精现代中药分析实验讲义.docx
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精现代中药分析实验讲义
《现代中药分析》实验讲义
中药学院分析化学教研室编
X年4月5日
所属课程
现代中药分析核心课程
学时
36
适用专业
中药学1004中药制药1005
课程英文名称
AnalysisofChineseMedicinalPreparationExperiment
一、实验课程简介
《中药制剂分析》是一门以中医药理论为指导,运用现代分析理论和方法研究
中药制剂质量的综合应用性学科,是中药专业的核心主干课程之一。
二、实验课程目标
通过实验,加深对中药制剂分析基本理论、基本知识的理解,正确、熟练地掌握中药制剂分析常用的法定方法及规范化的操作技能。
《现代中药分析实验》是《化学分析》、《仪器分析》、《中药学》、《方剂学》、《中药炮制》、《中药鉴定学》、《中药化学》和《中药制剂学》等相结合的一门具有很
强实践性和综合性的应用科学。
本课程实践教学既注重基本技能训练、又加强创新能
力的培养。
在实践教学内容的安排上,既有验证性实验,让学生掌握药物分析的一般方法与技术特点;又有综合性试验,使学生将理论知识和具体的药物分析测定技术融会贯通,掌握解决实际药物分析技术问题的方法;还包括设计性试验,培养学生的
研究创新能力。
验证性、综合性和设计性试验分步骤逐步实施,使学生的理论和实验技能得到不断的进步。
三、实验项目
(一)实验项目一:
加味香连丸的TLC鉴别
1、实验项目学时:
6学时
2、实验项目类型:
验证性、综合性实验。
3、实验项目内容:
1.加味香连丸中黄连总碱的提取;黄连药味的薄层鉴别。
2.加味香连丸中挥发油的提取;药味的薄层鉴别。
4、
实验项目学习要求:
(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)
(1)运用知识:
中药材及其复方制剂的TLC鉴别、中药有效部位的提取、对照液、供
试液制备。
TLC基本操作技能练习。
(2)提高能力:
掌握中药提取、净化操作;5种TLC溶液配制操作;TLC规范操作;
鉴别中药真伪操作技能。
提高TLC法鉴别中药的能力及有效部位提取能力。
5、主要仪器设备与材料:
千分之一天平、恒温水浴锅、层析缸、三用紫外分析仪、喷雾瓶、吹风机、加
味香连丸、盐酸小檗碱对照品、黄连及木香对照药材,95%乙醇(AR)。
6、与理论课程的关系:
本实验是在第二章鉴别基础知识教学基础上的实验教学。
是中药鉴别主要方法的直接应用。
是中国药典的最主要方法。
7、实验步骤
1)取本品60mg,研细,加乙醇5ml,置水浴中加热回流
15分钟,滤过,滤液补加乙醇使成
5ml,作为供试品溶液。
另取黄连对照药材
50mg,同法制成对照药材溶液。
再取盐酸小檗碱
对照品,加乙醇制成每
1ml含0.04mg的溶液。
照薄层色谱法试验,吸取上述三种溶液各
2
微升,分别点于同一硅胶
G薄层板上,以乙酸乙酯:
氯仿:
甲醇:
氨水:
二乙胺(
8:
2:
2:
1:
0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(
365nm)下检视。
供试品色谱中,在
与对照药材色谱相应的位置上,显相同的黄色荧光斑点;在与对照品色谱相应的位置上,显
相同
的一个黄色荧光斑点。
2)取本品
0.5g,研细,加乙醚
5ml,放置2小时,时时振摇,滤过,滤液挥去乙醚,残渣
加醋酸乙酯
0.5ml使溶解,作为供试品溶液。
另取木香对照药材
0.2g,加乙醚5ml,同法制
成对照药材溶液,照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各
2微升,分别点于同一硅胶
G
薄层板上,以环己烷:
丙酮(
10:
3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以
5%香草醛硫酸溶
液,在105℃烘约5分钟。
供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的紫红
色至蓝紫色斑点。
8、数据处理:
给出鉴定结论
如实记录,画出薄层板(黄连及木香)
9、思考题:
1)定性鉴别需配置哪几种溶液?
为什么?
2)定性鉴别对量有哪些要求?
