第六篇实验指导范文.docx
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第六篇实验指导范文
教学试验指导A类(基础教学类)
第一部分药物筛选
试验一、促胃肠动力药物筛选—离体组织、器官水平药物筛选
一、目的
1.了解离体器官试验特点及注意事项,掌握离体器官试验的基本技术。
2.学习利用离体器官进行药物筛选的方法,观察受试物对离体胃、肠平滑肌的影响。
3.了解科研课题设计原则,科研课题立项需阐述的相关内容。
4.了解科研论文写作规范(包括图表制作技巧等)。
5.掌握试验数据统计、处理方法。
二、与试验相关的背景知识
(一)离体器官试验特点及注意事项
离体器官试验常用的离体器官有心脏、血管、肠段、子宫及神经肌肉标本,用离体标本可比较直观地观测药物的作用。
不同的动物标本用于测定不同类的药物作用。
1.离体蛙心和兔心用于观测药物对心脏活动(包括心率、输出量、收缩力等)的影响;猫、兔、豚鼠和狗乳头肌标本,在适宜条件下,可较长时间保持良好的试验状态,常用于观测药物对心肌基本生理特性(如收缩性、兴奋性、自律性)的影响。
2.兔主动脉条对α受体兴奋药十分敏感,是测定作用于α受体药物的一个理想标本。
已被广泛用来鉴定和分析拟交感药和其对抗药的作用。
3.豚鼠回肠自发活动较少,描记时有稳定的基线,可用来测定拟胆碱药的剂量-反应曲线。
而兔空肠具有规则律收缩活动,可观测拟肾上腺素药和抗肾上腺素药,拟胆碱药和胆碱药对活动的影响。
4.未孕兔子宫对α受体兴奋药十分敏感,可用于鉴定α受体兴奋药或阻断药。
豚鼠离体气管片主要含β受体,广泛用于鉴定和分析作用于β受体的药物的作用。
5.蛙坐骨神经腓肠肌标本,小鸡颈半棘肌,大白鼠膈神经标本常用来评价作用于骨胳肌的药物。
6.在离体器官法中,不同动物的不同器官都要求最适宜的营养环境,因此各种动物的人工生理溶液成份和配制都有区别。
在离体器官研究中应特别引起重视。
(1)渗透压:
要等渗,但不同动物对同一物质的等渗浓度要求不同。
如生理盐水溶液,冷血动物用0.6~0.75%;温血动物用0.8%~0.9%。
(2)各种离子:
溶液中含有一定比例的不同电解质离子职Na+、K+、Ca2+、Mg2+、H+、OH-等是维持组织器官功能所必须。
组织器官不同,对生理溶液中离子的成份和浓度要求亦不同。
(3)pH影响:
人工生理盐水中pH一般要求为中性,对于哺乳动物心脏冠状动脉,酸性生理深夜可使平滑肌松驰;碱性则可使节律加快,振幅缩小。
(4)其它条件:
葡萄糖提供组织活动所需能量,临用时再加入,以防变质;有的离体器官需要氧气,如离体子宫、离体兔心、乳头肌等。
而离体肠管通以空气就可以了。
(二)胃肠运动功能障碍疾病及药物治疗现状
世界卫生组织调查表明,我国有80%的人患有不同程度胃肠病居世界首位。
近年来,功能性胃肠病已受到广泛的关注,如功能性消化不良、肠胃激综合征、功能性便秘等,这些功能性胃肠病的症状大部分和胃肠动力障碍有关,表现为胃排空延缓,胃窦、幽门和十二指肠协调异常或肠通过过慢,患者可有腹胀、恶心、便秘等,尤其是肠易激综合征是一个全球性的问题,西方国家人群患病率为5%~24%,每年花费高额的医疗费用,患者的生存质量亦受到不同程度的影响。
在最常见造成工作、学习缺勤的疾病中,肠易激综合征的发病率仅次于普通感冒,胃肠动力和蠕动的正常模式被打乱,是导致肠易激综合征发生的核心机制,这种异常肠蠕动包括肠动力减弱(便秘型)和增强(腹泻型)。
前主要采用解痉剂治疗,但只能缓解腹痛,不能治疗便秘。
而缓泻剂能缓解便秘,但不能缓解腹痛、腹胀,而且不能长期服用。
因此,研究开发新的调节胃肠动力的药物有重要的社会效益和广阔的市场前景。
