基因工程汇总.docx
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基因工程汇总.docx
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基因工程汇总
3、基因工程的基本条件
(1)、用于核酸操作的工具酶:
限制性核酸内切酶、DNA连接酶(修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键)、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修饰酶
(2)、用于基因克隆的载体:
载体的功能及特征、质粒(plasmid)、噬菌体或病毒DNA、考斯质粒(cosmid)与噬菌粒
人造染色体载体
载体的功能:
1)、运送外源基因高效转入受体细胞
2)、为外源基因提供复制能力或整合能力
3)、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件:
1)具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性);2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;3)具有较高的外源DNA的载装能力;4)具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;5)具有合适的筛选标记。
(3)、受体细胞应具备的条件:
1)限制性缺陷型:
外切酶和内切酶活性缺陷(recB-,recC-,hsdR-)
2)重组整合缺陷型:
用于基因扩增或高效表达的受体细胞(recA-)
3)具有较高的转化效率
4)具有与载体选择标记互补的表型
5)感染寄生缺陷型:
防止重组细菌扩散污染,生物武器除外
各种基因工程受体的特性
1)、大肠杆菌:
遗传背景清楚,载体受体系统完备,生长迅速,培养简单,重组子稳定;产结构复杂、种类繁多的内毒素;适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建,是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。
2)、枯草杆菌:
遗传背景清楚,蛋白质分泌机制健全,生长迅速,培养简单,不产内毒素;遗传欠稳定,载体受体系统欠完备;适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌。
3)、链霉菌:
抗生素的主要生产者,分子遗传相对操作简便,不产内毒素;遗传不稳定,生长相对缓慢;主要用于抗生素生产菌株的改良。
4)、酵母菌:
具有真核生物的特征,遗传背景清楚,生长迅速,培养简单,外源基因表达系统完善,遗传稳定;内源性蛋白产物种类繁多且含量高;适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究,是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌。
5)、昆虫细胞(家蚕):
1、具有真核生物的特征,外源基因表达量高,繁殖相对较快,培养成本低廉,遗传稳定;2、DNA重组操作系统欠完善;适用于真核生物基因的高效表达。
6)、哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞CHO):
与人的亲缘关系近,分子重组表达系统健全,具有合适的糖基化修饰系统;细胞培养条件苛刻,生长缓慢;适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产,是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体。
7)、植物细胞(拟南芥菜、烟叶):
农作物的经济意义重大,转基因植物细胞易于分化,细胞培养简单且成本低廉,具有光合作用;遗传操作繁琐;适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产,农作物品质的改良。
实验室常用的基因工程受体:
大肠杆菌
用于接受质粒:
DH5a、HB101、BL21(DE3)、JM109、JM110(Aps、Tcs、Cms)
用于接受l-DNA:
LE392、ED8654
酵母菌
毕赤酵母:
GS115、X-33、KM71、KM71H啤酒酵母
哺乳动物细胞CHO
四、基因工程的操作过程
(1)、DNA的体外重组(切与接):
1、同种内切酶生产的粘性末端的连接2、同尾酶生产的粘性末端的连接3、不同粘性末端的连接4、人工粘性末端的连接5、粘性末端的更换6、重组率。
重组率的定义:
重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数。
在常规实验条件下,重组率一般为25-75%。
重组率是衡量连接反应效率的重要指标,较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。
提高重组率的方法:
1、提高外源DNA片段与载体的分子比:
5:
1-10:
1;
2、载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团(可防止自连);3、加装同聚尾末端;
(2)、重组DNA分子的转化和扩增(转与增):
1、转化的原理与技术:
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化:
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌等),1970年建立此技术,其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构,后者经热脉冲发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,细菌细胞此时的状态叫做感受态。
大肠杆菌感受态细胞的制备:
1、100ml菌体培养至OD600=0.5,离心收集菌体;
2、用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液悬浮菌体,离心收集菌体;
3、用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液悬浮菌体
4、冰浴放置12-24小时,备用
大肠杆菌感受态细胞的质粒转化:
1、取100ml感受态细胞,加入相当于50ng载体的重组DNA连接液,混匀;
2、冰浴放置半小时;
4、在42℃保温2分钟(热脉冲);
5、快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟;
6、加入1ml新鲜培养基,于37℃培养1小时(扩增);
7、涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。
细菌原生质体的转化:
革兰氏阳性细菌(如枯草杆菌、链霉菌等)接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁,因而这类细菌通常采用原生质体(细胞去壁后的形态)转化的方法转移质粒或重组DNA分子。
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化。
细菌原生质体的制备:
不同细菌的原生质体制备方法不尽相同,以链霉菌为例:
细菌需生长在高渗培养基中(如34%的蔗糖溶液,并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。
在制备过程中,菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。
与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。
细菌原生质体的转化:
取0.2-1ml的原生质体悬浮液(108-109个原生质体),加入10-20mlDNA重组连接液,同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液,混匀。
细菌原生质体的再生:
原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。
再生在特殊的固体培养基上进行,内含脯氨酸和微量元素。
l噬菌体DNA的转染:
1、感受态细胞的培养:
将大肠杆菌在含有麦芽糖(不含葡萄糖)和MgCl2的培养基
