中药学本科毕业论文柿叶提取物中6种黄酮类成分的HPLC法含量测定研究.docx
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中药学本科毕业论文柿叶提取物中6种黄酮类成分的HPLC法含量测定研究
本科毕业论文
柿叶提取物中6种黄酮类成分的HPLC法含
量测定研究
二级学院中药学院
专业中药学(中药分析鉴定方向)
班级
学生姓名
学号
指导教师
I-II
摘要
1前言1
2材料与仪器3
1.1仪器与设备3
2.2试剂与试药3
3方法与结果4
3.1色谱条件4
3.2混合对照品溶液的制备4
3.3供试品溶液的制备4
3.4系统适用性考察5
14
15
17
29
31
4讨论13
4.1高效液相色谱检测条件的选择分析13
4.2供试品溶液制备方法选择135结论.・参考文献综述....致谢....附录.…
柿叶提取物中6种黄酮类成分的HPLC法含量测定研究
摘要:
目的应用HPLC法同时测定柿叶提取物中金丝桃昔、异棚皮背、棚皮背、棚皮素、山奈酚、杨梅素等6种黄酮类成分的含量;方法采用HPLC法,Agilent氏lipsePlusG8(250mnix4.6mm,5Nm)色谱柱,以乙月青和0.1%磷酸水溶液流动相梯度洗脱,体积流量为l.Oml/min,柱温为30℃,检测波长为36。
nm,进样量为10包结果金丝桃昔在0.0077〜0.6142卜唱(长二0.9992),异柳皮昔在0.0078〜0.6182卜唱(k=0.9995),棚皮背在0.0077〜0.6415卜唱(解=0.9996),棚皮素0.0082~0.6549ng(R2=0.9993),山泰酚0.0401〜0.6418pg(R2=0.9987),杨梅素0.0083〜0.6669卜喳(改=0.9997)范围内线性关系良好,平均回收率分别为99.90%(RSD=4.53%),100.26%(RSD=3.59%),99.98%(RSD=4.79),99.89%(RSD=4.19%),100.22%(RSD=4.88%),100.65%(RSD=4.78%);结论该法操作简便,结果准确,重现性好,为柿叶提取物及其相关产品质量控制和标准提供参考。
关键词:
柿叶提取物:
高效液相色谱;黄酮类成分
StudyonthedeterminationmethodofHPLCcontentof6
flavonoidsfrompersimmonleavesextract
Abstract:
ObjectiveSimultaneouscontentdeterminationofsixkindsofflavonoidsfrompersimmonleavesextractbyHPLC,includinghyperoside,isoquercitrin,quercetin-3-rhanmoside,myricetin,quercetin,kaempferol.MethodsThecontentsofhyperoside,isoquercitrin,quercetin-3-rhamnoside,myricetin,quercetinandkaempferolweresimultaneouslydeterminedbyanHPLCsystemwithAgilentEclipsePlusCis(250mmx4.6mm,5Hm),acetonitrileasmobilephaseAand0.2%phosphoricacidasmobilephaseB.ThesamplesweregradientlyelutedattheratiosofphaseAas7〜25%in0〜40minutesand25〜50%after40minutes.Theflowratewas1ml/min.Thedetectionwavelengthwassetat360nm.Thecolumntemperatureiscontrolledat30℃.ResultsThereweregoodlinearityform0.0077-0.6142pg(R2=0.9992),0.0078-0.6182|.ig(R2=0.9995),0.0077-0.6415pg(R2=0.9996),0.0083-0.6669pg(R2=0.9993),0.0082-0.6549|.ig(R2=0.99987)and0.0401-0.6418|.ig(R2=0.9997)inseparationofhyperoside,isoquercitrin,quercetin-3-rhamnoside,myricetin,quercetinandkaempferol.Therecoveriesseparatelywere99.90%(RSD=4.53%),100.26%(RSD=3.59%),99.98%(RSD=4.79),99.89%(RSD=4.19%),100.22%(RSD=4.88%),100.65%(RSD=4.78%).ConclutionTheHPLCmethodissimple,accurate,highlyselectiveandreproducible.Itcanbeusedforthequalitycontrolandstandardofpersimmonleafextractanditsrelatedproducts.
Keywords:
Persimmonleafextract,HPLC,flavonoids.