(三)临床常用促动力药
1.第一代如甲氧氯普胺,商品名为胃复安、灭吐灵。
它可作用于胃肠道和中枢神经系统,兼有促动力和止吐的功效。
可增加食管下端括约肌的张力,使其压力增加,防止胃内容物反流至食管,另外可以增加食管和胃的蠕动,促进胃的排空,临床上可用于治疗功能性消化不良、糖尿病性胃滞留(胃轻瘫)、胃食管反流病等,由于其有中枢作用,可用于治疗和预防恶心、呕吐,但中枢神经系统的副作用常见。
2.第二代的促动力药是多潘立酮,商品名为吗丁啉。
为胃动力药,加强胃内固体和液体的排空,还可协调胃窦和十二指肠运动,对肠道无明显作用,对于那些由于肠道动力差导致的腹胀、大便秘结的病人,可以使用全胃肠道动力药物。
它的适应症和胃复安大致相同,也可治疗恶心、呕吐。
常见的副作用有口干、头痛、高泌乳素血症引起的乳房增大、疼痛、溢乳等。
由于不易通过血脑屏障,极少引起椎体外系的不良反应。
3.第三代促动力药是西沙比利。
它对整个胃肠道包括从食管到肛门括约肌均有促动力作用,能增强生理反应,恢复正常的动力模式。
西沙比利已广泛用于胃食管反流病、功能性消化不良、胃轻瘫、功能性便秘,以便秘为主的肠易激综合征等,它还是唯一治疗假性肠梗阻有效的促动力药。
其副作用小,一些反应如肠胃鸣、腹痛、稀便其实是肠动力增加的表现,多见于开始用药的起初几天里,继续用药后这些反应常自然消失。
由于它的作用较胃复安和吗丁啉均强,作用于全消化道,安全性好,一般认为可作为当前治疗胃肠动力障碍的首选药物。
在使用促动力药中,应注意用药时间,一般在餐前15~30min及睡前服用,不宜在餐后服。
(四)胃肠动力中药
最突出的特点在于标本兼治,适应症包括:
慢性胃炎、胃脘疼痛、慢性浅表性胃炎、胃酸过多、胃十二指肠溃疡、胃胀、胃气虚、消化不良、肠道枯燥和中老年便秘。
主要分为:
①促胃动力中药;②促胃肠动力中药;③双相调节胃肠动力中药。
力胃颗粒由百合、乌药、帜实及虎杖四味中药组成。
主治胃气失和,胃阴不足兼有血瘀者,但作用机制不明确,组方尚缺少现代药理学研究的支持。
通过离体胃肠平滑肌试验,一方面可探讨药物作用机制、组方依据,一方面为新药发现提供线索。
三、教学试验安排及内容
(一)教学分组
在一个教学单元内,根据学生人数,将学生分为8组,每组2~5人,并分成上下两班,4组/班。
(二)试验方案
1.上半班采用胃平滑肌作为试验材料,建议受试物:
百合、或乌药、或帜实、或虎杖、或四药合并的水提取物,也可采用各教学单位自行提取的物质,用于筛选。
西药对照:
胃复安、西沙必利。
2.上半班采用肠平滑肌作为试验材料,建议受试物:
百合、或乌药、或帜实、或虎杖、或四药合并的水提取物,也可采用各教学单位自行提取的物质,用于筛选。
西药对照:
胃复安、西沙必利。
四、试验方法及步骤
(一)试验材料
1.动物:
大鼠(220~280g/只),雄性。
2.器材:
恒温平滑肌槽1台、通气泵1个、铁支架1个、止水夹2个,生物信号采集处理系统,张力换能器,1ml注射器4个,培养皿1个,50ml烧杯1个,组织剪、眼科剪各1把,止血钳两个,镊子两个,丝线若干,移液器一个,砝码一个。
3.试剂:
台氏液。
4.受试药:
0.5%胃复安溶液;0.1%西沙必利溶液;20%百合水提取物;10%乌药水提取物;15%帜实水提取物;15%虎杖水提取物;15%四药合并的水提取物。
(二)试验步骤
1.对大鼠离体胃平滑肌正常张力的影响试验。
(1)制备胃肌条标本:
断头处死,立即剖取胃底部浸泡于台氏液液中,制备成“Z”型,长约2.5cm、宽约0.4cm的胃肌条标本。
(2)冲洗浴槽,并在其中加入台氏液30ml(标线处),加热,维持水温在37℃~38℃。
调节通气泵,缓慢通入气泡,并调节1~2个气泡/秒。