中培养至OD600=0.5
2、吸附:
加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液,30℃保温10分钟
3、转染裂解:
加入20倍体积的新鲜培养基,30℃培养2小时,直至培养液
中菌体裂解,培养液澄清度增加,然后涂板筛选。
电穿孔转化:
将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中,两极施加高压电场。
在强大电场的作用下,细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙,质粒或DNA重组分子便可进入细胞内;电穿孔转化法操作简单,而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效,但转化效率差别很大;同样的原理,电穿孔法也可用于质粒消除实验。
转化率的定义:
转化率是衡量转化效率的重要指标,其定义为:
每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。
由于在一般的转化实验规模下,每个受体细胞最多只能接受一个载体分子,因此转化率的定义也可以表征为:
每微克载体DNA转化后,受体细胞接纳DNA的个数,即克隆数(在筛选时,未接纳载体或重组子的受体细胞不长)。
例如,pUC18对大肠杆菌的转化率为108,即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。
一微克pUC18共有3.4X1011个分子(6.02X1017/2686X660),也就是说,每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞
另一方面,在实际操作过程中,转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞,大约含有2X1010个大肠杆菌细胞,也就是说,每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA
转化率的用途:
利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模。
例如,某一DNA重组实验的重组率为20%,转化率为107/mg载体,
经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍,欲获得104个重组克隆,需投入多少载体DNA进行重组实验?
转化率的影响因素:
1、载体及DNA重组分子方面:
1)、载体本身的性质:
不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同
2)、载体的空间构象:
质粒的超螺旋构象转化率最高,经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复,其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。
3)、插入片段的大小:
对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低。
2、受体细胞方面:
受体细胞必须与载体相匹配,例如:
pBR322转化大肠杆菌JM83株,转化率很低;但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。
3、转化方法方面:
转化细胞的扩增:
转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。
在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如:
Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时;原生质体转化后的再生过程;l噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作。
扩增操作的目的:
增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;
扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;
表达外源基因,便于筛选和鉴定。
(3)、转化子的筛选和鉴定(检):
1、载体遗传标记检测;2、克隆DNA序列检测;3、外源基因产物检测。
由于重组率和转化率不可能达到理想极限,因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子
载体遗传标记检测:
1、抗药性筛选法:
抗药性筛选法的基本原理:
抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。
将外源DNA片段插在EcoRI位点:
非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr
将外源DNA片段插在BamHI位点:
非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs
抗药性筛选法的基本操作:
先将转化液涂布含有Ap的平板,再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子。
2、营养缺陷型筛选法:
营养缺陷型筛选法的基本原理:
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子,一般不能区分重组子与非重组子。
其原理是:
载体分子上携带某种营养组份的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组份,将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上,长出的便是转化子。
常见的营养缺陷型筛选标记:
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+;
用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk,相应的受体细胞则选择tk-缺陷型;
3、显色筛选法:
显色筛选法的基本原理:
显色筛选法可以区分转化子与非转化子,也可区分重组子与非重组子。
其原理是:
载体分子上携带某种显色酶基因,其表达产物能使细胞产生颜色反应,从而易于辨认和挑选,如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因(蓝色反应)、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因(黑色反应)等。
显色筛选法的基本操作:
将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部,使之灭活,此时重组子呈Apr、lacZ-,淡黄色菌落;而非重组子则呈Apr、lacZ+,蓝色菌落。
克隆DNA序列检测:
1、限制性酶切图谱法:
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析,并以此与目的基因的已知图谱对比,因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子,而且还能鉴定目的重组子。
但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时,工作量极大,实验成本也高。
2、菌落噬菌斑原位杂交法:
菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针,以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。
其中,DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。
菌落原位杂交法的基本操作:
用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板,用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜,用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜,80℃烘干固定影印薄膜,薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温
