10吨年透明质酸发酵可行性研究报告汇总.docx
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10吨年透明质酸发酵可行性研究报告汇总
一、透明质酸及其发展前景..........................................................1
二、车间概况和特点.....................................................................5
2.1车间主要设备............................................................................5
2.2车间组织.....................................................................................5
2.3工作制度以及人员编制.............................................................5
3、生产菌种及其控制要点...................................................................6
3.1生产菌种选育............................................................................6
3.2供试菌种.....................................................................................6
3.3培养基及控制要点.....................................................................6
4、透明质酸发酵工艺流程..................................................................8
4.1发酵工艺流程..................................................................8
4.2发酵工艺及控制要点.......................................................8
4.3透明质酸生产工艺流程............................................................10
5、主要设备选择..................................................................................12
5.1工艺技术指标及基础数据........................................................12
5.2透明质酸发酵车间衡算....................................................13
5.3主要设备选型............................................................................15
6、车间布置说明..................................................................................16
6.1、车间布置说明...........................................................................17
6.2、设备布置平面图.....................................................................17
7、各相关专业的设计条件..................................................................17
7.1土建条件.................................................................................17
7.2给排水条件............................................................................17
7.3强弱电条件............................................................................17
7.4蒸汽与冷冻条件.....................................................................18
7.5空压与真空条件....................................................................18
7.6采暖通风与空调条件...............................................................19
8、环境保护.........................................................................................20
8.1环境影响分析..........................................................................20
8.2环境保护措施..........................................................................21
9、安全与卫生要求和措施................................................................21
9.1安全与卫生要求......................................................................21
9.2安全措施..................................................................................22
9.3卫生措施.................................................................................23
9.4消防要求和措施......................................................................23
十、节能要求和措施.............................................................................24
11、结论............................................................................................25
11.1产品方案和建设规模.............................................................25
11.2技术水平可靠性......................................................................26
一、透明质酸及其发展前景
透明质酸(Haluronicacid、HA)名玻璃酸,透明质酸是一种酸性粘多糖,1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。
透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能,如润滑关节,调节血管壁的通透性,调节蛋白质,水电解质扩散及运转,促进创伤愈合等。
尤为重要的是,透明质酸具有特殊的保水作用,是目前发现的自然界中保湿性最好的物质,被称为理想的天然保湿因子(Naturalmoisturizingfactor,NMF,例如:
2%的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98%水分。
透明质酸是一种多功能基质,透明质酸(玻璃酸)HA广泛分布于人体各部位。
其中皮肤也含有大量的透明质酸。
人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化,它可以改善皮肤营养代谢,使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老,在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。
与其他营养成分配合使用,可以起到促进营养吸收的更理想效果。
透明质酸是由N-已酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构。
分子式:
(C14H20NNaO11)n
透明质酸本身带有负电荷,在动物体存在于大部分的软结缔组织中。
它的水溶液为粘弹性流体,填充在细胞与胶原纤维空间之中且覆盖在某些表皮组织上。
在动物体,其主要功能乃保护及润滑细胞,调节细胞在此粘弹性基质上的移动,稳定胶原网状结构及保护它免于受到机械性的破坏。