(3)取标本,两端对角处用丝线结扎。
一端挂在通气钩上,放入浴槽,另一端从张力换能器的弹簧片小孔中穿出并挂上1g砝码(给予负荷),打开计算机,进入生物信号采集系统,选择“张力通道”,观察活动曲线。
待其平衡后,用丝线将挂砝码的丝线牢牢固定于弹簧片上,除去砝码。
(4)待标本在浴槽内稳定10min左右,记录一段正常活动曲线,然后用注射器依次向浴槽中滴加药液0.2ml。
每加一组药时立即标记,并观察、记录2min频率及收缩幅度。
每次药物作用后,用温暖的台氏液冲洗2~3次,待张力恢复基线(约5min)后再试验其他药物。
(5)停止记录曲线,保存数据。
断电断气,取出回肠,冲洗浴槽。
2.对大鼠离体胃平滑肌正常张力的影响试验。
打开腹腔,找到回盲部,在离其2~3cm的回肠处剪断,取出回肠,置于盛有台氏液的培养皿中,沿肠壁分离并剪去肠系膜,将肠管剪成数段,轻轻冲出肠内容物,最后将肠管剪成2~3cm的小段备用。
加样顺序与操作同上。
(三)试验结果的原始记录
表1药物对大鼠胃或肠平滑肌作用测定原始数据
给药前
1min内
的平均值
给药后
第1min内
的平均值
给药后
第2min内
的平均值
频率
振幅
频率
振幅
频率
振幅
0.5%胃复安溶液
0.1%西沙必利溶液
20%百合水提物
10%乌药水提物
15%帜实水提物
15%虎杖水提物
15%四药合并水提物
(四)结果处理
上下班分别收集4组试验结果,计算平均值及标准差,根据拟研究题目,设计表格,并与给药前相比,进行统计学差异检验。
示范表格如下。
促进率(%)=(给药后值-给药前值)/给药前值×100%
表2受试物对大鼠胃或肠平滑肌收缩频率的影响(χ±SD,n=4)
收缩频率
促进率(%)
1min
2min
1min
2min
0.5%胃复安溶液
0.1%西沙必利溶液
20%百合水提物
10%乌药水提物
15%帜实水提物
15%虎杖水提物
15%四药合并水提物
与给药前相比*P<0.05,**P<0.01
表3受试物对大鼠胃或肠平滑肌收缩振幅的影响(χ±SD,n=4)
收缩振幅
促进率(%)
1min
2min
1min
2min
0.5%胃复安溶液
0.1%西沙必利溶液
20%百合水提物
10%乌药水提物
15%帜实水提物
15%虎杖水提物
15%四药合并水提物
与给药前相比*P<0.05,**P<0.01
五、试验报告内容及格式要求
(一)题目
根据你的理解或兴趣,可将报告题目拟定为:
1.“胃复安、西沙必利对胃肠平滑肌作用特征比较”或
2.“中药促胃肠动力药筛选及组方依据研究”或
3.“中、西药促胃肠动力作用特征研究”或
4.自定。
(二)研究背景及意义
根据选择的题目,说明研究背景、立题依据、研究意义。
(三)试验方法
根据选择的题目,描述试验方法(剔除不必要的试验方法)。
(四)试验结果
根据选择的题目,选择所需的试验数据,并进行统计处理,以图或表的形式描述结果。
(五)讨论
分析结果,引用相关文献,并进行充分讨论。
附件:
提交上下班8个组的全部试验原始数据。
注意事项:
1.冲洗和分离肠管时动作应轻柔,尽量避免牵拉肠管。
2.标本制备好后,放在盛有温暖台氏液的培养皿中保存,以免影响标本的反应性。
在整个操作过程中,尽量使肠段在温暖的台氏液而不是在空气中。
3.肠管两端穿线时,切勿将肠管缝死,只需穿过一层肠壁,靠端的位置恰到好处。
4.通气时使气泡呈小米粒大小均匀上升,水泡不宜过多或过少。
5.将肠管放入裕管时,注意肠管和连线都不要触及管壁;在用砝码标定后,调节连线松紧度,用线系牢,并且线应垂直桌面,加入的台氏液要超出肠管。
6.加药时不要把药液直接加到回肠上,以免影响结果,最好直接加到台氏液中。