1前言
近现代科学研究发现,高血糖血脂症及血液高度凝集状态会导致冠心病、心绞痛、中风、心梗等多种心脑血管疾病的发生,心脑血管疾病具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、并发症多的特点,截至今年统计得,心脑血管致死占我国每年总死亡病因的51%,我国已有超过2.7亿人在心脑血管系统方面患病,每年大约有300万人死于心脑血管疾病,并且随着人们生活水平质量的提高,现代人们的日常饮食更多的偏向于高脂肪、高热量食品,以至于摄入体内的热量过多,转化为脂肪而使血脂血糖含量升高,因此现代人们心脑血管疾病的发病率逐年增加,并且有向年轻化发展的趋势。
心脑血管疾病的病因主要有4个方面:
①血流动力学改变所引起的血压异常症状、心血管功能障碍等;②血液粘稠度增高所造成的高血脂血糖症、高蛋白血症、红细胞和血小板(PLT)增多症、血癌、骨髓瘤等;③血管壁病变所导致的AS、先天性血管性异常、动脉炎等;④凝血机制异常,因PLT减少引发的紫瘢、血友病、抗凝剂的使用、弥散性血管内凝血(DIC)等。
临床研究发现,西药治疗心脑血管疾病,虽然有着疗效好、见效快速的优点,但因为心脑血管疾病的患者多为老人,他们因衰老而导致心脑血管系统整体机能下降,对药物的代谢能力较缓慢,所以西药治疗带来副作用会比较大,因此,治疗心脑血管疾病的天然药物成为药物研究热点之一⑴。
我国较多地区都种植有柿树,拥有极为丰富柿叶资源,且属于廉价低毒的天然药物之一。
柿叶能软化血管,从生理上调整血压,且具有双向调节作用,降低血脂血糖⑵,防止脑动脉硬化、冠心病等⑶,柿叶还能改善机体对疾病的抵抗力,增强免疫功能,促进机体生成IFN,对病毒感染和肿瘤都有较好的治疗效果,除此之外,柿叶还具有利水通便、定惊安神、降脂减肥、美容退斑、消暑解渴等功用。
实验研究表明,柿叶黄酮有保护心脑血管系统、抗氧化及衰老、增强免疫调节、保肝、抗菌抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性凹,且柿叶黄酮具有易于工业化提取制备、资源丰富、毒性低等的优势,因此医学界对柿叶黄酮的研究也越来越深入。
柿叶中含有多种生理活性成分和极其丰富的营养物质,其提取物中含有黄酮类化合物一一以金丝桃昔、黄芭甘、杨梅素皮贰、棚皮素、山奈酚等为代表;有机酸一一以白种脂酸、糠酸、琥硝酸、原儿茶酸等为代表;还有多糖、挥发油、鞍质及香豆素类等多种活性成分,而黄酮类成分中以山奈酚和椭皮素以及它们的单糖昔和双糖甘为主,具有降血糖血脂、清热解毒、抗菌消炎、润肺强心、生津止渴、镇咳止血等多种功效。
柿叶提取物中黄酮类化合物是其主要药效活性成分,以黄茂甘、芦丁、紫云英音、金丝桃昔、异柳皮甘、榔皮素、杨梅素、山奈酚等为主⑸。
以柿叶提取物制备而成的脑心清片在临床上用于治疗冠心病、脑动脉硬化症患者所出现的脉络瘀阻,眩晕头痛,胸中憋闷,肢体麻木,心悸气短,胸痹心痛等证候向。
2015年版《中国药典》中柿叶提取物有效成分的质量分析方法主要是通过酸水解法测定总黄酮的含量(并规定其含有的总黄酮以棚皮素和山奈素的总量计算不得少于8.6%)⑺,以达到质量控制的目的,但该分析方法需要经水解回流提取,操作较繁琐且时间较长,除此之外,柿叶提取物中的黄酮类结构中除黄酮首元类物质(椭皮素、山奈酚和杨梅素)外还有其他黄酮甘类化合物的存在,如金丝桃甘、异棚皮背、棚皮昔等,以柿叶提取物为主要成分的治疗脑血管疾病的产品中也并不单单含有棚皮素和山奈酚,除柳皮素和山奈酚外还有其他黄酮类成分也是治疗脑血管疾病的主要药效活性成分,因此药典所示方法并不能真实准确地反映柿叶中黄酮类活性成分的量。
目前已知的研究柿叶黄酮类成分的方法主要是对经过酸水解后回流得到的总黄酮或经加热回流的方法得到几种黄酮类物质的检测方法及含量分析进行探讨,如江维克等采用HPLC法测定脑心清片中棚皮素的含量⑻:
梁敬仪等采用HPLC法测定脑心清片中山泰酚、榔皮素的含量191;贝伟剑等采用HPLC法测定了脑心清浸膏中金丝桃甘的含量”叫王莲等采用比色法测定了柿叶中总黄酮的含量【山;张梦雨等采用高效液相色谱-质谱联用法同时测定脑心清原料药浸膏及其片剂中的8种有效成分[皿;安淼等同时测定6种柿叶黄酮类物质方法的建立【山。
