石墨烯为载体的钆类磁共振造影剂的构建.docx
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石墨烯为载体的钆类磁共振造影剂的构建
题目:
石墨烯为载体的钆类磁共振
造影剂的构建
石墨烯为载体的钆类磁共振造影剂的构建
摘要
石墨烯是一种新型纳米材料,由于优异的性能,其在材料、化学、物理、量子学、电子、机械以及生物领域都有很广阔的发展前景。
本文以自制的尺寸控制在200nm以下的氧化石墨烯为载体,制得了具有优异磁共振响应的磁共振成像(MRI)造影剂。
采用Hummers法制备氧化石墨烯,研究氧化条件对氧化石墨烯尺寸的影响,通过改变石墨烯基造影剂的制备条件,总结出了合理制备造影剂途径细节以及相关原理。
结果发现:
延长中温氧化阶段的时间,有利于降低氧化石墨烯的尺寸。
氧化石墨烯羧基化后,其被部分还原使层间距降低,这种狭小的层间有利于将钆离子牢固包裹,且羧基的引入使产物具有良好的分散稳定性。
关键词:
石墨烯;羧基化氧化石墨烯;钆;磁共振造影剂
ConstructionofGrapheneasaCarrierGadoliniumMRIContrastAgents
Abstract
Grapheneisanewkindofcarbonnanomaterials,whichwithexcellentperformanceshasbeenwidelyusedinfieldsofmaterials,chemistry,physics,quantumscience,electronics,mechanicalandbiologicalfields,andsoon.Inthispaper,anexcellentresonancemagneticresonanceimaging(MRI)contrastagentwaspreparedbyusinggrapheneoxidewithsizeofbelow200nmascarrier.ThegrapheneoxidewaspreparedthroughHummers’method.Theinfluencesofoxidationconditionstothesizeofthegrapheneoxidewerestudiedbychangingthepreparationconditions.Theresultsshowedthat:
prolongthereactiontimeofoxidationundermoderate-temperaturewillbenefittoreducethesizeofgrapheneoxide.Aftercarboxylation,thegrapheneoxidewaspartiallyreducedanditslayerspacingwillbedecreased.Thesmallerlayerdistanceisbenefiticalforwrappinggadoliniumion,theintroducedcarboxylgroupensurestheproducthasagooddispersionstability.studiesgraphene-basedMRIcontrastagent.
KeyWords:
graphene;carboxylfunctionalizedgrapheneoxide;gadolinium;magneticresonanceimagingcontrastagent
1绪论
1.1石墨烯
石墨烯(graphene)是一种二维材料,它由sp2杂化碳原子构成正六边形蜂窝网状结构晶体,即单层石墨片。
早在1976年石墨烯就被科学家们在理论上提出过,但经典热力学理论认为:
任何二维材料在有限温度下不稳定。