(二)实验项目二:
紫外分光光度法测定加味香连丸中黄连生物碱的含量
1、实验项目学时:
6学时
2、实验项目类型:
验证性、综合性实验。
3、实验项目内容:
1.利用氧化铝色谱柱净化加味香连丸中黄连生物碱
2.利用紫外紫外分光光度法测定黄连总生物碱含量
4、实验项目学习要求:
(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)
(1)运用知识:
掌握用柱层析净化提取物的方法;掌握紫外分光光度法测定复方中某一类
物
质的方法。
(2)提高能力:
掌握中药提取、净化操作;
UV-VIS规范操作;提高
UV-VIS
法测定中药成
分含量的能力。
5、主要仪器设备与材料:
1.紫外-可见分光光度计
3.中性Al2O3(150—200目)
2.小层析柱:
高13cm,内径
4.样品:
加味香连丸
8mm,2个
5.对照品:
盐酸小檗碱
6、与理论课程的关系:
本实验是在第四单元含量测定基础知识教学基础上的实验教学。
是
UV-VIS法测定中药成分含量方法的直接应用。
是中国药典的主要方法。
7、实验步骤
1)含量测定:
A、样品溶液配制:
取加味香连丸
0.5g,研成细粉,精密称取
0.1g(实验中称取多少写多少
),置60ml索氏提取
器中加95%乙醇40ml连续回流提取生物碱
至无色。
将提取液浓缩至
20ml,定量转移到25ml
容量瓶中,用
95%乙醇至刻度.
精密吸取样品液
1.0ml通过Al
2
O柱,用95%EtOH至洗脱完全,收集洗脱液于10ml容量瓶中,
3
连续加95%乙醇至刻度,于λmax350nm处测定吸收度。
B、对照品溶液配制
用95%乙醇溶液,配制对照品溶液浓度为
0.006mg/ml。
C、含量测定
应用外标一点法测定加味香连丸中总生物碱的含量。
8、数据处理
计算出100g加味香连丸中含有盐酸小檗碱多少克?
9、思考题
1)如何判断生物碱已被提取完全?
2)以测定小檗碱为例,除此方法外还有什么测定复方中黄连生物碱的方法?
3)本实验中测定样品紫外吸收度时,以什么作为空白对照液?
为什么?
(三)实验项目三:
复方丹参滴丸中龙脑的含量测定
1、实验项目学时:
6学时
2、实验项目类型:
验证性、综合性实验。
3、实验项目内容:
1.色谱条件的选择;
2.实验用溶液的配制,包括内标溶液、对照溶液及样品溶液的配制;
3.利用内标法测定复方丹参滴丸中龙脑的含量。
4、实验项目学习要求:
(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)
(1)运用知识:
掌握气相色谱法测定中药制剂中成分含量的方法和原理;熟悉气相色谱仪进
行含量测定的操作过程。
熟悉气相色谱仪各种操作条件的选择应用。
(2)提高能力:
GC的基本操作、仪器条件确定;提高运用GC进行药物含量测定的能力。
5、主要仪器设备与材料:
.1安捷伦-6820气相色谱仪(FID检测器)、微量进样器;
.2SPB-5毛细管色谱柱(弱极性)
.3水杨酸甲酯(内标)、醋酸乙酯(AR)
4.龙脑对照品(中国药品生物制品检定所)
.5复方丹参滴丸(天士力有限公司生产)。
6、与理论课程的关系:
本实验是在第四单元有关气相色谱法教学基础上的实验教学。
是中药
含量测定重要方法的直接应用。
是中国药典的主要方法。
7、操作步骤
1.色谱条件
采用SPB-5毛细管色谱柱(弱极性),柱长30m,内径0.32mm,液膜厚度0.25μm,分流进样1μL(分流比1:
20);柱温:
初始温度100℃,保持1min,以8℃/min升至180℃,保
持1min;后进样口温度为220℃;前检测器温度为300℃;载气为
2
左右;
N,柱前压100kPa
2
50kPa;FID检测器。
理论塔板数按龙脑峰计算不低于十万;
S
;对称
H50kPa;空气
R>1.5
性因子T=0.95。
2.校正因子测定
内标溶液配制
取水杨酸甲酯
125mg,置25mL量瓶中,加醋酸乙酯至刻度,制成每
lmL含
5mg的内标溶液。
对照溶液配制
取龙脑对照品
5mg,精密称定,置10mL量瓶中,加内标溶液至刻度,摇匀,
作为龙脑对照溶液。
测定校正因子
取龙脑对照液
1μL注入气相色谱仪,测定至少
5次,计算校正因子。
3.测定法
取合成冰片5mg,精密称定,置10mL量瓶中,加入内标溶液使冰片溶解并稀释至刻度,摇
匀,吸取2μL,注入气相色谱仪,测定。
按内标法计算含量。
8、注意事项
1.实验前,必须对气相色谱仪整个气路系统进行检漏。
如有漏气,及时处理。
2.开机前先通气,实验结束,先降温、关机,后关气。
3.由于样品中挥发性成分较多,样品干燥时,要注意方法和温度。
9、思考题
1.在建立一个中药制剂的测定方法时,如何进行方法学考察?