上述研究中关于柿叶提取物黄酮类成分多经过酸水解后才进行含量测定。
因此,本课题实验在制备柿叶提取物供试品时采用甲醇超声(功率100W,频率45kHz)30min后,直接用微孔滤膜过滤得供试品溶液的方法(而药典的酸水解法则要用甲醇超声30min后,加入25%盐酸进行加热回流30min,再用微孔滤膜过滤的供试品溶液),以金丝桃昔、异棚皮背、椭皮甘、杨梅素为黄酮甘类代表性化合物,再加上黄酮甘元化合物棚皮素、山奈酚,建立这6种黄酮类物质的液相色谱检测方法同时对它们进行含量测定,以期为柿叶提取物的质量控制提供更为全面、科学的依据,为提高和完善柿叶提取物的质量控制标准提供实验基础及理论依据。
2材料与仪器
2.1仪器与设备
戴安U3000液相色谱仪岛津企业管理(中国)有限公司
色谱柱Agilent氏lips。
PlusC18(250minx4.6mm,5pm)
3方法
3.1色谱条件
仪器:
戴安U3000液相色谱仪(四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器、DAD检测器、Chromeleon色谱工作站);
1色谱柱:
Agilent氏lipsePlusC18(250mmx4.6111111,5pm)
2流动相:
乙月青和0.1%磷酸水溶液,采用梯度洗脱:
(乙月青:
0-40min,7%-25%;40-60min,25%-50%;)
③流速:
LOmL/min;
④检测波长:
360nm;
⑤柱温:
30℃;
⑥进样量:
101山。
3.2混合对照品溶液的制备
用十万分之一天平精密称取金丝桃昔对照品lO.lmg,异棚皮昔对照品10.4mg,棚皮昔对照品10.6mg,杨梅素对照品10.6mg,椭皮素对照品10.3mg,山奈酚对照品10.5mg,将以上各对照品分别置于25mL容量瓶中,加入甲醇,定容至刻度线,密塞,摇匀,制成浓度分别为0.3842、0.3864、0.3841、0.4168、0.4093、0.401Img/mL的对照品储备液,在容量瓶上标记好对应的浓度。
用移液管分别精密移取上述各对照品储备液8mL于50mL容量瓶、移取各对照品储备液4mL于50mL容量瓶、移取各对照品储备液2mL于50mL容量瓶、移取各对照品储备液1mL于50mL容量瓶,用移液枪分别精密移取各对照品储备液0.5mL于50mL容量瓶、移取各对照品储备液0.1mL于50mL容量瓶,分别加甲醇稀释至刻度线,摇匀,制得系列混合对照品溶液,分别编号为标准溶液VI、V、IV、山、0、I。
3.3供试品溶液的制备
称取柿叶干膏粉约0.1g,精密称定(万分之一天平),置50mL具塞锥形瓶中,用移液管精密加入20mL中醇,密塞后称定重量,将密塞锥形瓶放入超声波清洗器超声处理
30min(功率100W,频率45kHz)后,取出,待溶液冷却至室温,再进行称重,用甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.45卜im的微孔滤膜过滤,取续滤液,即得柿叶干膏粉供试品溶液。
3.4系统适用性考察
3.4.1检测波长的选择
实验中用到的戴安U3000高效液相色谱仪所用的检测器为紫外检测器(DVD检测器),所以高效液相中波长的选择和紫外波长的选择一致,都是选择最大吸收波长作为检测波长,这样才能保证检测分析方法的灵敏度和响应值最高。
在进行检测波长的选择时发现,紫外全波长扫描结果显示,金丝桃昔、异柳皮昔、柳皮昔、杨梅素、掘皮素、山奈酚在257nm和360nm处均有较高的吸收峰。
但在试验中发现以上6种黄酮类成分在257nm处得到的吸收峰峰型受溶剂峰的干扰而变宽,分离度也略有减小,而在360nm处各标准品则可得到较好的图谱,并且实验中所用到的溶剂(甲醇、乙懵等)截止波长均在257nm以下,因此,选择360nm作为检测波长。
3.4.2流动相缓冲盐溶液PH的选择
流动相中加入一定量的酸可改善待测组分色谱峰的峰形。
