1、细胞DNA定量分析的其它用途细胞DNA定量分析的其它用途细胞DNA定量分析早期诊断肺癌常规痰细胞学检查诊断肺癌敏感性很低肺癌发达国家中病死率最高没有广为接受的方法进行筛查及早期诊断常规痰细胞学检查仅能得到10%-23%的阳性结果，即使是最有经验的细胞学医师，阳性率只可能达到20%-30%。常规痰细胞学检查和DNA定量分析的比较性研究痰标本来自833个体，其中肺癌177例非典型增生98例无异常发现者558例标本来自5个不同城市的7家医院临床诊断无异常发现：至少胸部x光检查正常肺癌 非典型增生者均由病理学检查证实双盲法分组研究，评估常规法、DNA定量法和两种方法联合使用可检出的痰细胞中细胞DNA定
2、量分析能提高肺癌的检出率常规细胞学敏感性 特异性DNA定量分析敏感性 特异性腺癌14% 90%60% 90%早期腺癌14% 90%45% 90%细胞DNA定量分析早期诊断肺癌标本种类痰支气管灌洗物和刷取物细胞DNA定量分析系统检测胸腹水中的癌细胞腹水细胞学检查鉴别癌性和炎性腹水腹水细胞学检查在鉴别癌性腹水和炎性腹水中起着关键性作用63例腹水标本被包括在研究中50100ml腹水经离心后制片，巴氏和DNA染色每例至少有4000个腹水细胞核接受DNA定量分析细胞DNA定量分析用于炎性和癌性腹水的鉴别诊断较常规细胞学方法更客观、敏感腹水性质例数炎性细胞（%）2倍体细胞（%）异倍体细胞（%）炎性腹水急性
3、炎症446.86.646.08.00.40.1慢性炎症 746.01.674.018.00.50.8结核性158.81.176.03.80.60.2癌性腹水恶性间皮瘤45.81.066.011.03.41.6转移性肿瘤334.81.072.03.99.71.0对炎性和癌性腹水的正确诊断率炎性腹水癌性腹水常规细胞学检查 88%84%DNA定量分析100%92%细胞DNA定量分析的其它用途使用细胞DNA定量分析对消化道、泌尿道、口腔及咽喉的脱落细胞进行肿瘤的诊断也已经获得令人满意的结果乳腺包块和甲状腺包块的细针穿刺物也是DNA定量分析的合适标本核酸检测技术基本概念定义：通过检测与疾病相关的DNA或
4、RNA来检测和诊断疾病简史：核酸检测技术是分子诊断领域中的重要组成部分，经历了前多聚酶链（PCR）期，PCR期和后PCR期。 核酸技术的发展过程分期 时段 主要技术平台前PCR期 1976-1985 核酸杂交技术PCR期 1985-1995 PCR扩增技术后PCR期 1995-今 DNA芯片等高通量技术最活跃的几大领域：传染病和感染性疾病各种病原的检测、耐药基因检测及分子流行病学调查血液病学和肿瘤学早期诊断、确诊、转移和复发的监测，预警，预后推测、耐药基因推测及化疗效果评估等遗传病家谱分析、诊断及遗传趋势分析等鉴定试验亲缘鉴定、移植物抗宿主免疫反应监测，刑事证据学等。多聚酶链反应PCR基本原理
5、：多聚酶链反应是一项根据DNA互补原理，使用耐热DNA聚合酶催化由引物起始链延长反应而复制新DNA分子的体外核酸扩增技术。PCR反应的精髓是在短时间内扩增出大量的特定DNA片片断。 个 13小时扩增 循环 十亿个扩增产物PCR的使用引起病原学检测的一场革命：引起人类感染的病原仅有5%可以通过人工培养等常规方法进行检测以PCR和杂交技术为代表的分子诊断技术有望检测其它95%的感染病原PCR是目前检测感染病原的最敏感技术 人类乳头状瘤病毒的检测人类乳头状瘤病毒人类乳头状瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）是一组包括100余个亚型的DNA病毒，很多亚型与皮肤粘膜的良性及恶性病