2.研究和设计中药制剂的分析方法时,应根据哪几方面内容?
(四)实验项目四:
中药制剂中橙皮苷的含量测定
1、实验项目学时:
6学时
2、实验项目类型:
验证性、综合性实验。
3、实验项目内容:
1.HPLC仪器使用及基本操作;
2.色谱条件的选择;
3.实验用溶液的配制,包括橙皮苷对照品溶液及供试品溶液的制备;
4.利用外标一点法进行定量分析。
4、实验项目学习要求:
(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)
(1)运用知识:
HPLC的具体应用。
掌握高效液相色谱仪的的基本操作及定量方法;
(2)提高能力:
提高HPLC的基础操作能力、仪器条件选择能力;提高运用HPLC进行药
物定量分析能力。
5、主要仪器设备与材料:
1.高效液相色谱仪(紫外检测器)
2.C18反相色谱柱(HypersilODS5μm×4.6mm×250mm);
3.微量进样器
4.一次性注射器
5.0.45μm微孔滤膜
6.容量瓶50、250ml
7.移液管,洗耳球;具塞三角瓶(50ml);超声波清洗器;天平;滤纸、培养皿;炮弹管。
8.橙皮苷对照(中国药品生物制品检定所)
9.陈皮(天津市饮片厂)
6、与理论课程的关系:
:
本实验是在第四单元有关高效液相色谱法教学基础上的实验教学。
是中
药含量测定重要方法的直接应用。
是中国药典的主要方法。
7、操作步骤
1)色谱条件:
色谱柱:
C18,250×4.6mm,5μm;流动相:
43%甲醇;柱温:
室温;流速:
1ml/min
;检测:
UVD,波长为
270nm;进样量:
10μL。
理论塔板数
n>3000。
2)橙皮苷对照品溶液的制备及测定:
取橙皮苷对照品1.6mg,加甲醇置100ml容量瓶中,制成0.016mg/ml的溶液,作为对照品溶液。
精密吸取10μL按上述色谱条件进样,测定对照品峰面积。
3)供试品溶液的制备:
取中药复方,精密称取0.3g置锥形瓶中,加入甲醇50ml,加塞称重,超声提取15分钟后继续称重并用甲醇补足减少的重量。
用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,作为供试品溶液。
4)测定
精密吸取10μL供试品溶液,注入液相色谱仪,测定供试品中橙皮苷峰面积。
5)计算
外标一点法计算100克中药复方中含有橙皮苷的克数(%)。
(五)实验项目五:
HPLC综合实验—一清颗粒测定
1、实验项目学时:
6学时
2、实验项目类型:
综合性实验。
3、实验项目内容:
1.实际运用HPLC仪器,解决实际问题
2.一清颗粒中黄芩苷的含量测定
4、实验项目学习要求:
(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)
(1)运用知识:
现代中药分析的特点以及一般程序,掌握中药分析方法学考察的基本内容。
(2)提高能力:
提高运用HPLC进行药物定量分析能力。
5、主要仪器设备与材料:
1.高效液相色谱仪(紫外检测器)
2.C18反相色谱柱(HypersilODS5μm×4.6mm×250mm);
3.微量进样器
4.一次性注射器
5.0.45μm微孔滤膜
6.容量瓶50、250ml
7.移液管,洗耳球;具塞三角瓶(50ml);超声波清洗器;天平;滤纸、培养皿;炮弹管。
8.对照品(中国药品生物制品检定所)
9.一清颗粒(自制)
6、与理论课程的关系:
本实验是在第四单元有关高效液相色谱法教学基础上的实验教学。
是中
药含量测定重要方法的直接应用。
是中国药典的主要方法。
7、实验步骤
1)色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:
HypersilODS(4.6×250mm,5μm)
流动相:
甲醇-1%冰醋酸水溶液(52:
48,v/v)或(54:
46,v/v)检
测波长:
280nm
流速:
1ml/min
柱温:
室温
进样量:
5μl
按黄芩苷计算理论塔板数不低于3000
2)黄芩苷对照品溶液的制备
精密称取在105℃干燥至恒重的黄芩苷对照品适量,用
μg/ml的黄芩苷对照品溶液,于4C保存,备用。
75%乙醇配制成浓度为
20.5
3)供试品溶液的制备
取装量差异项下的内容物,研细,取约
0.1g
,精密称定,置
50ml
量瓶中,加
70%乙
醇10ml,超声处理20分钟,用70%乙醇稀释至刻度,摇匀,上清液用0.45μm微孔滤膜过