7.换台氏液时,切勿使用冰冷台氏液。
8.换液时应按“暂停”,以减少对张力换能器的影响。
9.在整个过程中不要按“停止”,以免数据的丢失。
10.原始记录数据表多采用“主题表格”,报告正文中的表格应采用“三线表”。
(刘敏)
试验二、胃肠解痉药物筛选及机制探讨
—离体组织、器官水平的药物筛选
一、目的
1.了解胃肠解痉药的应用现状及作用机制。
2.学习利用工具药进行初步的药物作用机制探讨。
二、与试验相关的背景知识
(一)平滑肌与疾病
平滑肌痉挛可引起多种疾病,如胃肠平滑肌痉挛可致腹痛、腹泻,腹泻是指大便次数及粪便水分增加,是胃肠道最常见的症状之一。
支气管平滑肌痉挛可致哮喘,哮喘发作时,支气管平滑肌痉挛,粘膜水肿,腺体分泌增加,造成气管变窄而导致阻塞性呼吸困难,气管和支气管是连接喉与肺之间的管道部分,由软骨、粘膜等构成,气管和支气管均以“C”形软骨为支架,以保持其持续开放状态,气管和软骨的缺口对向后方,由平滑肌纤维和结缔组织的膜壁所封;胆道平滑肌收缩可致胆绞痛,胆囊平滑肌由松散排列的环形、纵行和斜行的肌束构成。
膀胱平滑肌由自主神经系统双重神经支配,但未发现有真正的运动神经存在。
平滑肌的收缩比较迟钝,但能持久,膀胱平滑肌的收缩是由尿液膨胀刺激引起的;子宫平滑肌收缩可能致早产,影响胎儿正常发育。
(二)平滑肌活动的控制与调节
平滑肌细胞约保持55-60mV的静息电位,产生机制和骨骼肌类似。
单位平滑肌细胞有产生动作电位的能力,而且通过细胞间通道可使相邻细胞也产生动作电位。
平滑肌的收缩受钙离子浓度的调控,钙离子的来源有两种,一种是胞内肌浆网储存的钙,另外一种就是细胞外钙。
平滑肌在短暂的收缩后,产生持久收缩,前者依赖胞内储存的钙而后者依赖胞外钙的内流,在平滑肌细胞上,L型钙通道被认为是外钙内流的主要途径,因此大部分解痉剂都作用在L型钙通道上。
(三)胃肠痉挛及治疗药物
胃肠痉挛性腹痛主要由受寒、饮食不当、精神刺激等因素造成胃肠功能紊乱,平滑肌痉挛致腹痛。
常用胃肠解痉药治疗。
常用药物:
①溴丙胺太林(普鲁本辛),具有较强的解除胃肠道痉挛及抑制胃分泌的作用,药效可持续约6h;②氢溴酸山莨菪碱片654-2,能使痉挛的平滑肌松弛,适用于胃肠痉挛引起的绞痛;③颠茄流浸膏(颠茄片),能解除平滑肌痉挛,抑制腺体分泌,常用于胃肠平滑肌痉挛引起的疼痛;④盐酸哌仑西平片,能抑制基础胃酸分泌,也能减少胃蛋白酶原和胃蛋白酶的分泌,其抗平滑肌肉痉挛的作用比阿托品强,可用于胃肠平滑肌痉挛引起的疼痛、急性及慢性胃十二指肠溃疡;⑤目前有学者采用硝苯吡啶治疗胃肠痉挛性腹痛,40例临床观察,显效29例,有效8例,无效3例,而对照组阿托品治疗35例,显效10例、有效12例、无效13例。
认为硝苯吡啶具有止痛快、疗效高、副作用少等优点。
但硝苯吡啶的解痉作用有待试验证实。
三、教学试验安排及内容
(一)教学分组
在一个教学单元内,根据学生人数,将学生分为8组,每组2~5人。
(二)试验方案
采用肠平滑肌作为试验材料,受试物:
生理盐水、阿托品、硝苯吡啶、复方木香注射液(含广木香、乌药、枳实、黄荆子)。
也可采用各教学单位自行提取的物质。
1~4组采用Ach(乙酰胆碱)、BaCl2作为致痉药;5~6组采用CaCl2、Hist(组织胺)作为致痉药。
四、试验方法及步骤
(一)试验材料
1.动物:
同试验一。
2.器材:
同试验一。
3.试剂:
台氏液;致痉药:
Ach(100µg/ml)、BaCl2(50mg/ml)、CaCl2(25mg/ml)、Hist(250µg/ml)。
4.受试药:
0.01%硝苯吡啶;0.1%阿托品;1%复方木香注射液。
(二)试验步骤
离体肠标本制备及试验方法同试验一。