试验中比较了不同酸度的流动相:
纯水-乙懵,0.1%磷酸水溶液-乙月青和0.2%磷酸水溶液-乙睹对各组分峰的影响。
实验结果发现,这几种流动相对于上述6种黄酮类成分的分离效果存在较大差异,当流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腾时,各组分峰形良好,且能提高分离效率,同时可以避免流动相酸性过强对仪器及色谱柱造成损害,因此最终选用乙懵-0.1%磷酸水溶液作为流动相。
3.4.3柱温的选择
一般来说,随着柱温的升高,理论塔板数增加,分离度提高,同时出峰速度增大,保留时间也就提前,柱压也略有下降。
实验中比较了20C、25℃、30℃、35℃、40℃几种柱温条件下各组分峰的分离效果和保留时间,最终选择30C柱温。
因考虑到色谱柱的承受范围以及较高温度时棚皮素和山奈酚的含量会有所变化,在能保证样品出峰峰型较好的前提下,选择30C的柱温能够较快的缩短总体保留时间。
3.4.4体积流量的选择
实际操作中,体积流量是一个调整分离度和出峰时间的重要参数。
实验比较0.8、1.0、1.2mL/min不同体积流量,根据峰型及分离效果确定最佳体积流量。
结果发现,随着体积流量的增加,样品分离度也增加,出峰时间随之缩短。
然而在上述条件下,体积流量超过1.0mL/min时,色谱柱压力过大,会对色谱柱造成损害,减少色谱柱的使用寿命,因此不考虑更大体积流量。
故最终选择LOmL/min作为该方法的流量体积。
3.4.5线性关系考察
3.4.6
吸取系列混合对照品溶液各10卜山,在“3.1”项下色谱条件下测定,记录相应的峰面积,并以峰面积为纵坐标(Y),进样量为横坐标(X)进行线性回归,得到6个成分(金丝桃甘、异棚皮甘、榔皮甘、杨梅素、棚皮素和山奈酚)的线性回归曲线,如错误!
未找到引用源。
-图5棚皮素线性回归曲线图6所示。
图5翻皮素线性回归曲线图6山奈酚线性回归曲线
根据线性回归方程判断其在范围内与峰面积是否呈线性。
结果如错误!
未找到引用源。
所示:
表1柿叶提取物线性关系考察结果
名称
回归方程
相关系数
线性范围(pg)
金丝桃昔
y=307.85X-0.0639
R2=0.9992
0.0077-0.6142
异棚皮背
y=247.36x+0.0057
R2=0.9995
0.0078-0.6182
棚皮背
y=237.32X+0.0706
R2=0.9996
0.0077-0.6415
杨梅素
y=454.46x-1.235
R2=0.9993
0.0401-0.6418
棚皮素
y=379.1Ix+0.2669
R2=0.9987
0.0082-0.6549
山奈酚
y=569.41x-0.1249
R2=0.9997
0.0083-0.6669
由上表结果,得金丝桃昔的回归方程:
y=3O7.85x-0.0639,R2=0.9992,表明金丝桃昔在0.0077〜0.6142卜唱之间与峰面积线性关系良好;异棚皮昔的回归方程:
y=247.36X+0.0057,改=0.9995,表明异棚皮昔在0.0078〜0.6182卜唱之间与峰面积线性关系良好;柳皮昔的回归方程:
y=237.32x+0.0706,R2=0.9996,表明棚皮背在0.0077〜0.64151暄之间与峰面积线性关系良好;杨梅素的线性回归方程:
y=454.46x-1.235,R2=0.9993,表明杨梅素在0.0083〜0.666%喧之间与峰面积线性关系良好;棚皮素的回归方程:
y=379.11X+0.2669,R2=0,9987,表明榔皮素在0.0082〜0.6549卜唱之间与峰面积线性关系良好;山奈素的回归方程:
y=569.41x-0.1249,R2=0.9997,表明山奈素0.0401〜0.6418之间与峰面积线性关系良好。
3.4.7重复性试验
取柿叶干膏粉(批号K17P009),按照“3.1”项下色谱方法平行制备6份供试品溶液,进样测定,记录数据并计算金丝桃甘、异棚皮背、棚皮背、杨梅素、糊皮素和山泰酚峰面积的RSD值。
结果如错误!
未找到引用源。
错误!
