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试验一凝集反应
医学免疫学实验讲义
实验一凝集反应
在一定浓度的电解质溶液中,颗粒性抗原与相应抗体结合后,出现肉眼可见的凝集块,称为凝集反应(agglutinationreaction)。
凝集反应是一种定性的检测方法,即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性;也可以进行半定量检测,即将标本作一系列倍比稀释后进行反应,出现阳性反应的最高稀释度作为滴度(或效价)来判断结果的强弱。
凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应。
由于凝集反应方法简便,目前在临床检验中仍被广泛应用。
一、直接凝集反应
细菌、细胞等颗粒性抗原,在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集,称为直接凝集反应(directagglutinationreaction)。
凝集反应中的抗原又称为凝集原(agglutinogen),抗体称为凝集素(agglutinin)。
常用的直接凝集试验有玻片法和试管法两种。
(一)玻片凝集试验——ABO血型鉴定
【原理】
玻片凝集试验为定性试验,一般用已知抗体作为诊断血清,与受检颗粒性抗原如菌液或红细胞,各加一滴在玻片上,混匀,数分钟后即可用肉眼观察凝集结果,出现凝集颗粒的为阳性。
此法简便,快速,适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型,也可用于红细胞ABO血型的鉴定。
【材料】
1.标准血清(抗体):
抗A分型试剂和抗B分型试剂各1支。
2.盛有1ml生理盐水的一次性试管1支。
3.一次性采血针1枚、白瓷板或玻片1块、一次性毛细吸管1支、75%酒精棉球和灭菌干棉球。
【方法】
1.用酒精棉球消毒被检者的耳垂或手指尖端,以采血针刺破皮肤,稍加挤压,使血液流出,滴1~2滴血液于含有生理盐水的试管内,摇匀,使成为血球悬液。
用灭菌干棉球止血。
2.取白瓷板1块,将抗A、抗B分型试剂分别滴加1滴于白瓷板的两个圆孔内。
3.用毛细吸管吸取血球悬液,在白瓷板的两个圆孔内各加1滴。
4.将白瓷板前后左右不停地摇动,使其充分混匀,5~10min后观察血球有无凝集发生。
如有凝集,可见红细胞凝集成块;无凝集,红细胞呈均匀分散(图1)。
5.记录受检者红细胞凝集情况,根据ABO血型鉴定表,判断受检者的血型。
表1-1ABO血型鉴定表
抗A分型试剂
抗B分型试剂
血型
+
-
A
-
+
B
+
+
AB
-
-
O
红细胞不凝集红细胞凝集
图1红细胞凝集判断示意图
【注意事项】
1.采血前应对采血部位进行消毒。
2.采血针必须一人一针,禁止混用,严防交叉感染。
3.本法也可将血液直接滴在白瓷板或玻片上,而不必用生理盐水稀释,其结果不变。
(二)试管凝集试验
【原理】
试管凝集试验是一种半定量的试验方法,常用于血清中抗体的测定,其浓度常以效价表示。
即将待检血清在试管内作一系列倍比稀释,然后加入相应的颗粒性抗原,使其在试管内发生直接凝集,以出现明显凝集(++)的血清最高稀释度为其效价(亦称为滴度)。
临床上常用的试管凝集试验有:
肥达试验(Widaltest)和外斐试验(Weil-Felixtest)。
【材料】
1.诊断血清:
1∶10稀释的伤寒杆菌“O”及“H”诊断血清。
2.抗原:
伤寒杆菌“O”菌液(菌体抗原),伤寒杆菌“H”菌液(鞭毛抗原)。
3.生理盐水、小试管、吸管、试管架、水浴箱等。
【方法】
1.取清洁小试管16支,分两排列于试管架上,每排8支,依次编号,每管内加生理盐水0.5ml。
2.用1ml洁净吸管吸取伤寒杆菌“O”诊断血清0.5ml加入第一排的第1管内,于管内上下吹吸3次,使血清与生理盐水充分混匀,吸出0.5ml加于第2管,同法混匀,吸取0.5ml加于第3管,依次稀释至第7管,从第7管吸出0.5ml弃去。