用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜,用X光胶片覆盖薄膜感光。
杂交探针的制备:
1、用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件:
单链结构(双链DNA可用碱变性);足够长度(至少12个碱基);内部不含互补区。
2、探针的制备方法或来源包括:
人工合成;cDNA合成;同源序列;mRNA。
杂交探针的标记:
T4-PNP介导的末端标记;逆转录酶介导的反转录标记;DNA聚合酶介导的缺刻前移标记;ABC荧光标记;地高辛系统标记;
3、DNA序列分析法:
双脱氧末端终止测序法的基本原理:
DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段,目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列,其工作原理是在DNA聚合反应的进程中,通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有:
DNA链聚合反应时的定点随机中断(ddNTP);聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率(600bp/601bp);电脑自动检测、记录、编辑程序;用于DNA测序的专一性试剂盒(Kit)。
1、外源基因产物检测:
2、蛋白质生物功能测定法:
3、淀粉酶目的基因的鉴定:
淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。
将难溶淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。
将难溶于水的淀粉加入固体培养基内,培养基呈混浊状。
将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上,含目的基因的目的重组子可表达的淀粉酶分泌出胞外,并均匀扩散,同时降解淀粉为可溶性多糖或单糖。
因此,目的重组子菌落周围会形成透明圈。
如果透明圈不明显,还可往培养板上喷碘,使淀粉所在区域呈蓝色本底,易于辨认。
蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定。
4、抗菌素抗性基因的鉴定:
抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。
据此,只需往培养板中加入适量抗生素,理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子。
在实际操作过程中,由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性,因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒,二次转化受体细胞。
如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落,即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生。
5、DNA结合蛋白编码基因的鉴定:
用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板,用聚乙烯薄膜影印裂解平板,轻轻漂洗影印薄膜,干燥固定,80℃烘干固定影印薄膜,与探针溶液中杂交,洗涤、干燥、感光探针选用能与目标蛋白特异性结合的DNA片段。
6、DNA结合蛋白编码基因的鉴定:
用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板,用聚乙烯薄膜影印裂解平板,轻轻漂洗影印薄膜,干燥固定,80℃烘干固定影印薄膜,与探针溶液中杂交,洗涤、干燥、感光。
7、杂交释放转译鉴定:
无细胞体外翻译系统:
麦胚提取物、网织红细胞提取物
8、蛋白质生物结构鉴定法:
9、放射免疫原位杂交鉴定:
用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板,用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印
裂解平板,轻轻漂洗影印薄膜,干燥固定,与I125标记的IgG保温洗涤、干燥、感光。
10、聚丙烯酰胺凝胶电泳法:
如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性,又无现成的抗体使用,则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选。
五、目的基因的克隆与基因文库的构建
1、鸟枪法2、cDNA法3、PCR法4、化学合成法5、基因文库的构建
基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因,目的基因获得之后,或确定其表达调控机制和生物学功能,或建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌(细胞),或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰,然后输回细胞内改良生物体的遗传性状,包括人体基因治疗。
一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:
一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆;另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然后将之克隆表达。
1、鸟枪法
鸟枪法克隆目的基因的基本战略:
随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段,然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子,进而获得目的基因。
鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。
鸟枪法操作的改进:
1、使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA:
使用这一改进方法的前提条件是:
目的基因的酶切图谱已知。
如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNA,然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高重组子中目的重组子的出现频率
2、在连接前将DNA片段进行分级分离:
3、凝胶DNA片段回收技术:
冻融法、滤纸法、吸附法、低融点凝胶法、溶解法
鸟枪法克隆目的基因的局限性:
工作量较大,需要了解目的基因的背景知识;不能获得的最小长度的目的基因;不能除去真核生物目的基因的内含子结构。
2、cDNA法:
cDNA法克隆目的基因的基本战略:
1)、cDNA第一链的合成:
2)、cDNA第二链的合成:
1、自身引导法:
获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失2、置换合成法:
获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失3、引导合成法:
获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列
3)、双链cDNA的克隆
cDNA法分离目的基因的基本程序:
1、完备分离程序:
提取细胞总mRNA,合成总cDNA,将之全部克隆,然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子;筛选时,若使用的是多拷贝载体,则采用菌落原位杂交法筛选;若使用的是表达型载体,则采用菌落免疫杂交法筛选;完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆,如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。
2、特异分离程序:
提取细胞总mRNA,琼脂糖凝胶电泳分离,回收目标mRNA,由此合成双链cDNA,然后进行克隆;特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等