滤,取续滤液,即得。
4)阴性溶液的制备
取不含黄芩的药材粉末照供试品溶液同法制备。
5)
测定法
分别吸取阴性溶液、对照品溶液与供试品溶液各5μL注入液相色谱仪,测定,即得。
本品每袋(7.5g)含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计不得少于30.0mg。
8、黄芩苷含量测定的方法学考察
8.1线性关系考察
本实验采用外标一点法,不做线性考察。
8.2精密度试验
取同一对照品溶液5μl注入高效液相色谱仪,连续进样6次,考察仪器精密度。
Table8.1Theresultsofprecisiontest
测定次数
保留时间(
tR)
峰面积(
A)
峰面积平均值
RSD
1
2
3
4
5
6
8.3重复性试验
取同一批号的一清颗粒供试品,按照
3.3项下供试品溶液的配制方法,平行制备
6
份供试品溶液,各取
5μl,注入高效液相色谱仪,进样分析,
考察方法的精密度。
Table8.2
TheresultsofreproducibilitytestofBaicalin
样品号
W称重
峰面积
黄芩苷含量
含量平均值
RSD
1
2
3
4
5
6
8.4
专属性试验
阴性溶液进样分析,与对照品溶液和供试品溶液色谱图对比,考察方法专属性。
8.5
稳定性试验
取同一份供试品溶液,分别于样品制备后
0、2、4、6、12及24h
进样分析(依
试验时间而定),考察方法稳定性。
8.6加样回收试验
精密称取已知含量的供试品6份(依试验时间而定),按黄芩苷已知量的1倍加
入对照品,与3.3项同法制备供试品溶液,在上述色谱条件下进样分析,计算加样回收率。
(依试验时间而定)
9、一清颗粒中黄芩苷的含量测定(可用重复性试验结果)
取同一批号的一清颗粒供试品,
按照3)项下供试品溶液的配制方法,平行制备
3
份以上样品,计算每袋(
7.5g)中黄芩苷的含量(mg)。
(本次试验使用重复性试验结果计算一清颗粒中黄芩苷的含量)
含量测定结果计算公式:
CX=CR*AX*D*7.5*/(AR*W称重*1000)
CX:
mg/袋(7.5g)
CR:
对照品溶液浓度(μg/ml)AR:
对照品溶液黄芩苷峰面积AX:
供
试品溶液黄芩苷峰面积
D:
供试品溶液体积(本次试验为50ml)
W称重:
供试品实际称重量
(六)实验项目六:
HPLC综合实验—一清颗粒测定
1、实验项目学时:
6学时
2、实验项目类型:
综合性实验。
3、实验项目内容:
1.实际运用HPLC仪器,解决实际问题
2.一清颗粒中黄芩苷的含量测定
4、实验项目学习要求:
(从运用知识、提高能力两个层次说明学习要求)
(1)运用知识:
现代中药分析的特点以及一般程序,掌握中药分析方法学考察的基本内容。
(2)提高能力:
提高运用HPLC进行药物定量分析能力。
5、主要仪器设备与材料:
1.高效液相色谱仪(紫外检测器)
2.C18反相色谱柱(HypersilODS5μm×4.6mm×250mm);
3.微量进样器
4.一次性注射器
5.0.45μm微孔滤膜
6.容量瓶50、250ml
7.移液管,洗耳球;具塞三角瓶(50ml);超声波清洗器;天平;滤纸、培养皿;炮弹管。
8.对照品(中国药品生物制品检定所)
9.一清颗粒(自制)
6、与理论课程的关系:
本实验是在第四单元有关高效液相色谱法教学基础上的实验教学。
是中药含量测定重要方法的直接应用。
是中国药典的主要方法。
实
验步骤及结果计算同实验项目五。
四、实验考核
(一)实验考核项目和比例:
实验考核成绩由每次试验的预习报告、实验操作、实验报告
完
成情况、次数及其质量确定;实验缺勤
1/3,实验成绩以零分记并取消参加考试资格。
(二)考核项目评分依据:
序号
项目
成绩
说明
1
课前预习
10%
实验前必须写出报告并查考实验中涉及的基本内容、操
及操作注意事项,经教师检查,方可参加实验。
2
实验操作
20%
3
原始数据
5%
指导老师签字
4
实验报告
20%
要求独立完成报告,若发现抄袭,均按不及格处理。
5
数据处理
10%
独立完成数据处理、绘图等。
6
现象观察与讨论
25%
对实验中观察到的现象做必要的分析、讨论、得出结论。
7
思考题
10%
要求完成实验后的思考题。
(三)实验考核结果反馈:
①反馈实验考核项目学生成绩;②反馈学生操作、讨论、实验报告的质量以及提高建议。
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