因为透明质酸为天然性润滑以及吸震高分子,在肌腱、肌腱鞘及粘滑膜表面作为润滑剂。
透明质酸(玻璃酸)HA广泛分布于人体的结缔组织中,在眼玻璃体、关节腔中几乎以纯态形式存在。
存在于皮肤中的透明质酸(玻璃酸)HA,对人体表皮的新陈代谢起到重要的作用。
人体中透明质酸(玻璃酸)HA的破坏或失调,均可造成疾病。
皮肤中透明质酸(玻璃酸)HA含量的减少及破坏,可造成皮肤失水中,起皱而失去弹性,使人表皮衰老,因而,透明质酸(玻璃酸)HA又被称为抗衰老因子。
透明质酸(玻璃酸)HA是人皮肤表皮及真皮的主要基质成分之一,其生理功能是能使水分进入细胞间隙,并与蛋白质结合而形成蛋白凝胶,将细胞粘在一起,发挥正常的细胞代谢作用,起到保持细胞水分,保护细胞不受病原菌的侵害,加快恢复皮肤组织,提高创口愈合再生能力,减少疤痕,增强免疫力等作用。
在医药方面,透明质酸(玻璃酸)HA用于非甾体消炎药,关节炎治疗,眼科,心外科手术的辅助药品,在治疗烫伤、烧伤、冻伤、人造皮肤等方面,有着独到的作用。
随着人们年龄的增长及营养、日照、环境等因素的影响,人体合成透明质酸(玻璃酸)HA的能力逐渐下降,皮肤中透明质酸(玻璃酸)HA的含量会逐渐降低,人在胚胎时期体内透明质酸(玻璃酸)HA含量最高,出生后逐渐减少。
如果把20岁的人体内的透明质酸(玻璃酸)HA相对含量定位100%,则30、50、60岁时分别下降为65%、45%、25%。
当皮肤中的透明质酸(玻璃酸)HA含量低于某一水平时,皮肤表层的含水量会逐渐降低,造成角质层老化,皮肤就显得粗糙,出现皱纹,失去弹性,显得衰老,这一现象一般出现在25岁以后。
这也是中老年人与少年儿童皮肤差距的主要原因之一。
同时人体皮肤中透明质酸(玻璃酸)HA的破坏与紫外线有关,所以长期从事野外作业、高原生活、户外作业的人员较室内工作人员的皮肤显得粗糙。
大量研究表明,人体皮肤表层(角质层)水分含量约占15-30%,低于或高于此值均使人不适,具有燥感或腻感,长期如此,会使皮肤干裂或水肿,从而使皮肤失去弹性,粗糙老化。
而透明质酸(玻璃酸)HA作用于皮肤内部调理后,可在不同环境中自动调节,始终维持皮肤水分在25-30%,保持皮肤的湿润、清爽,使皮肤更富有弹性,起到抗皱防皱、延缓人全皮肤衰老、美容养颜的作用。
透明质酸是人体真皮层的其中一种成份,具备保持水份的能力,份量更高达其本身重量的100倍,使用含有透明质酸HA的保养品,可以改善干燥和已出现皱纹的肌肤,使其恢复原有的光滑和弹性,因此,透明质酸是改善干燥及老化肌肤的最理想产品。
研究表明,无论含有多么优秀的成分的化妆品通常都不可能及至真皮部分,特别是因透明质酸HA的分子量大,仅涂于表皮是不可能被真皮吸收。
透明质酸(玻璃酸)HA化妆品仅作用于涂抹部位的皮肤表层,增中皮肤表面透明质酸(玻璃酸)HA含量,起到滋润、保湿作用,是局部性的,外因性的。
而透明质酸(玻璃酸)HA通过口服经消化吸收,可明显增加体内透明质酸(玻璃酸)HA合成的前体,使皮肤和其他组织的透明质酸(玻璃酸)HA合成量增加,从而使皮肤的保水性能增加、富有弹性、皱纹减少。
其美容保健作用是全身性的,是由真皮至表皮增加内源性透明质酸(玻璃酸)HA的含量,使血液微循环量增加,细胞活化,发挥全身作用,属内因性的,与化妆品局部使用具有明显的不同。
因此,维持胶原蛋白的功能就必须补充内源性透明质酸(玻璃酸)HA,既外因必须通过内因而起作用。
透明质酸透明质酸(玻璃酸)HA还能改善皮肤生长条件,为真皮胶原蛋白和弹性纤维的合成提供优越的外部环境,加强营养物质的供给,起到护肤养颜的效果。
研究表明,透明质酸HA可以阻止细胞中一些酶的产生,减少自由基的形成,在防止自由基破坏细胞结构、产生脂质过氧化和引起肌体衰老等方面起着重要作用:
低分子量透明质酸具有抗炎、抑制病菌产生、保持皮肤光洁的作用;为细胞增殖与分化提供合适的场所,直接促进细胞生长、分化、重建与修复等。
HA是一种极有市场开发价值的生物产品,国外如日本已年产几万吨,而我国的研究开发都还有限,目前仅山东福瑞达公司有成品生产。
HA的生物制取,HA的生理机理,HA的广泛存在和HA的衍生物研究等都有待于研究继续进行。
二.车间概况和特点
2.1车间主要设备
本车间为透明质酸的提取车间,有离心机,真空干燥等主要设备。
产透明质酸菌株——兽疫链球菌,我们利用该菌进行了发酵和提取工艺条件的研究。
透明质酸发酵产率为每升发酵液产透明质酸4.5ɡ,提取工艺收得率80.2﹪。
用于透明质酸发酵的设备主要是发酵罐,它配有搅拌、通气管道、pH电极、溶氧电极、温度探头等。
透明质酸的合成需要合适的pH、温度,pH一般为6.0~8.5,温度在30-38℃之间。
菌体利用氧气氧化营养物质,产生的能量保证了其生长及产透明质酸的需要。
2.2车间组织
提取车间设控制室、泵房、配电室、缓冲室、休息室等。
2.3工作制度以及人员编制
1.采用调休制度,年工作日为200天,每半年进行一次设备检修,每天采用三班倒,每班工作8小时,连续生产。