由于原子在熵函数与热力学温度不为零的条件下在会做无规则运动,三维材料中每个原子的周围都有其他原子阻挡这种无规运动会,而二维材料每个原子的第三维方向没有原子限制他们的运动,在一定条件下材料中的原子容易脱离材料,使整个材料不稳定、易分解,所以在过去的几十年里石墨烯一直是个乌托邦。
2004年Geim
小组用实践将这个材料由乌托邦带到现实,他们用微机械剥离法制备出了单层石墨烯,证明了石墨烯在普通条件下可以稳定存在,推翻了前面提到的热力学理论,惊动了凝聚态物理界,为科学的发展以及人类对自然规律的认知和探索奠定了新的里程碑,故在2010年他与俄罗斯物理学家Novoselov教授一起获得了诺贝尔物理学奖。
理论上的完美石墨烯具有优秀的电学
、力学、热学
、表面、光学
、量子学等方面性能,故在材料、化学、物理、机械、量子学、医学和生物学等方面近几年一直是研究热点。
但实际中制备出的石墨烯目前很难达到理想的程度,即单层无晶格缺陷的石墨烯。
即使能制备出高质量石墨烯,也很难大规模高产率制备,无法大规模制备高质量石墨烯,也就无法将它那些优秀的性能应用到现实生活中造福人类。
所以现在石墨烯的研究主要处于理论阶段,离工业大规模生产以及应用技术成熟还有很长的一段路要走。
石墨烯与其他材料复合可以增加其他材料的力学性能、电学性能、热力学性能和成炭率等。
1.2氧化石墨烯
石墨烯本身由于共轭效应比较稳定,不亲水也不亲油,很难与其他材料复合。
氧化还原法制备石墨烯的中间产物氧化石墨烯(grapheneoxide)就可以克服这个困难。
在最早的氧化还原法制备石墨烯的基础上,衍生出很多改进过的制备方法,其中Hummers法较其他方法更安全,被广泛使用。
氧化石墨烯是在石墨烯上连接了羟基、羧基、羰基和环氧基等基团,使石墨烯变得更亲水,这些基团也可以作为石墨烯与其他材料复合的桥梁,还可以用来制备更多类型的石墨烯衍生物。
纯石墨烯边缘碳原子成键不饱和容易脱落,时间长了就会使整个石墨烯平面瓦解。
氧化石墨烯边缘的羧基可以阻止这种现象,使石墨烯更稳定。
接连氧化基团的碳原子不再是sp2杂化,而是改变为sp3杂化,空间结构也由原来的平面结构改变为空间正四面体结构,其导电性能也会随之下降,但这并不影响它与其他材料的复合能力。
若利用石墨烯增强材料的力学性能能和热力学性能能,氧化石墨烯的氧化程度需要控制,太低不容易复合,太高又会破坏石墨烯本身优秀的力学和电学性能;若利用石墨烯增加成炭率或利用石墨烯的比表面积作载体,则应尽可能提高氧化石墨烯的氧化程度。
理论上氧化石墨烯的氧化程度越高,其溶液就越透明,颜色越接近黄色,氧化程度越低溶液就越黑。
氧化程度越高其尺寸也会越小。
1.3石墨烯在医学方面的应用
石墨烯在医学方面主要利用它较大的比表面积,充当载体或表面吸附体的角色。
例如癌症治疗,核医学诊断,药物运输,微生物检测,生物原件和细胞毒性等
都是石墨烯在医学领域的研究热点。
石墨烯由于其表面特性,容易吸附细菌细胞膜内的磷脂,从而使整个细胞膜土崩瓦解,没有细胞膜保护的细菌很容易受到外界的攻击,例如白细胞。
石墨烯在人体内易与血液中的血清白蛋白结合形成复合体,由此可避免石墨烯对人体细胞的破坏。
肿瘤的研究在不断发展和完善,理论上已经成熟,但在实际应用中却还是会遇到很多棘手的问题。
传统的一线肿瘤治疗方案有三种:
手术、化疗、放疗。
癌症是一种全身性的疾病,它是全身疾病的局部表现。
手术和放疗只能解决局部问题,不能从根本治愈癌症。
化疗虽然对全身都起作用,但副作用太大,杀伤癌细胞的同时也杀人体的正常细胞,对人体的摧残很严重,摧残人体正常细胞在一定程度上等于助长癌细胞,且大多数化疗药不能透过血脑屏障到达脑脊液杀伤颅内肿瘤。
于是人们研究出了靶向治疗药物。
靶向药物克服了传统一线肿瘤治疗方案的缺点,它通过口服给药,可以到达全身,它有选择性的只杀伤癌细胞,对正常细胞没有威胁,没有放化疗那样剧烈的副作用。
