工业分析与商品检测翻译.docx
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工业分析与商品检测翻译.docx
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工业分析与商品检测翻译
亲水相互作用色谱−质谱联用法测定人尿中雌激素结合物
Abstract摘要
Wereportahydrophilicinteractionliquidchromatography(HILIC)separationwithtandemmassspectrometry(MS)detectionmethodforanalysisofsevenurinaryestrogenconjugates.HILICseparationemployingamobilephasewithhighorganicsolventcontentresultedinenhancedelectrosprayionizationefficiencyandMSsensitivitycomparedwithreversed-phase(RP)LC−MSmethods.Solid-phaseextraction(SPE)wasusedtofurtherimprovethelimitofdetectionandtoeliminateinterferencesfortheanalysisofurinesamples.Nohydrolysisorderivatizationwasrequiredinthesamplepretreatment.ThisSPE/HILIC−MS/MSmethodprovidedlimitsofquantification(LOQsatS/N=10)forthesevenconjugatesrangingfrom2to1000pg/mLwithonly1mLofurinesample,representinganimprovementof1orderofmagnitudeovertheRPLCtandemMSmethodspreviouslyreported.Thismethodprovidedalineardynamicrangeof3ordersofmagnitude,recoveryof92−109%,intradayaccuracyof84−109%,intradayprecisionof1−14%,interdayaccuracyof80−111%,andinterdayprecisionof1−22%.Wehavesuccessfullyappliedthistechniquetodeterminethesevenestrogenconjugatesinurinesamplesofapregnantwomanandfounduniqueconcentrationchangesofsixestrogenconjugatesatdifferentstagesofpregnancywhiletheconcentrationofestriol-3-glucuronide(E3-3G)remainedconstant.Wefurtherstudiedtheprofilesofindividualestrogenconjugatesinbreastcancerpatientsbeforeandaftertreatmentandfoundpatient-dependenteffectsofaromataseinhibitortreatmentonestrogenphase-IImetabolism,whichhavenotbeenreportedpreviously.ThisstudydemonstratesthepotentialclinicalapplicationoftheHILIC−MS/MStechniqueforsensitivemonitoringofthechangesofurinaryestrogenconjugatesinaclinicalsetting.
我们报道了一个用亲水相互作用色谱(HILIC)分离,质谱联用(MS)检测七种尿雌激素的结合物的分析检测方法。
HILIC分离采用具有高的有机溶剂含量的流动相,使电喷雾离子化的效率和MS的灵敏度相比反相(RP)LC−MS方法增强。
固相萃取(SPE)被用来进一步提高检测限并消除尿液样本的分析干扰,没有水解或者衍生化的样本需要进行样品预处理。
这SPE/HILIC−MS/MS方法提供了仅1毫升的尿液样本中从2到1000皮克/毫升范围的七种结合物的定量限(定量限在S/N=10),说明对先前报道过得一个反相高效液相色谱串联质谱方法1个数量级的改进。
本方法的3个线性动态范围:
回收率为92−109%,日内准确度为84−109%,日内精确度为1−14%,日间准确度为80−111%,日内精确度为1−22%。
我们已经成功地地将此技术应用在孕妇尿液样本中7种雌激素结合物的检测,并发现六种雌激素结合物在不同阶段的妊娠期独特的浓度变化,而雌三醇-3-葡萄糖醛酸(E3-3G)的浓度保持不变。
我们进一步研究了在乳腺癌患者治疗前和治疗后个别雌激素结合物的形态变化,发现关于芳香化酶抑制剂治疗雌激素II相代谢对患者的影响没有被报道过。
这项研究表明用HILIC−MS/MS技术监测尿中雌激素结合物的敏感变化在临床应用中的可能性。
Estrogensplayimportantrolesinthedevelopmentandmaintenanceofsecondarysexualcharacteristics,pregnancy,andlong-bonematuration.Theyalsohavebeenfoundtobeassociatedwiththedevelopmentofbreastcancer.Conjugationtosulfateandglucuronideisoneofthemajormetabolizingpathwaysoftheestrogens,andtheseconjugatesareexcretedmainlythroughurine.Freeestrogensinurineusuallyoccuratextremelylowlevelsandarenotdetectable.Estrogenmetabolismvariessignificantlyfrompersontoperson,1suggestingthatindividualprofilesofestrogensandtheirmetabolitesmayprovideinformationonvariationsinestrogenmetabolismandcancerrisk.Theaccuratemeasurementoftheseestrogenconjugatesmayfurtherthestudyoftherolestheyplayinestrogen-relatedphysiologicalprocesses.
