光学显微镜的构造和使用.docx
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光学显微镜的构造和使用
实验一普通光学显微镜的构造和使用
一、目的要求
1.掌握普通光学显微镜的基本构造、使用方法、保护要点。
2.掌握普通光学显微镜油浸系的原理。
3.使用油镜观察几种细菌的基本形态。
二、显微镜的基本构造
显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成(图1-1)。
光学显微镜的构造(图1-1)
1.物镜转换器2.接物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.彩虹光阑7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺旋12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋
1.机械装置
镜座(base)和镜臂(arm)镜座位于显微镜底部,呈马蹄形,它支持全镜。
镜臂有固定式和活动式两种,活动式的镜臂可改变角度。
镜臂支持镜筒。
镜筒(bodytube)是由金属制成的圆筒,上接目镜,下接转换器。
镜筒有单筒和双筒两种,单筒又可分为直立式和后倾式两种。
而双筒则都是倾斜式的,倾斜式镜筒倾斜45°。
双筒中的一个目镜有屈光度调节装置,以备在两眼视力不同的情况下调节使用。
转换器(nosepiece)为两个金属碟所合成的一个转盘,其上装3—4个物镜,可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。
载物台(stage)又称镜台,为方形或圆形的盘,用以载放被检物体,中心有一个通光孔。
在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹,用以固定标本;有的装有标本推动器,将标本固定后,能向前后左右推动。
有的推动器上还有刻度,能确定标本的位置,便于找到变换的视野。
调焦装置是调节物镜和标本间距离的机件,有粗动螺旋(coarseadjustment)即粗调节器和微动螺旋(fineadjustment)即细调节器,利用它们使镜筒或镜台上下移动,当物体在物镜和目镜焦点上时,则得到清晰的图像。
2.光学系统
物镜(objective)物镜安装在镜筒下端的转换器上,因接近被观察的物体,故又称接物镜。
其作用是将物体作第一次放大,是决定成像质量和分辨能力的重要部件。
物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。
如:
NA0.30;10×;160/0.17;16mm。
其中“NA0.30”表示数值孔径(numericalaperture,简写为NA),“10×”表示放大倍数,“160/0.17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度(mm),16mm表示焦距。
目镜(ocularlens)装于镜筒上端,由两块透镜组成。
镜把物镜造成的像再次放大,不增加分辨力,上面一般标有7×、10×、15×等放大倍数,可根据需要选用。
一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500—700倍,最大也不能超过1000倍的选择。
目镜的放大倍数过大,反而影响观察效果。
聚光器(condenser)光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本,增强照明度和造成适宜的光锥角度,提高物镜的分辨力。
聚光器由聚光镜和虹彩光圈(irisdiaphragm)组成,聚光镜由透镜组成,其数值孔径可大于1,当使用大于1的聚光镜时,需在聚光镜和载玻片之间加香柏油,否则只能达到1.0。
虹彩光圈由簿金属片组成,中心形成圆孔,推动把手可随意调整透进光的强弱。
调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小,可得到适当的光照和清晰的图像。
光源(lightsource)较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内,通过按钮开关来控制;老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜,反光镜是一个两面镜子,一面是平面,另一面是凹面。
在使用低倍和高倍镜观察时,用平面反光镜;使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。
滤光片(filter)可见光是各种颜色的光组成的,不同颜色的光线波长不同。
如只需某一波长的光线时,就要用滤光片。
选用适当的滤光片,可以提高分辨力,增加影像的反差和清晰度。
滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的,分别透过不同波长的可见光,可根据标本本身的颜色,在聚光器下加相应的滤光片。
三、油镜物镜的基本原理
微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜(16mm,10×)、高倍物镜(4mm,40—45×)和油镜(1.8mm,95—100×)三种。
油镜通常标有黑圈或红圈,也有的以“OI(oilimmer-sion)字样表示,它是三者中放大倍数最大的。
根据使用不同放大倍数的目镜,可使被检物体放大1000—2000多倍。
从图Ⅲ-3中可看出油镜的焦距和工作距离(标本在焦点上看得最清晰时,物镜与样品之间的距离)最短,光圈则开得最大,因此,在使用油镜观察时,镜头离标本十分近,需特别小心。
使用时,油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气,而是隔一层油质,称为油浸系。