且靶向药的分子量较小,可以透过血脑屏障到达脑脊液。
但靶向治疗的局限性很大,常见的成人恶性肿瘤有小细胞和非小细胞两种,非小细胞又以鳞癌和腺癌多见。
靶向药不适合小细胞癌,而非小细胞癌里靶向药只适合治疗几种基因突变类的癌细胞,且不能代替化疗,需和化疗联合治疗。
以石墨烯充当肿瘤药物载体可以增强药效,但增强药效的同时也会增强副作用。
石墨烯可能不适合作为靶向药的载体,它会使整个复合体尺寸较大,不能透过血脑屏障对颅内肿瘤进行治疗。
而石墨烯基电化学生物传感器具有很高的灵敏度,这或许有助于靶向药物精确定靶以及让靶向药适合治疗更多类型的恶性肿瘤。
1.4磁共振成像
磁共振成像是分子影像技术的一种,与其它分子影像学方法相比具有较高的分辨率、能同时获得解剖与生理信息,有利于活体状态下研究疾病。
分子影像学是利用影像学手段研究在体条件下细胞内正常的或病理状态下的分子过程,在分子或细胞水平反映生物体生理、病理变化,为疾病过程的在体监测、基因治疗的在体示踪、药物的在体疗效评测和功能分子的在体活动规律研究提供新的技术,具有无创、实时、在体、特异、精细显像等优点。
分子影像学技术主要包括光学成像、核医学成像和磁共振成像等。
光学成像可以在细胞和分子水平进行活体示踪,具有高敏感、可进行连续实时监测、无创或微创等优点,但缺点在于穿透力有限;核医学成像利用放射性核素标记基质,借助PET或SPECT显像反映靶目标特定的生理活动,具有敏感度高、快速等优点,但其空间分辨率低,难以直观表达病变特征,使其应用受到很大限制。
三价的钆离子[Gd(Ⅲ)]的螯合物(比如,Gd-DTPA)作为磁共振分子探针,具有反映阳性结果,便于观察的优势,已得到临床广泛应用。
然而,Gd-DTPA类小分子造影剂作用时间较短,信号强度较弱,在心血管成像和癌细胞成像方面的应用受到限制。
针对这一问题,众多研究者从大分子改性、纳米载体的引入方面做了改进。
纳米载体的引入除了能提高造影剂的弛豫性能外,还具有构筑多功能和多模态探针的潜力。
纳米载体负载Gd(Ⅲ)的报道中,都必须先将DTPA类小分子配体通过共价键或非共价键作用连接在载体表面,或者要对载体进行改性提高亲水性进而增加Gd(Ⅲ)周围水分子浓度,反应较为复杂。
因此选择一种载体,可以直接负载Gd(Ⅲ),实现一步法制备高弛豫效率的磁共振造影剂意义较大。
氧化石墨作为纳米载体是因为:
GO本身具有大比表面积、大量亲水基团,羧基化后的GO片层上含有较高密度的羧基可直接螯合Gd(Ⅲ),实现一步法制备高弛豫效率的磁共振造影剂。
2实验部分
合成路线:
先用Hummers法
制备氧化石墨烯(GO),再在超声处理、强碱条件下加入氯乙酸进行亲核取代羧基化,再与GdCl
在35℃条件下恒温水浴加热12h螯合。
制备出的造影剂尺寸不能太大,应小于微米级别,否则无法进入人体。
2.1实验原料与设备
本实验所采用的主要实验原料与主要仪器设备分别见表2.1与表2.2。
表2.1主要原材料
名称
规格
生产厂家
天然磷片石墨
工业级
青岛天和达石墨优有限公司
高锰酸钾
AR
天津市河东区红岩试剂厂
硝酸钠
AR
天津市河东区红岩试剂厂
浓硫酸
AR
天津市河东区红岩试剂厂
双氧水
AR
天津市河东区红岩试剂厂
氯乙酸
AR
天津市河东区红岩试剂厂
氢氧化钠
AR
天津市河东区红岩试剂厂
六水氯化钆
AR
阿法埃莎公司
表2.2主要仪器设备
仪器名称
仪器型号
生产厂家
加热磁力搅拌器
DF-101S
巩义予华仪器有限责任公司
鼓风干燥箱
DHG-9070A
上海齐欣仪器有限公司
数显恒速搅拌器
S312-90
上海梅颖浦仪器有限公司
循环水真空泵
SHZ-DⅢ
巩义予华仪器有限公司
超声波清洗器
JK-300DB
金尼克机械制造有限公司
电子天平
AL104
梅特勒托利多有限责任公司
真空干燥箱