6、变有关。在人类生殖道已经分离和鉴定出40余个亚型，其中至少有15个亚型被确定与宫颈癌密切相关，他们被称为高危人类乳头状瘤病毒（High Risk HPV, 简称HRHPV）人类乳头状瘤病毒与宫颈癌人类乳头状瘤病毒是最先被确定的致癌病毒之一，主要引起生殖道和肛门癌。持续携带HRHPV诱发宫颈癌的病理学现象已经被广泛接受，而分子检测技术的使用证实520女性携带HRHPV, 35岁以上的女性多为持续携带，而HRHPV也与宫颈癌恶性变的程度密切相关。因此，在英、美等发达国家，HPV的检测已经成为宫颈癌普查常规的一部分，HRHPV的检出被作为宫颈癌预警、监测、早期诊断及病情进展的重要指标。高危亚型人类乳
7、头状瘤病毒与宫颈癌细胞形态分期的关系细胞形态分形例数HPV（）HRHPV（）HRHPV： LRHPV正常和良性变（CIN0）402196（48.8）150（83.3）5:1轻度不典型增生（CIN1）199133（66.8）109（88.6）8:1重度不典型增生（CIN2）119119（93.3)103(96.3)26:1原位癌（CIN3）147144(97.9)139(99.3)139:1总计864581(67.2)501(91.1)10:1资料来自于对1699例在宫颈癌普查中发现或怀疑细胞学异常者中的864例进行的人类乳头状瘤病毒检测和病理学诊断的平行研究人类乳头状瘤病毒对宫颈癌的“预警”作
8、用1、大量的研究表明在两年之内，近30的HRHPV携带者可发展为轻或重度不典型增生，而仅有3的低危亚型(LRHPV)携带者发生相应的变化。2、6070宫颈细胞学检查正常的HRHPV携带者，在四年内可出现宫颈细胞检查异常。3、连续两次HRHPV检测阴性者, 在24年内一般不会出现宫颈细胞学检查异常。万盖得建立的宫颈癌预警监测早期诊断系统建立多重PCR技术检测全部15个HRHPV，用DNA定量分析进行宫颈细胞学检查。HPV检测可以筛选出潜在的宫颈癌高发人群，对这一人群定期进行HPV检测和DNA定量分析将极大地提高宫颈癌的早期检出率，从而提高治愈率。该系统基本流程如下： 宫颈标本采集、送检注意事项1
9、.与万盖得门诊部联系，领取配套的宫颈刷、固定液及标本管等取材必备物品。2.以宫颈外口为圆心，用宫颈刷轻轻刷取35周，不要过分用力以免损伤引起出血。若白带过多，应先用无菌干棉球轻试去，再刷取标本。（见图）3.刷取完毕后用镊子将刷头取下放入盛有10ml固定液的标本收集管内，使细胞样品存留在固定液中。4.填写申请单，将条形码分别贴在标本管和申请单上。5.标本收集管请放置于阴凉避光处保存。当室温超过30，请放在冰箱内（4）保存。6.完成上诉步骤后，通知万盖得物流部完成标本运送过程。7.多重PCR检测人类乳头状瘤病毒（HPV）可以与DNA定量分析共用同一液基标本，也可单独采集宫颈分泌物送检。慢性生殖道感
10、染和性传播疾病病原检测慢性生殖道感染和性传播性疾病 是一组全球范围内非常多见的疾病美国每年有120万性传播疾病新发病例每年全球有超过2000万例新发生的生殖道溃疡性疾病（也称软性下疳）国内在过去20年中发病率明显上升，但缺乏系统的发病率和流行病学统计资料是一组可预防和可控制的疾病行为改变：可减少被感染和感染他人的机会生物医学介入：明确的诊断和恰当的治疗可治愈病人并减少传染来源引起慢性生殖道感染和性传播疾病的常见病原细菌和寄生虫类：沙眼衣原体、淋病奈瑟球菌、苍白密螺旋体、杜克嗜血杆菌、解脲支原体、生殖道支原体及阴道毛滴虫等病毒类：1型和2型艾滋病毒（HIV-1和HIV-2），1型和2型单纯胞疹病
11、毒（HSV-1和HSV-2），人类乳头状瘤病毒(HPV)，乙型肝炎病毒（HBV）及巨细胞病毒(CMV)等对两组疾病的诊断困难造成对发病率统计的困难较高比例的病人无明显临床症状绝大多数病人无特异性症状一定比例的病人为混合感染对多数病原缺乏可靠的实验室诊断方法可选择的实验检测方法及优、缺点直接涂片镜检：简便快捷但缺乏敏感性人工培养：中等敏感性、高度特异性，仅部分病原可人工培养非扩增法血清学抗体检查：回顾性EIA抗原抗体检查：中等敏感度，仅为回顾性直接荧光抗体检查：中等敏感度DNA探针检查: 中等敏感度分子扩增法：高度敏感和特异性，正成为很多病原检测的金标准，需分子技术支持分子扩增技术的应用促进了对