第8管为生理盐水对照。
稀释方法如图2所示。
图2血清倍比稀释法
3.同法稀释第2排的伤寒杆菌“H”诊断血清。
4.用1ml洁净吸管吸取伤寒杆菌“O”菌液,从第1排的第8管起依次向前在各管内加入0.5ml(表1-2)。
5.另取1支1ml吸管,同法于第2排各管中加入伤寒杆菌“H”菌液0.5ml。
6.将各试管振荡混匀,放入37℃水浴箱中2~4小时,初步观察结果后,置4℃冰箱过夜,次日再行观察。
单位:
ml
表1-2试管凝集试验加样程序
1∶10伤寒杆菌血清
对照
弃去
结果
37℃水浴箱中2~4小时,4℃冰箱过夜
血清稀释度
伤寒杆菌菌液
生理盐水l
试管编号l
【结果】
先观察第8管对照(图3),管底沉淀物呈圆形,边缘整齐,轻轻振摇细菌分散呈均匀浑浊,此为阴性。
然后从第1管起,逐管观察,如有凝集,可见管底有凝集块,边缘不整齐,液体澄清。
“O”菌液的凝集呈致密颗粒状,不易摇散,“H”菌液的凝集呈疏松棉絮状,易摇散。
凝集强度的判断以“+”号表示如下:
“++++”:
很强,细菌全部凝集,液体澄清,管底有大片凝集物。
“+++”:
强,细菌大部分凝集,管底的凝集物较小,液体微混。
“++”:
中等强度,细菌部分凝集,管底凝集物细小,但仍明显可见,液体半澄清。
“+”:
弱,细菌仅少部分凝集,液体混浊。
“-”:
不凝集,液体混浊与对照管相似。
以产生明显凝集(++)的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。
不凝集凝集凝集摇动后
的现象
图3试管凝集结果示意图
【注意事项】
1.加抗原时必须先从对照开始,然后从低浓度血清稀释度到高浓度血清稀释度依次加入。
2.“H”菌液的凝集很疏松,极易摇散,判断结果时应避免剧烈振动,以免影响结果。
注:
效价是指机体对抗原产生免疫应答时,其血清中含有特异性抗体的浓度,常以出现阳性反应的血清最高稀释度为效价(滴度)。
二、间接凝集反应
将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面(这种载体与免疫无关),然后与相应抗体或抗原结合,在适量的电解质存在下,出现特异性凝集现象,称为间接凝集反应(indirectagglutination)或被动凝集反应(passiveagglutination)。
这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测,其敏感度高于沉淀反应,因此被广泛用于临床检验。
其中将抗体吸附于载体表面检测抗原的间接凝集反应称为反向间接凝集反应。
根据载体的不同可将间接凝集反应分为:
间接血球凝集试验、间接乳胶凝集试验(及间接乳胶凝集抑制试验)和金黄色葡萄球菌协同凝集试验。
(一)间接血球凝集试验——血清类风湿因子测定
【原理】
以红细胞为载体,将人丙种球蛋白(可溶性抗原)吸附在载体表面而成为致敏红细胞,然后用此致敏红细胞检测类风湿性关节炎患者血清中的类风湿因子(抗变性IgG抗体),当患者血清中含有类风湿因子时红细胞发生凝集。
此方法常用于检测血清中的抗体,辅助诊断疾病。
【材料】
1.致敏红细胞悬液。
2.1∶10待检血清、阳性对照血清、稀释液。
3.V型微量反应板、微量移液器、微量振荡器、37℃恒温箱、移液头。
【方法】
1.用微量移液器吸取稀释液加于微量反应板的1~9孔内,每孔50l,第10孔加50l阳性对照血清。
2.第1孔内加待检血清50l,混匀后吸出50l加于第2孔内,依次作倍比稀释至第8孔,并从第8孔中吸出50l弃去。
各孔的血清稀释度为1:
20、1:
40、1:
80……。
第9孔为阴性对照,第10孔为阳性对照。
3.将致敏红细胞悬液混匀,从第9孔起依次向前各孔内加入50l致敏红细胞悬液。
4.第10孔阳性对照加50l致敏红细胞悬液。
将反应板置于微量振荡器上,振荡1min,37℃静置30min后观察结果。
【结果】
先观察第9孔阴性对照孔中的红细胞应紧密集中于孔中央,成为一红点(图4);第10孔阳性对照孔中的红细胞应凝集并均匀地铺于孔的四周,孔中央无红细胞沉积的红点。