DZF-6050
上海齐欣仪器有限公司
红外光谱仪
激光拉曼谱仪
激光粒度仪
X射线光电子能谱
紫外可见吸收光谱
磁共振扫描仪
Nicolet-5700
HR800
ZetasizerNano
K-Alpha
UV-2550
3.0T
美国尼高力仪器公司
法国JY公司
马尔文仪器有限公司
赛默飞世尔科技公司
日本岛津
通用电气公司
2.2氧化石墨烯的制备
Hummers法制备氧化石墨烯分低温、中温和高温反应三个阶段,低温阶段在冰浴条件下进行30min,中温阶段在35℃水浴条件下进行30min,高温阶段98℃反应30min。
待高温反应结束后用盐酸和去离子水洗涤至中性。
2.2.1Hummers法制备氧化石墨烯
原料准备:
天然鳞状石墨、98%浓硫酸、高锰酸钾固体、无水硝酸钠、30%双氧水、5%稀盐酸。
仪器准备:
四口圆底烧瓶、水浴箱、超声水浴箱、铁架台、机械搅拌机、温度计、真空抽滤机、抽滤锥形瓶、离心机、离心管、鼓风真空干燥箱、透析袋。
实验过程:
(1)称取165ml浓硫酸、5g石墨、2.5g无水硝酸钠、15g高锰酸钾,用玻璃研钵研磨天然石墨,用少量浓硫酸将研磨后的石墨洗入四口烧瓶中,在安装好冰浴后,将瓶内温度控制在4℃以下加入剩余浓硫酸,再加入全部无水硝酸钠和高锰酸钾,此时控制温度在5℃以下,用机械搅拌机搅拌2h,此过程为低温反应阶段。
(2)搅拌2h后,混合液呈黄绿色,撤除冰浴,换成水浴,待烧瓶内温度达到35℃后反应1h,持续搅拌,此过程为中温反应阶段。
(3)反应1h后,混合液变稠,取230ml去离子水,向烧瓶内连续滴加,搅拌,将温度控制在100℃以下,滴加完成后温度下降,将水浴温度升高至98℃恒温搅拌反应30min,此过程为高温氧化阶段。
(4)将烧瓶从水浴中取出,用470ml预先加热至60℃的去离子水稀释,稀释后向混合液加入32ml左右30%过氧化氢溶液还原残余高锰酸钾,溶液此时呈深棕色。
(5)趁热用真空泵对混液进行抽滤,并用5%稀盐酸洗涤,抽不动时改用离心机洗涤,用盐酸至少洗6次以上,最后用去离子水洗涤,直至氧化石墨烯内PH接近中性。
最后将氧化石墨烯沉淀移至鼓风真空干燥箱中干燥,将不能离心分离的上清液装在透析袋内透析。
2.2.2Hummers改进法制备氧化石墨烯
a.低中温反应阶段在超声条件下进行,其余条件与原料配比不变。
超声波能给石墨烯传递能量,使石墨或石墨烯层间的作用力不稳定,容易剥离开,故通过超声波处理促进石墨层间的分离,高温反应阶段主要是收尾工作,用超声处理意义不大。
b.将普通方法制备的氧化石墨烯在相同条件配比下用Hummers法再氧化一遍。
应用在医学方面的石墨烯为了能进入人体,粒度应尽量小,氧化石墨烯的氧化程度越高,越有利于与其他物质的复合,也有利于羧基化和石墨烯层与层间的分离,一定程度上也能阻止石墨烯团聚,故将普通方法所得产品再氧化一遍以增加氧化程度。
c.其余条件、配比不变,将中温反应阶段由原来的1h延长至5天
。
由Hummers法制备氧化石墨烯的机理可知,三个氧化阶段中,起主要作用的是中温反应阶段,低温阶段主要作用是使氧化剂分子插在石墨层间,高温阶段主要是收尾工作,故理论上延长中温反应阶段的时间可以增加石墨烯的氧化程度,以及减小尺寸,更符合医学应用的要求。
2.3氧化石墨烯的羧基化
氧化石墨烯的表面和边缘有羧基、羟基和羰基,在制备Gd类造影剂时与Gd螯合起主要作用的是羧基,若增加羧基的数量就可以负载更多的Gd以及增加石墨烯与Gd之间作用的强度。
本次实验利用石墨烯上含氧官能团在碱性条件下不稳定的特点以及亲核取代机理,在碱性和超声处理条件下,向氧化石墨烯溶液滴加适量氯乙酸反应2h完成羧基化过程,制得羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)。
原料准备:
普通Hummers法制备的GO、Hummers法低中温过程超声处理的氧化石墨烯、氢氧化钠固体、氯乙酸固体;
仪器准备:
超声水浴箱、离心机、离心管、鼓风真空干燥箱、透析袋、PH机。
实验过程:
(1)将普通Hummers法制备的GO固体取0.5g和1.5g两份,分别标记为I和II,配成质量分数25%的溶液,超声处理约2h时完全溶解(超声机电流开到1.7A);
(2)待到I和II完全溶解后,称取3.0030g、9.0030g两份氢氧化钠固体,再称取7.50g氯乙酸固体,配成质量分数为25%的溶液。
(3)在超声常温水浴条件下,向I中缓慢滴加3g氢氧化钠配成的溶液,滴加过程中均匀搅拌;向II中缓慢滴加9g氢氧化钠与7.5g氯乙酸配成的溶液,滴加过程中均匀搅拌。
滴加完成后超声处理2h。
(4)分别称取4份Hummers法低中温超声处理制备的GO、取氢氧化钠固体、氯乙酸固体,分别编号为III、IV、V、VI,其配比如表2.3:
表2.3GO羧基化反应物料比(质量)
组分名称
实验编号
GO
NaOH
ClCH
COOH
III
1
6
5
IV
1
3
2.5
V
1
3
5
VI
1
4
5
实际称取质量如续表2.3:
(单位:
mg)
续表2.3GO羧基化反应物料比(质量)
组分名称
实验编号
GO
NaOH
ClCH
COOH
III
50.1
0.3023
0.2514
IV
50.0
0.1562
0.1255
V
50.0
0.1517
0.2505
VI
50.4
0.2020
0.2502
(5)将上述固体配成质量分数为25%的溶液,GO在超声条件下2h后溶解,与步骤(3)相同,向完全溶解的GO溶液加入对应组的氢氧化钠溶液与氯乙酸溶液,滴加过程中均匀搅拌,缓慢滴加,待全部滴加完后超声处理2h。
(6)将上述六组溶液在离心机内离心,并用5%稀盐酸洗涤至少3次,再用去离子水洗涤至GO衍生物内部PH值接近中性。
将离心管中的固体沉淀放在真空干燥箱中干燥,将离心无法分离的上清液放在透析袋内透析。
并定期观察透析袋内、外的PH值。
2.4钆在羧基化氧化石墨烯上的负载
原料准备:
2.2中I和II组的最终固体产物、5%稀盐酸、1g/L的GdCl
溶液、0.2%甲基橙溶液
仪器准备:
单口圆底烧瓶、磁力搅拌水浴锅、磁子、超声水浴箱、透析袋、温度计、PH计。
实验过程:
(1)安装好水浴装置,将2.2中I和II的产物配成质量分数25%的溶液,超声处理2h后溶解。
用PH计测PH值得I的PH=6.7,判断为rGO(reducedgrapheneoxide);II的PH=7.4,理论产物为GO-COOH,由于PH呈弱碱性,实际产物可能是GO-COONa。
将I的PH值用盐酸调至4.88,将II的PH值调至6.52。
(2)从PH调整后的I中取25ml标记为I-1,从II中取50ml标记为II-1。
将I-1和II-1分别装入圆底烧瓶中,置于恒温35℃水浴锅中,向烧瓶中放入磁子,打开磁力搅拌功能。
(3)向I-1中缓慢滴加2.5mlGdCl
溶液,向II-1中缓慢滴加5mlGdCl
溶液。
滴加速度约10s/滴。
滴加过程中应注意rGO或GO-COOH有无沉淀,若溶液开始浑浊应停止滴加。
(4)滴加完成后,封住烧瓶口,35℃恒温条件下,反应12h。
(5)反应结束后,将溶液放入透析袋内透析。
(6)透析到PH接近中性时,用甲基橙溶液检验是否有游离Gd
的存在,纯净的产物即为Gd(Ⅲ)-GO-COOH。
3结果与分析
3.1氧化条件对氧化石墨烯尺寸的影响
取2.1.1中普通Hummers法制备的GO,标记为n-GO,取2.1.2.1中低中温过程超声处理制备的GO,标记为ssw-GO,取2.1.2.2中用再氧化法制备的GO,标记为ROGO,去2.1.2.3中延长Hummers法中温反应阶段时间制备的GO,标记为lmt-GO。