12、性传播疾病的了解 以沙眼衣原体为例，多聚酶链反应（PCR）为主体的分子检测技术提供了如下信息：发病早：在年轻人群开始发病，女性为15-19岁；男性为20-24岁携带率高：人群中平均沙眼衣原体携带率为3-5%，美国育龄妇女携带率可高达25%性传播疾病患者中的高检出率：因性病就诊者中20%可查出沙眼衣原体无症状携带者构成主要传染源：80%女性和50%男性感染沙眼衣原体者无临床症状PCR已成为检测性病病原的金标准沙眼衣原体不同检测技术的比较方法敏感性特异性培养法70%-80%100%直接荧光抗体70%-80%约100%EIA70%-80%约100%探针杂交70%-80%约100%PCR100%约10
13、0%万盖得开发的多重PCR技术检测性传播疾病病原病原选择：被测病原临床和实验室特征淋病奈瑟球菌全世界每年约有7800万新发病例，最优化的培养条件可达8095%阳性率沙眼衣原体占非淋病性病的3050%，培养阳性率低生殖道支原体新确定的性病病原，无法人工培养解脲支原体人工培养生长缓慢，也引起新生儿呼吸道及中枢神经系统感染杜克嗜血杆菌新确定的性病病原，无法人工培养苍白密螺旋体传统的性病病原，目前仍不少见阴道毛滴虫常见生殖道感染病原，每年全球约有1亿3千万新发病例，培养要求高，生长慢万盖得多重PCR性病病原检测的方法学特征：两套引物确保检测结果的可靠性第一套引物检测上述七种病原第二套引物证实第一套引物
14、扩增的阳性结果 敏感快捷全部检测过程在24小时内完成310-7ng的目的DNA可被测出检测标本女性：尿道和宫颈分泌物男性：尿道分泌物和前列腺液万盖得多重PCR性病病原检测的适用人群：性传播疾病的高危人群冶游史者性工作者慢性泌尿生殖道感染人群多数性病病原也可通过密切接触而发生慢性泌尿生殖系统感染性病患者的性伴侣婚前体检筛查年轻的无症状携带者防止婚后交互感染脑脊液中病原的检测中枢神经系统感染和诊断重症中枢神经系统感染的病死率高，常规实验室诊断不能为临床提供有效支持。因此，需要新一代的实验诊断手段。如下原因造成常规检测方法的低敏感性：1、愈来愈多的病毒感染2、部分细菌性和多数病毒性病原不能用人工培养
15、法检测3、采集标本前使用抗生素降低阳性检出率人类疱疹病毒经常引起中枢神经系统感染引起中枢神经系统感染的常见疱疹病毒如下：1型和2型人类单纯疱疹病毒（HSV-1和HSV-2），带状疱疹病毒（VZV），巨细胞病毒（CMV），和EB病毒（EBV）。由于一些有效的抗病毒药已经用于临床，早期正确的诊断病毒性病原已经具有实际意义。脑脊液中检测病毒的困难传统试验诊断技术的局限性活体脑组织中分离病毒阳性率仅为40%-60%脑脊液细胞培养的阳性率很低脑脊液和血清ELISA病毒抗体检测阳性只能回顾性的证实感染曾经发生脑脊液病毒抗原检测的敏感性还没有达到令人满意的程度脑脊液病毒病原的分子检测在英、美等发达国家PCR
16、技术检测脑脊液中的病毒已被广泛接受PCR获得阳性结果的机会比传统法高88倍PCR法检测脑脊液中疱疹病毒（Mayo clinic, May1999-May2001）病毒检测例数阳性例数 (%)人类单纯疱疹病毒1型 2型带状疱疹病毒巨细胞病毒EB病毒总计128641079125889216093522（4.0）164（1.2）358 (2.8）128 (11.9)28(2.2)64(7.2)742(4.6)万盖得多重PCR检测脑脊液中的疱疹病毒单管多重PCR同时检测7种疱疹病毒人类单纯疱疹病毒1型和2型带状疱疹病毒巨细胞病毒EB病毒人类疱疹病毒6型和7型310-7ng的阳性对照DNA能被测出最小标