这种油常选用香柏油,因香柏油的折射率n=1.52,与玻璃相同。
当光线通过载玻片后,可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。
如果玻片与物镜之间的介质为空气,则称为干燥系,当光线通过玻片后,受到折射发生散射现象,进入物镜的光线显然减少,这样就减低了视野的照明度(图1-2)。
(图1-1)
利用油镜不但能增加照明度,更主要的是能增加数值孔径,因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。
所谓数值孔径,即光线投射到物镜上的最大角度(称为镜口角)的一半正弦,乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积,可用下列公式表示:
NA=n·sinα
式中NA=数值孔径;n=介质折射率;α=最大入射角的半数,即镜口角的半数。
因此,光线投射到物镜的角度愈大,显微镜的效能就愈大(图Ⅲ-5),该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。
同时,α的理论限度为90°,sin90°=1,故以空气为介质时(n=1),数值孔径不能超过1,如以香柏油为介质时,则n增大,其数值孔径也随之增大。
如光线入射角为120°,其半数的正弦为sin60°=0.87,则:
以空气为介质时:
NA=1×0.87=0.87
以水为介质时:
NA=1.33×0.87=1.15
以香柏油为介质时:
NA=1.52×0.87=1.32
显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。
它与物镜的数值孔径成正比,与光波长度成反比。
因此,物镜的数值孔径愈大,光波波长越短,则显微镜的分辨力愈大,被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。
因此,一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离,这两个因素是成反比关系的,通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米,这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。
显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。
式中λ=光波波长。
我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm,假如数值孔径为0.65的高倍物镜,它能辨别两点之间的距离为0.42μm。
而在0.42μm以下的两点之间的距离就分辨不出,即使用倍数更大的目镜,使显微镜的总放大率增加,也仍然分辨不出。
只有改用数值孔径更大的物镜,增加其分辨力才行。
例如用数值孔径为1.25的油镜时,能辨别两点之间的
因此,我们可以看出,假如采用放大率为40倍的高倍物镜(NA=0.65),和放大率为24倍的目镜,虽然总放大率为960倍,但其分辨的最小距离只有0.42μm。
假如采用放大率为90倍的油镜(NA=1.25),和放大率为9倍的目镜,虽然总的放大率为810倍,但却能分辨出0.22μm间的距离。
四、器材
显微镜、香柏油、乙醇-乙醚混合液、擦镜纸、吸水纸等。
细菌三种形态的染色标本。
五、操作步骤
1.观察前的准备
(1)1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时,要用右手紧握镜臂,左手托住镜座,平稳地将显微镜搬运到实验桌上。
(2)将显微镜放在自己身体的左前方,离桌子边缘约10cm左右,右侧可放记录本或绘图纸。
(3)调节光照:
不带光源的显微镜,可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照,光线较强的天然光源宜用平面镜;光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜,但不能用直射阳光,直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。
将10×物镜转入光孔,将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置,用左眼观察目镜中视野的亮度,转动反光镜,使视野的光照达到最明亮最均匀为止。
自带光源的显微镜,可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。
凡检查染色标本时,光线应强;检查未染色标本时,光线不宜太强。
可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。
2.低倍镜观察
镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。
因为低倍镜视野较大,易于发现目标和确定检查的位置。
将标本片放置在载物台上,用标本夹夹住,移动推动器,使被观察的标本处在物镜正下方,转动粗调节旋钮,使物镜调至接近标本处,用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台,直至物像出现,再用细调节旋钮使物像清晰为止。
用推动器移动标本片,找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。
3.高倍镜观察
在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。
较好的显微镜,低倍、高倍镜头是同焦的,在转换物镜时要从侧面观察,避免镜头与玻片相撞。