分别用Ach、BaCl2、CaCl2、Hist溶液0.2ml,引起离体肠肌收缩,待平稳后,分别加入受试药物0.2ml,并与生理盐水对照,描记肠肌收缩曲线,记录给药后收缩幅度增减的克数,计算对肠肌收缩的抑制率。
加样顺序见原始记录表。
(四)试验结果的原始记录
表1受试物对Ach致大鼠肠平滑肌痉挛作用测定原始数据(1~4组)
给药前
1min内的平均值
给药后
第1min内的平均值
给药后
第2min内的平均值
频率
振幅
频率
振幅
频率
振幅
1.生理盐水
2.Ach
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
3.阿托品
4.Ach
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
5.硝苯吡啶
6.Ach
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
7.复方木香注射液
8.Ach
表2受试物对BaCl2致大鼠肠平滑肌痉挛作用测定原始数据(1~4组)
给药前
1min内的平均值
给药后
第1min内的平均值
给药后
第2min内的平均值
频率
振幅
频率
振幅
频率
振幅
1.生理盐水
2.BaCl2
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
3.阿托品
4.BaCl2
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
5.硝苯吡啶
6.BaCl2
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
7.复方木香注射液
8.BaCl2
表3受试物对CaCl2致大鼠肠平滑肌痉挛作用测定原始数据(5~8组)
给药前
1min内的平均值
给药后
第1min内的平均值
给药后
第2min内的平均值
频率
振幅
频率
振幅
频率
振幅
1.生理盐水
2.CaCl2
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
3.阿托品
4.CaCl2
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
5.硝苯吡啶
6.CaCl2
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
7.复方木香注射液
8.CaCl2
表4受试物对Hist致大鼠肠平滑肌痉挛作用测定原始数据(5~8组)
给药前
1min内的平均值
给药后
第1min内的平均值
给药后
第2min内的平均值
频率
振幅
频率
振幅
频率
振幅
1.生理盐水
2.Hist
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
3.阿托品
4.Hist
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
5.硝苯吡啶
6.Hist
用温暖的台氏液冲洗2-3次,待张力恢复基线后继续试验
7.复方木香注射液
8.Hist
(五)结果处理
收集8组试验结果,计算平均值及标准差,根据拟研究题目,设计表格,并与生理盐水组相比,进行统计学差异检验。
示范表格如下。
对致痉药所致肠收缩抑制率=(致痉药收缩力-受试药的收缩力)÷致痉药收缩力×100%。
表5受试物对Ach致大鼠肠平滑肌痉挛作用的影响(χ±SD,n=4)
收缩幅度
抑制率(%)
1min
2min
1min
2min
生理盐水组
阿托品组
硝苯吡啶组
复方木香注射液组
与生理盐水组相比*P<0.05,**P<0.01