3、差异分离程序:
利用两组细胞mRNA种类的差异,分离克隆差异mRNA所对应的cDNA,因而这种程序较适用于分离克隆新基因例如:
正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中,有些新基因是不能自发表达的,需在多瘤病毒感染之后方可转录。
任务是要分离克隆这些新基因,进而研究其生物学功能
cDNA法克隆目的基因的局限性:
并非所有的mRNA分子都具有polyA结构;细菌或原核生物的mRNA半衰期很短;mRNA在细胞中含量少,对酶和碱极为敏感,分离纯化困难;仅限于克隆蛋白质编码基因。
3、PCR法:
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
PCR(PolymeraseChainReaction)法,又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,是一种高效快速的体外DNA聚合程序。
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是:
已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列,根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
PCR克隆目的基因的基本程序:
由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中,其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基,而且这个碱基几乎总是A,因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。
由于该突出碱基的存在,克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接,也可以使用专门的T载体克隆。
4、化学合成法:
化学合成法的基本战略:
1、全基因合成:
化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知,有三种战略:
2、小片段粘接法:
根据目的基因全序列,分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
3、补钉延长法:
根据目的基因两条互补链全序列,分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段。
4、大片段酶促法:
根据目的基因的全序列,分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
上述三种方法各有利弊:
化学合成DNA的单片段愈短,收率就愈高,但由于化学合成的份额较大,成本较高;在大片段酶促法合成目的基因时,虽然化学合成的份额相对较小,成本较低,但大片段化学合成的收率极低,例如,每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。
5、探针等寡聚核苷酸合成:
在某些情况下,往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列,而基因序列未知,此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA序列,然后合成探针,筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子,最终获得含有目的基因的目的重组子。
由于大多数氨基酸拥有简并密码子,故在探针序列的设计时必须考虑下列问题:
生物体对简并密码子的偏爱性,合成系列探针;探针应具有足够的长度,通常在17-20个核苷酸之间;探针内部不应出现可能的互补区域。
化学合成的单元操作:
化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去,每接一个单体就是一个循环反应,包括:
基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。
从反应机理上来讲,DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法;具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。
前者操作繁琐,基本上已淘汰;后者反应中间物的分离程序简便,DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的
DNA化学合成的用途:
1、合成天然基因:
如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等
2、修饰改造基因:
如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等
3、设计新型基因:
制备探针、引物、接头。
5、基因文库的构建:
基因库(genepool):
特定生物体全基因组的集合(天然存在)
基因文库(genelibraryorgenebank):
从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。
根据构建方法的不同,基因文库分为:
1、基因组文库(含有全部基因);2、cDNA文库(含有全部蛋白质编码的结构基因)。
基因文库构建的基本战略:
用鸟枪法构建基因组文库,材料来自染色体DNA;
用cDNA法构建cDNA文库,材料来自mRNA。
在高度分化的生物体中,不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同(即基因的表达谱不同),因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定,如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。
很显然,cDNA文库的信息量远小于基因组文库。
基因文库的完备性:
基因文库的完备性是指:
在构建的基因文库中任一基因存在的概率,它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示:
N=ln(1–P)/ln(1–f)
其中:
P=任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率
f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小
基因文库的质量标准:
除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因文库应具备下列条件:
1、重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力;
2、载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆;
3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序;
4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下;
5、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。
载体和受体的选择:
出于压缩重组克隆的数量,用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒;对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体;
由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb,因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。
用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌。
基因文库构建的技术性问题:
在基因组文库的构建过程中,最应引起重视的问题是:
严禁外源DNA片段之间的连接!
!
!
为了避免上述情况的发生,可采取下列措施的组合:
1
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