然后从目镜观察,调节光照,使亮度适中,缓慢调节粗调节旋钮,慢慢下降载物台直至物像出现,再用细调节旋钮调至物像清晰为止,找到需观察的部位,并移至视野中央进行观察,并准备用油镜观察。
4.油镜观察
(1)用粗调节器将镜筒提起约2cm,将油镜转至正下方。
(2)在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
(3)从侧面注视,用粗调节器将镜筒小心地降下,使油镜浸在香柏油中,其镜头几乎与标本相接,应特别注意不能压在标本上,更不可用力过猛,否则不仅压碎玻片,也会损坏镜头。
(4)从接目镜内观察,进一步调节光线,使光线明亮,再用粗调节器将镜筒徐徐上升,直至视野出现物像为止,然后用细调节器校正焦距。
如油镜已离开油面而仍未见物像,必须再从侧面观察,将油镜降下,重复操作至物像看清为止。
5.观察完后复原
下降载物台,将油镜头转出,先用擦镜纸擦去镜头上的油,再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合液擦去镜头上残留油迹,最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可,(注意向一个方向擦拭)。
将各部分还原,转动物镜转换器,使物镜头不与载物台通光孔相对,而是成八字形位置,再将载物台下降至最低,降下聚光器,反光镜与聚光器垂直,最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分,然后将显微镜放回柜内或镜箱中。
六、注意事项
1.学生使用显微镜固定镜号、位置,填写使用卡,本学期一直使用本台显微镜。
2.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏
3.镜面只能用擦镜纸擦,不能用手指或粗布,以保证光洁度。
4.观察标本时,必须依次用低、高倍镜,最后用油镜。
当目视接目镜时,特别在使用油镜时,切不可使用粗调节器,以免压碎玻片或损伤镜面。
5.观察时,两眼睁开,养成两眼能够轮换观察的习惯,以免眼睛疲劳,并且能够在左眼观察时,右眼注视绘图。
6.拿显微镜时,一定要右手拿镜臂,左手托镜座,不可单手拿,更不可倾斜拿。
七、实验报告
1.油镜与普通物镜在使用方法上有何不同?
应特别注意些什么?
2.使用油镜时,为什么必须用香柏油?
3.镜检标本时,为什么先用低倍镜观察,而不是直接用高倍镜或油镜观察?
4.绘出细菌的几种基本形态。
实验二放线菌形态及菌落特征的观察
一、目的要求
掌握观察放线菌形态的基本方法,并观察放线菌的形态特征。
二、基本原理
和细菌的单染色一样,放线菌也可用石炭酸复红或碱性美蓝等染料着色后,在显微镜下观察其形态。
放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线菌分类的重要依据,为了不打乱孢子的排列情况,常用印片染色法和胶带纸粘菌染色法进行制片观察。
放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。
菌丝体分为两部分,即潜入培养基中的营养菌丝(或称基内菌丝)和生长在培养基表面的气生菌丝。
有些气生菌丝分化成各种孢子丝,呈螺旋形、波浪形或分枝状等。
孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。
气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。
三、器材
1.活材料:
放线菌培养物,酵母菌斜面培养物;
2.染色液:
复红染色液(或结晶紫,美兰);
3.器材:
载玻片,胶带纸,小刀,接种环,吸水纸,擦镜纸,酒精灯,香柏油,乙醚-乙醇混合液,显微镜。
四、操作步骤
1.印片法:
放线菌自然生长状态的观察
印片:
取干净载玻片一块,用小刀切取放线菌培养体一块,放在载玻片上,用另一块载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻按压,然后将载玻片垂直拿起。
注意不要使培养体在玻片上滑动,否则会打乱孢子丝的自然形态;
微热固定:
将印有放线菌的涂面朝上,通过酒精灯火焰2-3次加热固定;
染色:
石炭酸复红染色1min;
水洗:
水洗后晾干;
镜检:
先用低倍镜后用高倍镜,最后用油镜观察孢子丝、孢子的形态及孢子排列情况。
2.胶带纸法
粘菌:
用胶带纸在放线菌培养体上粘取菌体,注意,压取时从菌落边顺着菌体生长方向,避免从菌落上面压取,以免取得的全是孢子。
染色:
将粘有菌体的胶带纸压在事先准备好的滴油染液的载玻片上。
将多余染色液用滤纸吸掉。
镜检:
同上。
五、实验报告
绘图说明你所观察到的放线菌的形态特征。
实验三酵母菌形态及菌落特征的观察
一、目的要求
1.观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。
2.观察酵母菌的菌落特征。
3.学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法。
二、基本原理
酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物,细胞核与细胞质已有明显的分化,菌体比细菌大。
繁殖方式也较复杂,无性繁殖主要是出芽生殖,仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖;有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。