然后根据孔中红细胞凝集现象及其强弱程度,分别以“+”表示如下:
“+++”——红细胞凝集铺于孔的四周,有时因凝集过于强烈,会出现周边的凝集向孔心滑动的现象,此时应注意不要误判为阴性(阴性:
红细胞紧密集中于孔底,边缘整齐光滑)。
“++”——部分红细胞凝集,均匀铺于孔四周,孔中央可见疏松的红点。
“+”——红细胞沉积为环形,直径比对照的大,环四周有凝集现象。
“-”——红细胞紧密集中于孔底,边缘整齐光滑。
以“++”的血清最高稀释度作为试验效价,凝集效价>1:
40判定为阳性。
红细胞不凝集红细胞凝集
图4红细胞凝集判断示意图
【注意事项】
1.在进行多样本血清稀释时,极易发生操作失误,因此,操作要仔细。
2.加致敏红细胞悬液应从第9孔为阴性对照开始依次从低浓度向高浓度进行。
3.观察结果时应轻拿V型反应板,避免已凝集的红细胞从孔壁滑落,造成凝集效价下降或出现假阴性结果。
(二)金黄色葡萄球菌协同凝集试验
【原理】
金黄色葡萄球菌细胞壁含有一种蛋白质,称为金葡菌A蛋白(staphylococcusproteinA,SPA)。
SPA具有与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性。
利用SPA这一特性,将已知的特异性抗体吸附于金葡菌上,与相应抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验(coagglutination)。
此方法常用于未知抗原的检测。
【材料】
1.抗A群脑膜炎球菌抗体致敏的金葡菌液、未致敏的金葡菌液、生理盐水。
2.毛细吸管、有格玻片。
【方法】
1.在玻片的第1、2格分别加1滴致敏金葡菌液,第3格加未致敏金葡菌液。
2.于第1、3格各加1滴病人脑脊液,第2格加1滴生理盐水,将玻片轻轻摇动3~5min,观察结果。
【结果】
第1格内细菌形成白色凝集,表明病人脑脊液中A群脑膜炎球菌阳性;第2格为致敏金葡菌液对照,细菌不凝集;第3格为未致敏金葡菌液对照,细菌也不出现凝集(图6)。
金葡菌凝集金葡菌不凝集金葡菌不凝集
图6协同凝集试验结果示意图
第1格第2格第3格
【注意事项】
1.在操作过程中要不断地摇动玻片,同时注意避免相互之间混合。
2.气温较低的环境,应适当延长结果判断的时间,或提高实验环境的温度。
3.当凝集不明显,或结果判断困难时,可将玻片置于显微镜下观察,判断细菌是否有凝集现象。
实验二沉淀反应
可溶性抗原如血清、毒素、细菌浸出液等与相应抗体结合,当二者比例合适、并有适量电解质存在时,形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线,称为沉淀反应(precipitation)。
参与沉淀反应的抗原称为沉淀原、抗体称为沉淀素。
由于参与反应的抗原为可溶性,分子小,单位体积内所含的抗原量多,与抗体结合的总面积大,因此,在实验中常常稀释抗原以保持抗原与抗体合适的比例,并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
沉淀反应是免疫实验中最常用、最基本的方法之一。
它的种类较多,可分为琼脂扩散试验、免疫电泳试验、环状沉淀试验及絮状沉淀试验等。
一、琼脂扩散试验
利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂内进行扩散,当二者比例合适时,就出现白色沉淀线,此方法称为琼脂扩散试验。
本试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂内进行操作。
琼脂扩散试验可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。
扩散与电泳结合又有多种方法,如对流免疫电泳、火箭电泳及交叉免疫电泳等。
(一)单向琼脂扩散试验
【原理】
单向琼脂扩散试验(singleagardiffusion)是一种定量试验。
将一定量的抗体与琼脂混合,倾注于玻璃板上,凝固后,在琼脂层中打孔,再将抗原加入孔中。