未找到引用源。
所示:
表2柿叶提取物重复性试验结果
名称
1
2
3
4
5
6
平均峰面积mAU*min
峰而积
RSD(%)
金丝桃昔
11.12
10.83
10.79
10.58
11.03
11.18
10.92
2.09
异棚皮背
17.05
16.83
16.68
16.71
17.49
17.28
17.01
1.93
搬皮昔
17.26
16.83
16.76
16.63
17.53
17.42
17.07
2.22
杨梅素
0.74
0.68
0.67
0.69
0.70
0.72
0.70
3.73
解皮素
9.34
8.74
9.04
8.98
9.59
9.45
9.19
3.51
山奈酚
11.74
11.29
11.74
11.68
12.05
11.96
11.74
2.25
山上表数据得知,棚皮素峰面积RSD值为3.51%,榔皮首峰面积RSD值为2.22%,金丝桃首峰面积RSD值为2.09%,异柳皮首峰面积RSD值为1.93%,杨梅素峰面积RSD值为3.73%,山奈酚的峰面积RSD值为2.25%,表明分析方法重复性良好。
3.4.8精密度考察
精密吸取混合对照品溶液V10pL,按“3.1”项下的色谱条件连续进样6次,记录各组分的峰面积。
记录数据并计算金丝桃甘、异棚皮背、棚皮背、杨梅素、棚皮素和山奈酚峰面积的RSD值。
结果如错误!
未找到引用源。
所示:
表3仪器精密度考察结果
名称
1
2
34
5
6
平均峰而积mAU*min
峰而积
RSD(%)
金丝桃昔
9.80
9.76
9.65
9.72
9.87
9.81
9.77
0.79
异榔皮昔
7.57
7.54
7.49
7.52
7.61
7.64
7.56
0.75
斛皮普
7.75
7.68
7.65
7.71
7.68
7.76
7.71
0.56
杨梅素
14.69
14.64
14.73
14.67
14.71
14.63
14.68
0.27
榔皮素
12.71
12.67
12.70
12.74
12.69
12.75
12.71
0.24
山奈酚
18.07
18.02
18.11
18.09
18.05
18.10
18.07
0.19
由上表数据得知,山奈酚的峰面积RSD值为0.19%,杨梅素峰面积RSD值为0.27%,金丝桃昔峰面积RSD值为0.79%,棚皮昔峰面积RSD值为0.56%,异棚皮背峰面积RSD值为0.75%,榔皮素峰面积RSD值为0.24%,根据样品中待测定成分含量和精密度RSD可接受范围可得出结论:
该仪器的精密度良好。
3.4.9稳定性考察
精密取“3.3”项下色谱方法制备的供试品溶液(K17P009),密闭,放置于室温下,分别在0、2、4、8、12、24h间隔下进样检测,记录峰面积。
分别计算金丝桃昔、异棚皮昔、柳皮昔、杨梅素、柳皮素和山奈酚峰面积的RSD。
结果如表4所示:
表4柿叶提取物稳定性考察结果
名称
Oh
2h
4h
8h
12h
24h
平均峰面枳(mAU*min)
峰而积
RSD(%)
金丝桃昔
10.41
10.66
10.72
10.39
10.84
10.51
10.59
1.71
异棚皮甘
17.06
17.57
17.78
17.53
17.12
17.23
17.38
1.86
榔皮昔
16.41
16.27
16.39
16.40
16.34
16.23
16.34
1.18
杨梅素
0.67
0.65
0.63
0.68
0.67
0.64
0.66
2.99
榭皮素
8.47
8.57
8.58
8.61
8.53
8.60
8.56
0.61
山奈酚
10.76
10.75
10.56
10.83
10.90
10.91
10.79
1.20
由上表数据得知,棚皮背峰面积RSD值为1.18%,棚皮素峰面积RSD值为0.61%,金丝桃昔峰面积RSD值为1.71%,杨梅素峰面积RSD值为2.99%,异棚皮背峰面积RSD值为1.86%,山奈酚的峰面积RSD值为1.20%,说明以上6种物质在24h内的稳定性良好。
3.4.10加样回收率试验
1.混合对照品溶液的制备
分别精密量取异棚皮昔对照品储备液18mL、金丝桃背对照品储备液8mL、棚皮背对照品储备液16mL、棚皮素对照品储备液4.5mL、山奈酚对照品储备液5mL、杨梅素对照品储备液0.5mL,至100mL容量瓶中,加中醇定容至刻度,摇匀,用0.45叩1的微孔滤膜过滤,取续滤液,即得混合对照品溶液VII。
2.供试品溶液的制备
取已知含量的供试品干膏粉样品约0.2g(批号为K17P009),精密称定,加中醇40mL,
称重,超声处理(功率100W,频率45kHz)30min,甲醇补重,过滤,取10mL续滤液于50m
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