17、本需求量仅为200微升细菌性中枢神经系统感染细菌性脑膜炎仍为世界范围内的常见病可为轻症，也可为重症致死性感染单纯感染：病死率23伴中毒性休克：病死率高于50传统实验诊断的局限性显微镜下观察：敏感性低细菌培养：耗时长，阳性率低免疫抗原检查：低敏感性免疫抗体检查：“回顾性”PCR法检测脑脊液中病原明显优于传统方法不同方法检测CSF中脑膜炎双球菌的比较方法 标本数 阳性检出结果 用抗生素前（）用抗生素后（）总计（）涂片镜检 73 16/47(34） 5/18(27) 22/73(30)CSF培养 73 9/47(19) 2/18(11) 11/73(13）血培养 103 17/66(25) 6/28
18、(21) 23/103(22)CSF PCR 56 31/33(93) 14/16(87) 50/56(89)血PCR 80 31/51(60) 21/25(84) 56/80(70)服用抗生素对PCR检查不造成明显影响 用抗生素后不同时间采集标本阳性检出结果（）方法 12h 1248h 4872h 总计培养 0/20(0) 0/8(0) 0/2(0) 0/31(0)镜检 6/20(30) 3/8(38) 0/3(0) 9/31(29)CSF PCR 1719(89) 4/5(80) 2/3(67) 23/27(85)血PCR 9/9(100) 4/9(44) 0/0(0) 13/18(72)
19、万盖得建立的多重PCR同时检测6种以上细菌病原被检测的细菌性病原脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、无乳链球菌、嗜单核细胞李斯特菌和大肠杆菌其他细菌技术特征：分两步三组多重PCR扩增鉴定上述病原呼吸道感染病原的检测呼吸道感染是人类最重要的感染之一肺炎在成人和儿童都是最常见的感染之一在发展中国家，病死儿童中30是由于呼吸道感染典型和非典型性肺炎典型肺炎：约23由肺炎双球菌引起非典型肺炎病原包括：肺炎支原体，肺炎衣原体，军团菌，百日咳杆菌等病毒正成为呼吸道感染的优势病原70儿童呼吸道感染30成人呼吸道感染检测呼吸道感染病原存在着不同的困难病原学诊断不能为流行病学和临床治疗提供足够的支持在部份分
20、子方法使用后，仍有50的呼吸道感染无法检测到病原常规监测技术的局限性直接涂片：低敏感性（细菌）或无法检测（病毒）培养：生长缓慢（非典病原）或不能生长（部分病毒）血清学检查：低敏感性或“回顾性”PCR检测细菌性非典型肺炎病原明显优于常规法125份标本中肺炎双球菌、流感杆菌和结膜莫拉菌检测的比较性研究29PCR和培养均为阳性没有培养阳性而PCR阴性的现象48为PCR阳性但培养阴性77至少一种细菌可以被PCR检出PCR和培养法检测百日咳、副百日咳杆菌 （532例）标本总数 PCR阳性（） 培养阳性（） 532 67（12.6） 17（3.2%)万盖得多重PCR检测细菌性非典型肺炎病原被检测的主要病原
21、肺炎支原体：仅次于肺炎双球菌的肺炎病源，暴发流行常可发生，培养需要5周，发病23周后血清学可呈阳性肺炎衣原体：占社区获得性肺炎的10，难以人工培养军团菌：条件致病菌，主要见于免疫功能低下者，占社区获得性非典型的38，侵袭力增加使病死率达到30，培养困难百日咳杆菌：主要见于尚未接种疫苗的新生儿，及成人因疫苗接种时间过长后抗体减少而发病，在美国，占儿童和成人非典型的510%可以被包括在内的其他病原：肺炎双球菌和流感嗜血杆菌PCR是检测病毒性非典型肺炎病原的最好方法一个代表性的研究报告临床标本：1118份取自由呼吸道感染症状儿童的鼻咽腔吸出物九重RT-PCR被使用检测病原，阳性为395例结果病原腺病毒肠病毒流感病毒A流感病毒B副流感病毒1副流感病毒3呼吸道合胞病毒肺炎支原体肺炎衣原体检出率12.910.620.02.83.54.337.58.10.2万盖得多重RT-PCR检测病毒性非典型肺炎病原可以被检测的主要病毒腺病毒：为DNA病毒，常见的47个人类亚型肠病毒：人类最常见和最重要的病毒性病原之一，常见的27个血清型可被测出流感病毒A和B：可以测出全部亚型副流感病毒1和3呼吸道合胞病毒：可以测出亚组A和B可以被包括在内的其它病原：肺炎支原体和衣原体