孔中抗原向四周扩散(分子量<20万的物质,在琼脂中扩散犹如在液体中自由运动),在抗原与抗体的比例合适处,呈现白色沉淀环。
沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。
如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线,则未知标本中的抗原含量可从标准曲线中求出。
本试验主要用于检测标本中各种Ig和血清中各种补体成分的含量,灵敏度较高。
【材料】
1.3%琼脂(用0.01molpH7.4磷酸盐缓冲液配制)。
2.抗血清:
羊抗人IgG诊断血清(单向扩散效价1∶80)。
3.标准抗原:
冻干正常人混合血清。
4.待检标本:
人血清。
5.0.01molpH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)。
6.单向扩散专用小塑料板、微量移液器、打孔器(3mm)和水浴箱等。
【方法】
1.将3%琼脂加热溶解后,保温于56℃水浴中。
2.用PBS将羊抗人IgG诊断血清作1:
40稀释,保温于56℃水浴中。
当抗血清和琼脂均为56℃时,二者等量混匀,此时抗血清的浓度为1:
80,琼脂浓度为1.5%。
3.将含有抗血清的琼脂浇板,每块板4ml,待其冷却凝固后,用打孔器在琼脂板上打孔,空间距为1.2~1.5cm,挑出孔内琼脂。
4.稀释标准抗原每支冻干标准血清加入蒸馏水0.5~1.0ml,待完全溶解后,根据IgG含量用PBS稀释成几种稀释度,使其IgG含量分别为每毫升50,100,200,400,800g等。
5.加样用微量移液器吸取10l各种稀释度的标准抗原,准确地加入琼脂板的孔中,一种稀释度加2个孔,用以制作标准曲线。
测待检标本时,先将被检血清用PBS作1:
40稀释,然后每孔加10l,每份标本加2孔。
6.加好样品的琼脂板放于湿盒内,经37℃24小时后取出,测量各孔沉淀环直径(图7)。
7.以各种稀释度标准抗原的沉淀环直径为纵坐标,相应孔中IgG含量为横坐标,在计算机或半对数坐标纸上画出标准曲线。
根据待检血清沉淀环的直径,查标准曲线,将查得的IgG含量乘以标本的稀释倍数(40),即为血清中IgG含量。
(图8)。
【注意事项】
1.琼脂和抗体保温温度不宜太高,抗体保温时间也不应太长,否则对抗体的活性有影响。
2.溶解IgG标准抗原时,其蒸馏水的具体用量应按试剂盒说明进行取量。
3.加标准抗原和待检标本时应力求准确,否则实验结果有偏差。
4.琼脂经37℃24小时,可能会生长细菌,为避免此现象的产生,可加入终浓度为0.02%的叠氮钠。
图7单向琼脂扩散试验示意图
图8单向琼脂扩散试验标准曲线
(二)双向琼脂扩散试验
【原理】
双向扩散(doublediffusion)是将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板相对应的孔中,两者各自向四周扩散,如果抗原和抗体相对应,则在两者比例适当处形成白色沉淀线。
若同时含有若干对抗原抗体系统,因其扩散速度不同,可在琼脂中出现多条沉淀线。
观察沉淀线的位置、形状等可对抗原或抗体作出定性分析。
本试验常用于检测抗原抗体的纯度,滴定抗体的效价以及用已知抗原(抗体)检测和分析未知抗体(抗原)。
临床上用此法检测患者血清中的甲胎球蛋白(AFP),作为原发性肝癌的重要诊断指标。
双扩试验所需时间较长(24小时),灵敏度不高。
【材料】
1.抗体,抗AFP;抗原,AFP。
2.待检血清。
3.1%琼脂(生理盐水配制,内含1:
1000叠氮钠)。
4.载玻片、吸管、吸球、打孔器、微量移液器、湿盒及37℃孵箱等。
【方法】
1.将琼脂加热溶化,待冷却至50~60℃时,用吸管吸取4ml缓缓加在载玻片上(勿使溢出玻片边缘,并避免产生气泡)。
2.待琼脂冷却凝固后,用打孔器按图9打孔(打7孔或3孔均可,孔间距为6mm),并将孔中琼脂挑出。
3.用微量移液器向中央孔(三角孔随意一孔)内加入10l抗AFP抗体,上下孔加AFP抗原作阳性对照,其余孔加10l待检血清,防止液体外溢。