表6受试物对Bacl2致大鼠肠平滑肌痉挛作用的影响;表7受试物对Cacl2致大鼠肠平滑肌痉挛作用的影;表8受试物对Hist致大鼠肠平滑肌痉挛作用的影响,略。
五、试验报告内容及格式要求
(一)题目
根据你的理解或兴趣,可将报告题目拟定为:
1.“复方木香注射液解痉作用及机制初探”或
2.“阿托品、硝苯吡啶作用特征研究”或
3.自定。
(二)研究背景及意义
根据选择的题目,说明研究背景、立题依据、研究意义。
(三)试验方法
根据选择的题目,描述试验方法(剔除不必要的试验方法)。
(四)试验结果
根据选择的题目,选择所需的试验数据,并进行统计处理,以图或表的形式描述结果。
(五)讨论
分析结果,引用相关文献,并进行充分讨论。
注意事项:
同试验一。
(童静)
试验三、抗细菌、抗真菌药物筛选—细胞、病原体水平筛选
一、目的
1.掌握KB纸片法体外抗菌、抗真菌药物筛选方法,了解试管法体外抗菌、抗真菌药物筛选方法。
2.了解开发新的抗菌、抗真菌治疗药物迫切性及其研究进展。
3.观察天然产物提取物抗菌、抗真菌作用。
4.学习正交设计方法,获得最佳组成及浓度配比。
二、与试验相关的背景知识
目前在感染性疾病领域内细菌耐药性已成为全球关注的热点。
1988年起世界卫生组织西太平洋地区办事处在中国北京和上海建立细菌耐药性监测点。
1996年世界卫生组织总部传染病监测控制处通过卫生部在中国合作开展细菌耐药性监测工作。
1998年欧洲、澳大利亚与美国等25个国家在丹麦集会,专门讨论对付细菌耐药性的策略,并形成哥本哈根建议书。
1999年美国十大政府机构共同拟订一项控制细菌耐药性的专题行动计划,以对付日益严重的细菌耐药性对人类健康构成的威胁。
在防治细菌耐药性及其传播的综合措施中,合理应用抗菌药物和继续寻找新的治疗药物仍是重要环节之一。
尤其是抗真菌药目前有效治疗药物较少,而引起感染的因素日趋增多。
近20多年来,随着大量广谱抗生素的应用、骨髓和脏器的移植、皮质激素及免疫抑制剂的应用、艾滋病发病率的增加、各种导管的介入和真菌检测技术的提高,念珠菌血症和系统性曲霉感染逐渐增多,资料显示,上述人群中深部真菌感染发生率约为11%~40%,感染呈逐年上升的趋势。
临床上已有耐氟康唑的念珠菌和耐两性霉素B的曲霉存在,且不良反应较多,因此迫切需要研制新的有效、安全抗真菌药物。
三、教学试验安排及内容
(一)教学分组
在一个教学单元内,根据学生人数,将学生分为8组,每组2~5人,并分成上下两班,4组/班。
(二)试验方案
1.上半班采用天然产物挥发油成分进行试验,建议受试验物:
柠檬油、丁香油,也可采用各教学单位自行提取的物质,作为A、B物质用于筛选。
第1、2组对A、B物质3个浓度进行试验,各处理方法重复一次。
第3、4组根据正交设计方案进行试验,各处理方法重复一次。
2.下半班采用天然产物物质,建议受试验物:
小檗碱、大蒜素,也可采用各教学单位自行提取的C、D物质;
第5、6组对C、D物质3个浓度进行试验,各处理方法重复一次;
第7、8组根据正交设计方案进行试验,各处理方法重复一次。
3.上下半班各组均采用KB纸片法,受试菌株选用S.aureus、E.coli、C.albicans,阳性对照物分别为青霉素、链霉素、两性霉素B。
四、试验方法及步骤
(一)药品及配置方法
牛肉膏蛋白胨培养基:
蛋白胨10g
牛肉膏5g
氯化钠5g
琼脂15g
蒸馏水1000ml
除琼脂外其他成分溶解于蒸馏水中,调pH至7.2~7.4,分装后一部分加入琼脂加热溶解,另一部分待用,于121℃压力蒸汽灭菌20min
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