取2.2.1中III~VI组样品所得产物GO-COOH分别标记为GO-COOH-I、GO-COOH-II、GO-COOH-III、GO-COOH-IV。
取2.2.1中I制备的rGO,标记为rGO。
将上述产品分别配成1mg/ml溶液,超声1h后测sizeanalysis结果如下表:
表3-1不同条件制得的GO、GO-COOH的尺寸(单位:
nm)
样品名称
size
rGO
448.5
n-GO
602
ROGO
252.7
Lmt-GO
206.2
ssw-GO
889.3
GO-COOH-I
383.7
GO-COOH-II
372.8
GO-COOH-III
382.5
GO-COOH-IV
347.7
由表中前5组数据可知由Hummers法制备GO,与普通Hummers法相比,延长中温反应时间制备的GO尺寸最小,氧化程度最高,用再氧化制备的GO尺寸也较小,其原理等于是延长低中高三个阶段的反应时间。
制备氧化石墨烯的后处理工作是很麻烦的,通常要洗涤3~5天,故相比之下,延长中温阶段氧化时间更节约时间,且制备出的GO粒度更小。
低中温过程超声处理制备的GO由于聚沉现象和PH不合适的缘故,测得结果与理论不符,表中后4组GO-COOH都是以低中温阶段超声处理的GO制备而得,故ssw-GO组的实际尺寸应小于347.7d.nm。
结合理论,低中温阶段超声处理对减小GO尺寸的贡献有限,但可以提高石墨和石墨烯层间分离的效率。
3.2氧化石墨烯的羧基化
3.2.1不同条件下的羧基化氧化石墨烯
反应前PH值:
III、IV约14,V约7~8,VI约为9~10。
反应后PH值如表3.2:
表3.2羧基化后反应体系pH值
样品
PH
加盐酸后PH
GO-COOH-I
5.018
不加
GO-COOH-II
10.66
4.984
GO-COOH-III
8.7
4.895
GO-COOH-IV
10.014
4.910
将上述样品透析至PH基本不变时,PH值见续表3.2:
续表3.2羧基化后反应体系pH值
样品
PH
GO-COOH-I
6.790
GO-COOH-II
6.660
GO-COOH-III
6.494
GO-COOH-IV
6.755
调至等浓度,测得zetapotential见表3.3:
(单位mV)
表3.3羧基化氧化石墨烯的Zeta电位
样品
Zeta
GO-COOH-I
-34.2
GO-COOH-II
-33.3
GO-COOH-III
-31.9
GO-COOH-IV
-28.6
表3.4羧基化氧化石墨烯的紫外可见吸收光谱最大吸收峰位置(单位:
nm)
样品
Peakvalue
GO-COOH-I
229
GO-COOH-II
229
GO-COOH-III
228
GO-COOH-IV
231
GO羧基化前后PH变化不大,故可推测NaOH不参与羧基化反应,只起到催化作用。
由于氯乙酸在水中能解离出H
,故混合液的PH与氯乙酸也有关。
由以上数据分析,GO-COOH-I和GO-COOH-IV的羧基化程度较高,NaOH的浓度也比其他两组高。
由此可知在PH值较大时,羧基化程度好。
但PH值不可过大,过大会引起GO的还原反应。
3.2.2红外光谱分析
分别取三组样品:
普通延长Hummers法中温反应时间制备的GO,以及其衍生物GO-COOH,GO-COOH-Gd作红外光谱分析,所得结果见图3.1所示:
图3.1GO、GO-COOH、Gd(Ⅲ)-GO-COOH的IR谱图
三组样品在波数3500附近同一位置有波峰,说明三组物质都含有-OH,可能是连在石墨烯上的羟基,也可能是羧基上的羟基。
GO中波数为1727处有一吸收峰,说明
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- 石墨 载体 磁共振 造影 构建