本实验通过用美蓝染色制成水浸片,和水-碘水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性染料,它的氧化型是蓝色的,而还原型是无色的,用它来对酵母的活细胞进行染色,由于细胞中新陈代谢的作用,使细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型,所以酵母的活细胞无色,而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞,则因它们无此还原能力或还原能力极弱,而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
因此,用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态,还可以区分死、活细胞。
但美蓝的浓度、作用时间等均有影响,应加注意。
三、器材
1.活材料:
酿酒酵母(Saccharomycescalsbergensis)2-3d培养物;
2.染液:
吕氏碱性美蓝染液
3.器材:
显微镜,载玻片,盖玻片等。
四、操作步骤
1.酵母菌落形态观察并记录。
2.美蓝浸片观察
(1)在载玻片中央加一滴碱性美蓝染液,液滴不可过多或过少,以免盖上盖玻片时,溢出或留有气泡。
然后按无菌操作法取斜面上培养2-3d的酿酒酵母少许,放在碱性美蓝染液中,使菌体与染液均匀混合。
(2)取盖玻片一块,小心地盖在液滴上。
盖片时应注意,不能将盖玻片平放下去,应先将盖玻片的一边与液滴接触,然后将整个盖玻片慢慢放下,这样可以避免产生气泡。
(3)将制好的水浸片放置3分钟后镜检。
先用低倍镜观察,然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况,同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。
2.水浸片观察
在载玻片中央滴一滴蒸馏水,取酿酒酵母少许,放在水-碘液滴中,使菌体与水混匀,盖上盖玻片后镜检。
可以适当将光圈缩小观察。
五、实验报告
绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
实验四霉菌形态及菌落特征的观察
一、目的要求
1.掌握观察霉菌形态的基本方法,并观察其形态特征。
2.掌握常用的霉菌制片方法
二、基本原理
霉菌菌丝较粗大,细胞易收缩变形,而且孢子很容易飞散,所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。
此染色液制成的霉菌标本片其特点是:
(a)细胞不变形;(b)具有杀菌防腐作用,且不易干燥,能保持较长时间;(c)溶液本身呈蓝色,有一定染色效果。
霉菌自然生长状态下的形态,常用载玻片观察,此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上,培养后用显微镜观察。
此外,为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。
此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性,将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上,然后将长菌的玻璃纸剪取一小片,贴放在载玻片上用显微镜观察。
三、器材
曲霉(Aspergillussp.),青霉(Penicilliumsp.),根霉(Rhizopussp.),毛霉(Mucorsp.);
乳酸石炭酸棉蓝染色液,20%甘油,查氏培养基平板,马铃薯培养基;无菌吸管,载玻片,盖玻片,U形棒,解剖刀,玻璃纸,滤纸等。
四、操作步骤
1.一般观察法
于洁净载玻片上,滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液,用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中,再细心地将菌丝挑散开,然后小心地盖上盖玻片,注意不要产生气泡。
置显微镜下先用低倍镜观察,必要时再换高倍镜。
2.载玻片观察法
(1)将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内,再放上U形玻棒,其上放一洁净的载玻片,然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端,盖上皿盖,把数套(根据需要而定)如此装置的培养皿叠起,包扎好,用1.05kg/cm2,121.3℃灭菌20分钟或干热灭菌,备用。
(2)将6—7ml灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倒入直径为9cm的灭菌平皿中,待凝固后,用无菌解剖刀切成0.5—1cm2的琼脂块,用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上,每片上放置2块。
(3)用灭菌的尖细接种针或装有柄的缝衣针,取(肉眼方能看见的)一点霉菌孢子,轻轻点在琼脂块的边缘上,用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上,再盖上皿盖。
(4)在培养皿的滤纸上,加无菌的20%甘油数毫升,至滤纸湿润即可停加。
将培养皿置28℃培养一定时间后,取出载玻片置显微镜下观察。
3.玻璃纸透析培养观察法
(1)向霉菌斜面试管中加入5ml无菌水,洗下孢子,制成孢子悬液。
(2)用无菌镊子将已灭菌的、直径与培养皿相同的圆形玻璃纸覆盖于查氏培养基平板上。
(3)用1ml无菌吸管吸取0.2ml孢子悬液于上述玻璃纸平板上,并用无菌玻璃刮棒涂抹均匀。
(4)置28℃温室培养48小时后,取出培养皿,打开皿盖,用镊子将玻璃纸与培养基分开,再用剪刀剪取一小片玻璃纸置载玻片上,用显微镜观察。
五、实验报告
1.结果
绘图说明你所观察到的霉菌形态特征。
2.思考题
(1)比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌形态上的异同。
