要见于尚未接种疫苗的新生儿,及成人因疫苗接种时间过长后抗体减少而发病,在美国,占儿童和成人非典型的5~10%
●可以被包括在内的其他病原:
肺炎双球菌和流感嗜血杆菌
PCR是检测病毒性非典型肺炎病原的最好方法
●一个代表性的研究报告
−临床标本:
1118份取自由呼吸道感染症状儿童的鼻咽腔吸出物
−九重RT-PCR被使用检测病原,阳性为395例
●结果
病原
腺病毒
肠病毒
流感病毒A
流感病毒B
副流感病毒1
副流感病毒3
呼吸道合胞病毒
肺炎支原体
肺炎衣原体
检出率%
12.9
10.6
20.0
2.8
3.5
4.3
37.5
8.1
0.2
万盖得多重RT-PCR检测病毒性非典型肺炎病原
●可以被检测的主要病毒
−腺病毒:
为DNA病毒,常见的47个人类亚型
−肠病毒:
人类最常见和最重要的病毒性病原之一,常见的27个血清型可被测出
−流感病毒A和B:
可以测出全部亚型
−副流感病毒1和3
−呼吸道合胞病毒:
可以测出亚组A和B
●可以被包括在内的其它病原:
肺炎支原体和衣原体
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