4.将琼脂板放在湿盒内,置37℃孵箱中24小时后观察结果。
图9双扩散法琼脂孔的大小及距离示意图
【结果】
若待检血清标本产生沉淀线,并与阳性对照所产生的沉淀线吻接成一线,则表示AFP阳性。
如无沉淀线则表示AFP阴性(图10)。
双扩时,在抗原和抗体的对应孔和临近孔之间,由于加入的抗原和抗体的成分不同,沉淀线的位置、数目与特征也有差异,这些都有助于分析抗原或抗体的成分,沉淀线一般有以下几种情况:
1.抗原与抗体的浓度相等,沉淀线在两孔之间呈直线(图10—A);若抗体浓度比抗原低,则沉淀线靠近抗体一方(图10—B);反之,如抗原浓度比抗体低,则沉淀线靠近抗原一方(图10—C)。
2.在三角形排列孔中,若两抗原孔内的抗原相同,与同一相应抗体反应,两条沉淀线顶端相联(图10—D);若两抗原孔内抗原不同,与两种相应抗体反应,两条沉淀线相交(图10—E);若一抗原孔的抗原与另一孔中除有相同成分外又有不同成分,抗体孔内有各相应的抗体,则形成的沉淀线相切(图10—F)。
图10双向琼脂扩散试验沉淀线类型
【注意事项】
1.扩散时间要适当。
时间过短,沉淀线线不能出现;时间过长,会使已形成的沉淀线解离或散开而出现假阴性。
2.加抗原抗体的移液头不能混用。
3.为避免琼脂中生长细菌,可加入终浓度为0.02%的叠氮钠防腐。
(三)对流免疫电泳试验
【原理】
带电的胶体颗粒可在电场中移动,移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。
蛋白质抗原在pH8.6的碱性缓冲液中,由于羧基解离而带负电荷,在电泳时从负极向正极移动。
抗体属球蛋白,所暴露的极性基团较少,在碱性缓冲液中羧基解离也少,只带微弱的负电荷,而且其分子量较大,电泳力较小,在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动,这样就使抗原和抗体定向对流,在两孔间相遇时发生反应,并在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线。
这种将双向琼脂扩散和电泳技术结合在一起的方法称为对流免疫电泳(counterimmuno-electrophoresis)。
由于抗原、抗体在电场中定向移动,限制了抗原抗体的多向自由扩散,加快了抗原抗体的移动速度,因而提高了试验的敏感度,同时也缩短了试验时间,故可用于快速诊断。
【材料】
1.电泳缓冲液:
pH8.6巴比妥—盐酸缓冲液。
2.抗体:
抗AFP。
3.抗原:
AFP阳性血清、待检病人血清。
4.1%琼脂:
用pH8.6巴比妥—盐酸缓冲液配置,冰箱保存备用。
5.电泳仪、电泳槽、载玻片、打孔器、10ml吸管、移液器、移液头等。
【方法】
1.制板加热溶化1.5%琼脂,待冷却至50~60℃时,用10ml吸管吸取4ml加于载玻片上。
2.打孔在凝固后的琼脂板上,用打孔器打两排孔,孔间距为4mm。
3.加样将琼脂板上有标记孔的作为阴极,然后按图11所示加满各孔。
4.电泳将加好样品的琼脂板置电泳槽上,抗原侧置阴极端,抗体孔侧置阳极端。
琼脂板两端用纱布与缓冲液相连,接通电源,控制电压6~10V/cm板长(两端电压约50V),电泳时间约30~60min。
5.关闭电源,取出琼脂板,观察结果。
【结果】
将玻片对着强光源,先观察AFP阳性血清孔与抗体孔之间的白色沉淀线,然后再观察待检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现,如有沉淀线,则表示AFP试验阳性,反之则AFP试验为阴性。
沉淀线
标记孔作负极
图11对流免疫电泳示意图
:
抗AFP;
:
AFP阳性血清;
:
待检病人血清
【注意事项】
1.电泳时电流不宜过大,以免蛋白变性。
2.抗原和抗体的电极方向不能搞错。
3.抗原和抗体的浓度要适当,抗原太浓或太稀都不易出现沉淀线。
4.电泳所需时间与孔间距离有关,距离越大,电泳时间越长。
5.琼脂的质量要好(选用进口或者进口分装),否则不易出现结果,也可选用琼脂糖。