1.1原料生产工人:
维护发酵罐正常17人
1.2提取生产工人:
冻干车间4人,配制2人,提取4人,共计1人。
1.3辅助生产工人:
考虑到搬运工2人、维修工2人、洗衣工1人、化验工2人,共计8人。
1.4质检人员:
4人
1.5管理人员和工程技术人员:
4人可以满足要求。
1.6勤杂人员:
1人即可。
共计:
17+10+8+4+4+1=44人
三、生产菌种及其控制要点
3.1生产菌种选育
透明质酸(Hyaluronicacid,简称HA)又名玻璃酸,是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺以-1,3和-1,4糖苷键相连的重复二糖结构单位形成的一种链状高分子酸性粘多糖,1934年MEYER首先从牛眼玻璃体中分离出该物质,由于其具有特殊的生理作用和极强的保湿能力,而在日化工业医学研究和食品工业等领域有着广泛的应用目前产透明质酸菌种大多是链球菌属的A群和C群,均为溶血型,产HA也产透明质酸酶,为了克服原菌种的不利因素,一般要进行诱变处理才能获得溶血性和透明质酸酶双缺陷型高产菌株研究资料显示,目前所用诱变方法主要有紫外线-射线辐照和NTG化学诱变等,其中以紫外线和NTG诱变的效果最为显著。
本研究通过利用重离子束流和紫外线相结合的方法对兽疫链球菌进行诱变处理,以此筛选HA高产菌株作为一种新的透明质酸产生菌的诱变方法。
材料和方法
3.2供试菌种
兽疫链球菌CVCC1917:
购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。
3.3培养基及控制要点
液体保藏培养基:
葡萄糖2%,牛肉膏1%,蛋白胨0.8%,磷酸氢二钠0.25%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.2%,琼脂
筛菌培养基:
牛肉膏0.5%,胰蛋白胨1%,葡萄糖0.2%,氯化钠0.2%,磷酸氢二钠0.04%,琼脂1.5%,脱纤兔血8%透明质酸酶缺陷型筛选培养基:
牛肉膏0.5%,胰蛋白胨1%,葡萄糖0.2%,氯化钠0.2%,磷酸氢二钠0.04%,琼脂1.5%,透明质酸钠0.1%
增菌培养基:
葡萄糖2%,牛肉膏1%,蛋白胨0.8%,磷酸氢二钠0.25%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.2%,不加琼脂。
直接用兽疫链球菌悬液亦可用摇瓶种子培养液作种子罐接种。
各级种子于28~38℃进行培养,经一定时间后,种子生长成熟,即可移入发酵罐。
种子培养基的成分和质量对菌体发芽和种子质量有重要关系,种子质量还与种子培养时消耗功率的大小有明显关系,在不损害菌体的情况下,增加种子培养的输入功率,能使透明质酸的发酵单位直线上升。
菌体培养基中的配比适当与斜面菌体的质量和菌种的发酵单位有重要的关系,琼脂本身的质量对菌体质量也有重要的影响,而这一点常常为人们所忽视。
为了减少因琼脂产地,加工方法不同而引起斜面质量的差异,可用水洗琼脂,除去某些可溶性杂质,以提高菌体质量。
光对斜面孢子生长有抑制作用,应该避光培养。
发酵培养基:
葡萄糖2%,蛋白胨2%,磷酸氢二钠0.25%,硫酸镁1%,磷酸二氢钾1%,磷酸氢二钾1%,硫酸锰0.06%,硫酸氨0.06%接种量为10%,培养温度为28~38℃,pH为7.0。
周期35小时
培养基成分除葡萄糖外,均按比例配好,用NaOH调至pH7.2,121°C下高温灭菌20min。
葡萄糖在115°C灭菌20min后再加至上述灭菌后的培养液中。
培养液冷却到室温后即可接种。
四、透明质酸发酵工艺流程
4.1发酵工艺流程
4.2发酵工艺及控制要点
取斜面菌种,接种于装有灭菌培养液锥形瓶中,药瓶33℃培养12h-16h,接种于种子罐中。
培养液中氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏等,碳源为葡萄糖。
33℃搅拌培养12~16h,接种于发酵罐中。
接种比例1:
10。
发酵液配方基本与种子液相同,只是葡萄糖含量较高,一般为3%-6%。
维持通气量0.8vvm-1.0vvm,搅拌转速150r/min,33℃发酵40~46h。
在发酵过程中,发酵液的pH值不断下降,需调pH6.5-7.0。
发酵后期,葡萄糖浓度下降至0.5%以下,pH值下降很慢或不再下降时,即为发酵终点。
发酵结束,用三氯乙酸调pH4.0-4.5,板框过滤除菌体,滤液调pH6.0-6.5,加3倍体积95%乙醇,沉淀出HA。
沉淀用发酵体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解,在搅拌下,加入过量的1%CPC与滤液中的HA发生络合沉淀,静置使沉淀下沉。
虹吸出母液,加入0.1mol/L氯化钠液洗涤沉淀两次。
沉淀在发酵体积的0.4mol/L氯化钠液中搅拌解离过夜。