雌激素在发育、维持第二性特征、妊娠,和骨成熟方面起着重要的作用。
他们也已被发现与乳腺癌的发病有联系。
硫酸盐与葡萄糖醛酸结合是雌激素主要的一种代谢途径,这些结合物主要是通过尿液排出体外。
尿中游离雌激素通常在极低的浓度并没有检测到。
人与人之间雌激素代谢变化明显不同,这表明雌激素及其代谢产物的特俗形态可能会提供关于雌激素代谢和癌症风险变化的信息。
对这些雌激素结合物精确测量可能会进一步在雌激素有关的生理过程研究中发挥作用。
Anumberofanalyticalmethodshavebeenusedtodetermineestrogens.Immunoassayshavebeenwidelyusedforthedeterminationofestrogensinbiologicalmatrixesbecauseoftheirsensitivityandhigh-throughputcapabilityforclinicalanalysis.2-4However,thesemethodssufferfromcross-reactionsduetothesimilarstructuresoftheestrogens.Gaschromatography/massspectrometry(GC/MS)coulddetermineindividualestrogenswithsensitivityandselectivity.5-8However,becauseestrogenmetabolitesarepolarandhavelowvolatility,multiplestepsincludinghydrolysisandderivatizationarerequiredforGC/MSanalysis.Theseproceduresaretime-consuming,labor-intensive,andmayintroduceartifactsandthusarenotpreferredinclinicalanalysis.High-performanceliquidchromatography(HPLC)hasbeenusedforthedirectdeterminationofestrogensandtheirmetabolites.HPLCwithelectrochemicaldetection(HPLC-ECD)hasbeenusedtodetermineestrogensandtheirmetabolitesinanimalurine9andhumantissues.10However,ECDcouldnotprovideenoughsensitivityforclinicalanalysisandusuallysufferedfromsignificantbackgroundinterferenceduetothecomplexityofthebiologicalsamples.Recently,HPLC−MSmethodshavebeendevelopedforanalysisofestrogensand/ortheirmetabolitesinbiologicalsamples.11-17Thesestudiesreporteddirectanalysisofestrogens11oranalysisafterderivatizationwithtoluenesulfonhydrazide12,13ordansylchloride.14-17Totalestrogenswereoftenmeasuredafterhydrolysisoftheconjugates,12,13,16,17andtotalconjugateswereobtainedbysubtractingthefreeestrogensfromthetotal.17Thisapproachcouldnotdeterminethelevelsandchangesofindividualconjugatesandpositionalisomers.12,13,16,17Forexample,estriol-3-glucuronide,estriol-16-glucuronide,andestriol-3-sulfatewouldallberecognizedasestriolafterhydrolysis.Inaddition,thehydrolysisofsomeestrogenmetabolitesmaybeincompleteandnonspecific.18
许多分析方法已经被用来检测雌激素。
免疫测定法因其灵敏、快速已被广泛用于在生物基质雌激素测定的临床分析。
然而这些方法因相似结构的雌激素导致交叉反应。
气相色谱/质谱联用法(GC/MS)可以测定单独的雌激素的敏感性和选择性。
然而,由于雌激素代谢产物具有极性和低波动性,GC/MS分析需要包括水解和衍生等多个步骤。
这些程序费时,费力并可能引入工件,因此不是临床分析的首选。
高效液相色谱法(HPLC)已用于雌激素及其代谢产物的测定。
高效液相色谱电化学检测法(HPLC-ECD)已被用来确定雌激素和动物尿液和人体组织代谢产物。
然而它们的代谢物,ECD不能在临床分析上提供足够的灵敏度,并且经常受到生物样品复杂性的背景干扰。
最近,高效液相色谱法−MS方法已被开发用于生物样品中的雌激素和/或其代谢产物分析。
这些研究报告直接分析雌激素或分析用甲苯-4-磺酰肼与丹磺酰氯衍生化后的产物。
总雌激素的计算一般用其水解的结合物加上所有去除游离雌激素结合物的量。
这种方法可以不测定其个体的结合物和位置异构体的含量与变化量。
例如,雌三醇-3-葡萄糖醛酸,雌三醇-16-葡萄糖醛酸,和雌三醇-3-硫酸盐水解后被认作雌三醇。
此外,一些雌激素水解代谢产物可能是不完整且非特异性的
Severalstudieshavedevelopedreversed-phase(RP)LC−MS/MSmethodsforthedirectdeterminationofestrogenconjugates.19-24ZhangandHenion20reportedRPLC−MS/MSdeterminationofthreeendogenousestrogensulfatesandtwosyntheticestrogenconjugatesinhumanurine,andafewotherstudiesreportedseveralestrogenglucuronidesandsulfatesinurine19,22orenvironmentalsamples.21-24Tothebestofourknowledge,allthesemethodsusedRPLCseparationwithamobilephasecontainingasmallamountoforganicsolventinwaterinordertoretainandseparatethehighlypolarestrogenconjugates.