(2)玻璃纸应怎样进行灭菌?
为什么?
实验五革兰氏染色法
一、目的要求
1、学习并初步掌握革兰氏染色法
2、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法(Gramstain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:
染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液:
碱性染料(basicdye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decolorisingagent)和复染液(counterstain)。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystalviolet)。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘(iodine)是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。
复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,从而将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液是番红。
三、器材
1、菌种:
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
2、其他:
革兰氏染色液,载玻片,显微镜、盖玻片、吸水纸,接种针。
四、操作步骤
1.涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥、固定。
固定时通过火焰1—2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。
2.染色
(1)初染加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。
(2)媒染滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。
(3)脱色将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20—30秒钟,立即用水冲净酒精。
(4)复染用番红液染1—2分钟,水洗。
(5)镜检干燥后,置油镜观察。
革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。
(6)同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。
此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。
五、实验报告
1.结果:
在你所作的革兰氏染色制片中,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色?
它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌?
2.思考题
(1)你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?
其中最关键的环节是什么?
(2)为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
(3)如果你的涂片未经热固定,将会出现什么问题?
如果加热温度过高、时间太长,又会怎么样呢?
(4)革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚?
其染色成败的关键一步是什么?
(5)进行革兰氏染色时,为什么特别强调菌龄不能太老,用老龄细菌染色会出现什么问题?
(6)革兰氏染色时,初染前能加碘液吗?
乙醇脱色后复染之前,革兰氏阳性和革兰氏阴性菌分别是什么颜色?
(7)当你对一株未知菌进行革兰氏染色时,怎样能确证你的染色技术操作正确,结果可靠?
实验六微生物细胞大小的测定
一、目的要求
1.学会测微尺的使用和计算方法。
2.掌握酵母菌细胞大小测定的方法。
二、基本原理
微生物细胞大小,是微生物的形态特征之一,也是分类鉴定的依据之一。
由于菌体很小,只能在显微镜下测量。
用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片。
一般将1mm等分为100格(或2mm等分为200格),每格长度等于0.01mm(即106μm)。
是专用于校正目镜测微尺每格长度的。
目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片,其中央刻有精确的刻度,有等分50小格或100小格两种,每5小格间有一长线相隔。
由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同,目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同,因此,目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小,在使用前必须用镜台测微尺进行校正,以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值,然后才可用来测量微生物的大小。
三、器材
枯草芽孢杆菌染色玻片标本,目镜测微尺,镜台测微尺,显微镜,擦镜纸,香柏油等。
四、操作步骤
1.目镜测微尺
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- 光学 显微镜 构造 使用