过滤,滤液加乙醇沉淀,乙醇脱水,真空干燥得HA。
兽疫链球菌的营养需求较高,通常要求培养基中含血清、小牛肉浸出液、脑心浸出液等,但这类营养物质价格昂贵,大规模生产中用其作为培养基,成本太高。
所以在选择菌种时,要考虑其营养需求及所用培养基的成本问题。
发酵生产HA所用的培养基,氮源为蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出粉、牛肉浸膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等;碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物,最常用的是葡萄糖;其他还有磷酸盐、硫酸盐,钾、钠、钙、镁等无机盐,以及铁、锰、铜、锌等微量元素。
兽疫链球菌属于兼性厌氧菌。
在HA的发酵工艺中,大多数采用有氧发酵。
也有的采用厌氧发酵。
根据HA生物合成路线,有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP,有利于UTP生成,而UTP是合成HA的两个活化前提物(UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖)所必需的物质。
因此从代谢调控的角度来说,有氧发酵有利于HA的合成。
通过增加通气量和提高搅拌转速可提高发酵液的溶氧,但转速过快可导致HA的机械降解。
在HA的发酵过程中,pH值是一个重要的因素,一般控制在6.0~8.5范围内。
链球菌是一种乳酸菌,产生乳酸等小分子有机酸的总量远大于HA,需用碱液进行中和,以维持适当的pH值。
发酵液中的HA在菌体外的溶液中游离存在,进行下游分离纯化时,首先杀灭和除去发酵液中的菌体,通常加入杀菌剂或加热到75℃~80℃进行灭菌,最常用的杀菌剂为三氯乙酸和阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)HA的含量较高时,发酵液的黏度很高,直接过滤或离心除菌体非常困难,需要先进行稀释。
除菌体后的清液,经乙醇沉淀、氯仿处理、CPC沉淀、离子交换、超滤等方法进行分离纯化,最后用有机溶剂沉淀、真空干燥或冷冻干燥制得HA精品。
4.3透明质酸生产工艺流程
发酵结束后的培养液中存在兽疫链球菌体以及培养基成分,一般来说比从动物组织提取的场合易于提取。
首先,在培养液中加入水和三氯醋酸,使其黏度下降,用过滤或离心分离除去菌体和不纯物,然后加入氯仿萃取蛋白质,在滤清液中加入醇和酮即沉淀出絮状透明质酸,经冻干或真空干燥即得成品透明质酸。
4.3.1透明质酸提取车间生产工艺流程
发酵液
∣加适量水稀释、加三氯醋酸调pH4.5
│搅拌30分钟,15000rpm离心20分钟
︱
────────────
↓↓
细胞碎片上清液
│用NaOH调pH7.0,加3倍体积95﹪酒精
│4000rpm
────────────
↓↓
沉淀上清液
│加入2倍体积3﹪醋酸钠溶液
↓
溶解液
│加0.5体积的氯仿搅拌乳化2小时,
│15000rpm离心
────────
↓↓
沉淀上清液
│0.2微米微孔滤膜过滤
↓
滤液
│加3倍体积的95﹪酒精
│
────────────
↓↓
絮状沉淀上清液
↓冻干或真空干燥
成品
4.3.2提取工艺的几个主要工序
发酵液用三氯醋酸调pH3﹪醋酸钠溶液4.5,15000rpm离心20分钟,取上清液,用3﹪醋酸钠溶解沉淀至适当浓度,加入0.5体积的氯仿抽提蛋白质,15000rpm离心20分钟,得上清液重复同上操作,最后加入3倍体积的酒精沉淀透明质酸并冻干得样品。
由实验证明可知:
三氯醋酸的除菌工艺较好,比较盐酸法,菌体除去多,对透明质酸的影响也少,微孔过滤在加压的情况下,0.5微米孔径不能除去菌体,0.2微米孔径虽能除菌,但需大量稀释,滤速慢,可根据成本和产品质量要求选用,本实验用三氯醋酸法。
由于氯仿一次性沉淀法的蛋白质去除度是有限的,所以在实验中,我们均采用二次去蛋白质的方法。
4.3.3提取的最佳工艺条件
用三氯醋酸调节pH4.5,搅拌30分钟;用0.2微米微孔滤膜过滤;氯仿二次除蛋白工艺,即可达到最佳提取效果。
五、主要设备选择
5.1工艺技术指标及基础数据
1.年产量:
10吨生产天数:
200d日生产时间:
24h
收得率:
80.2﹪
透明质酸发酵液产率:
4.5g/L
发酵液:
2770.9kg
每批处理量:
20kg/d﹪
2.每步需要的物料量
(1)加1:
1.5的水稀释需水量:
3576.4kg
细胞碎片中菌体含量:
1.25g/L
上清液量:
857.1kg
(2)加3倍体积95﹪酒精需酒精量:
867.3kg
按沉淀中含透明质酸15﹪计算
透明质酸量:
4.7kg
(3)加入2倍体积3﹪醋酸钠溶液需醋酸钠量:
27.4kg
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