6.琼脂的浓度不宜太高(1%~2%),应以容易挑出孔内琼脂为宜。
注:
带电质点在电场中向着带异相电荷的电场移动,称为电泳。
其在电场中移动的方向及速度,取决于带电质点本身所带的电荷、电场强度、溶液的pH值、粘度以及电渗等因素。
电渗作用:
电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。
由于琼脂中含有SO42-,带负电荷,造成静电感应致使附近的水带正电荷,而向负极移动,这种现象称为电渗作用,水向负极移动所产生的力称为电渗力。
因此,电泳时有两种力,即电泳力和电渗力。
如果物质原来带正电荷,向负极移动,则因电渗作用向负极移动得更快。
如果物质向正极移动,所带电荷少,电泳力抵不过电渗力,则也向负极移动,血清中的γ球蛋白就是如此。
实验三补体参与的免疫反应
补体是存在于哺乳动物血清中的一组糖蛋白,约占血清总蛋白含量的3%~5%。
正常情况下,循环中的补体成分均以非活化的前体形式存在,可通过传统途径或旁路途径而激活。
补体的作用没有特异性,能与任何一组抗原抗体复合物结合。
在激活过程中分解的产物有杀菌、溶菌、灭活病毒、破坏细胞以及促进吞噬、促进血液凝固等作用,是整个机体免疫功能的重要组成部分。
各种动物血清中,补体的含量以豚鼠为最高,成分较全,效价稳定,采取方便,因而常将豚鼠的全血清作为补体来使用。
补体不耐热,56℃30min就可使其失去活性,这一过程称为“灭能”或“灭活”。
(一)溶血反应
【原理】
将红细胞多次注射于动物(如将绵羊红细胞多次免疫家兔)可使之产生相应的抗体(溶血素),这种抗体与红细胞结合,在有电解质存在时可发生凝集现象,若同时有补体存在,则补体被激活,红细胞被破坏溶解,这种现象称为溶血反应(hemolyticreaction)。
通常溶血反应用来作为补体结合反应中的指示系统。
【材料】
1.2%绵羊红细胞、溶血素、补体(豚鼠血清)、生理盐水。
2.小试管、吸管、滴管。
【方法】
1.取小试管3支,按表3—1加入各物。
表3—1溶血反应加样程序1
单位:
ml
管号
1
2
3
2%红细胞
0.5
0.5
0.5
溶血素(2u)
0.5
0.5
—
补体(2u)
0.5
—
0.5
生理盐水
0.5
1.0
1.0
2.将上述3支试管放置于37℃水浴中15~30min,观察有无溶血现象,若红细胞溶解,则由红色的细胞混浊液体变为红色透明液体。
3.将不溶血试管(第2、3管)低速离心3~5min,使红细胞沉淀。
4.将第2管上清液倒入(或用毛细吸管吸入)第4管,将第3管上清液倒入第5管,然后再依表3—2加入各物。
表3—2溶血反应加样程序2
单位:
ml
管号
2
3
4
5
内容物
第2管沉淀物
第3管沉淀物
第2管上清液
第3管上清液
2%红细胞
—
—
0.5
0.5
溶血素(2u)
—
0.5
—
0.5
补体(2u)
0.5
—
0.5
—
生理盐水
2.5
2.5
—
—
5.混匀后,将上述4支试管置37℃水浴中15~30min后,观察结果。
【结果】
第1、2、5管出现溶血,其余两管均不溶血。
【注意事项】
1.未经洗涤的绵羊红细胞悬液可在4℃冰箱中保存1周。
2.配置2%绵羊红细胞时,应将绵羊红细胞悬液洗涤3次,然后用压积红细胞配置,现用现配。
3.采集补体用的容器要清洁,并及时分离血清,离心速度不应太高(以2000~3000rpm为宜),否则极易引起溶血。
4.补体最好采用3只以上的豚鼠混合血清,并以新鲜为最佳,如一定要保存,根据笔者经验,则将其置于-20℃以下的环境中,可保存3个月左右。
避免冻融。
5.试验前应对溶血素和补体的效价进行测定,找出最合适的浓度,否则程序2的结果会出现混乱。
新鲜补体一般作1∶30稀释。
6.试验过程中的离心速度不要太高,否则凝集的红细胞不易打散。
7.水浴温度不能高于37℃。
8.溶血素和补体可用0.02%叠氮钠防腐。
实验四免疫标记技术
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