一些研究已经开发了反相(RP)LC−MS/MS直接测定雌激素结合物的方法。
张和Henion报道过用反相高效液相色谱−MS/MS法直接测定方法的测定人尿中三种内源性雌激素硫酸盐和两种合成的雌激素结合物,其他一些研究报道过尿或环境样品中多种雌激素葡萄糖醛酸和硫酸盐的检测。
据我们所知,所有这些方法都是用含有少量的有机溶剂的水作为流动相的反相高效液相色谱法来分离极性雌激素结合物。
Toobtainhigh-efficiencyelectrosprayionization(ESI)intheLC−MS,amobilephasecontainingahighproportionoforganicsolventispreferred.Hydrophilicinteractionliquidchromatography(HILIC)usesahigh-organic−low-aqueousmobilephaseandapolarstationaryphasetoretainandseparatepolarcompounds.HILICoffersseveraladvantages,suchasenhancedsensitivityinESI-MS,25,26higherspeedduetothelowerviscosityofthemobilephasecomparedtothatofstandardRP,27anddirectinjectionofthesolid-phaseextraction(SPE)eluteontotheseparationcolumnwithoutreconstitution.28
为了在LC−MS中获得高效的电喷雾电离(ESI),含高比例的有机溶剂作为流动相是首选。
亲水作用色谱(HILIC)使用一个高有机低含水的流动相,极性的固定相来保留和分离极性化合物。
HILIC提供了几个优点,如相比标准的反相固相萃取和直接的固相萃取(SPE),ESI-MS高速度采用较低粘度的流动相,洗脱到没有重建的分离柱使灵敏性增强。
Theobjectiveofthisstudyistodevelopamethodthatcandirectlydetermineurinaryestrogenmetabolites,mainlyestrogensulfateandglucuronideconjugates,withouthydrolysisorderivatization.WecombinetheadvantagesofHILICseparationwithESI-MS/MSdetectiontoachieverapidandhighlysensitiveanalysisofurinaryestrogenconjugates.
本研究的目的是开发一个可以直接测定尿雌激素代谢物的方法,主要是没有水解或衍生的雌激素硫酸盐和葡萄糖醛酸结合物。
我们结合HILIC分离及ESI-MS/MS检测的优点实现尿雌激素结合物快速和高度敏感的分析。
Figure1Structuresofthesevenestrogenconjugates.
ExperimentalSection实验步骤
Materials.Estrone-3-sulfate(E1-3S),estradiol-3-sulfate(E2-3S),estrone-3-glucuronide(E1-3G),estradiol-3-glucuronide(E2-3G),andestriol-16-glucuronide(E3-16G)werepurchasedfromSigma(St.Louis,MO);estriol-3-sulfate(E3-3S)andestriol-3-glucuronide(E3-3G)werepurchasedfromSteraloids(Newport,RI).ThechemicalstructuresoftheseanalytesareshowninFigure1.Theinternalstandard(IS),androsteroneglucuronide-d2,wasobtainedfromCDNIsotopes(Pointe-Claire,QC,Canada).Optima-gradewater,HPLC-gradeacetonitrileandmethanol,analytical-gradeammoniumacetate,ammoniumhydroxide,aceticacid,andphosphoricacidwereobtainedfromFisherScientific(FairLawn,NJ).Estrogen-freeurinewaspreparedfromhumanurine(GeminiBio-Products,WestSacramento,CA)byshakingwithactivatedcharcoalfor30minatroomtemperature.
材料:
雌酮-3-硫酸(E1-3S),雌二醇-3-硫酸盐(E2-3S),雌酮-3-葡萄糖醛酸(E1-3G),雌二醇-3-葡萄糖苷酸(E2-3G),和雌三醇-16-葡萄糖醛酸(E3-16G)购自Sigma(St.Louis,MO);雌三醇-3-硫酸盐(E3-3S)和雌三醇-3-葡萄糖醛酸(E3-3G)购自Steraloids(Newport,RI)。
这些分析物的化学结构如图1所示。
内部标准(IS),雄酯酮葡萄糖醛酸-d2,从CDN同位素获得(Pointe-Claire,QC,Canada)。
优化级水,高效液相色谱级乙腈和甲醇,分析级醋酸铵,氢氧化铵,乙酸,和磷酸是从FisherScientific获得(FairLawn,NJ)。
通过振动与活性炭在室温下的30分钟内从人尿中制备了无雌激素的尿(GeminiBio-Products,WestSacramento,CA)。
PreparationofStockandCalibrationStandards.StocksolutionsoftheanalytesandIS(200μg/mL)werepreparedwith1mgofeachcompoundin5mLofmethanolinambervials;thesolutionswerestoredat−20°C.Workingstandardsolutionsoftheanalyteswerepreparedat5,1,0.1,and0.01μg/mLbydilutingthestocksolutionswithmethanol.TheISof0.5μg/mLwasused.CalibrationsolutionsconsistedofappropriateamountsoftheanalytesandISinestrogen-freeurine.ForE1-3S,E2-3S,E3-3S,E1-3G,andE2-3G,thecalibrationsolutionsrangedfrom0.002to10ng/mL,andthreelevels(low,medium,andhigh)ofth
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