紫外线诱变改善酵母菌表面性质研究毕业作品.docx
- 文档编号:15231409
- 上传时间:2023-07-02
- 格式:DOCX
- 页数:19
- 大小:46.60KB
紫外线诱变改善酵母菌表面性质研究毕业作品.docx
《紫外线诱变改善酵母菌表面性质研究毕业作品.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《紫外线诱变改善酵母菌表面性质研究毕业作品.docx(19页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
紫外线诱变改善酵母菌表面性质研究毕业作品
毕-设
业-计
环境工程
紫外线诱变改善酵母菌表面性质研究
EffectsofUltravioletmutagenesisoncellSurfacecharacteristicsofyeast
摘 要
摘要:
酵母菌细胞表面性质影响酵母菌在废水处理系统中的效果,本研究通过对O2、G1两株酵母菌在30W的紫外灯下进行不同时间的照射诱变,研究紫外诱变对于酵母菌细胞表面性质的影响。
研究结果表明,O2、G1菌株的表面性质得到不同程度的改善。
O2菌株在紫外线照射10s的条件下,疏水性改善最大,提高了19.10%,O2菌株在紫外线照射20s的条件下,乳化能力改善最大,提高了53.85%;G1菌株在紫外线照射20s的条件下,疏水性和乳化能力均得到了最大改善,分别提高了18.40%和43.75%。
而紫外线诱变对O2、G1菌株的絮凝性影响不明显。
关键词:
酵母菌;疏水性;絮凝性;乳化能力;紫外诱变
EffectsofUltravioletmutagenesisoncell
Surfacecharacteristicsofyeast
Abstract
Abstract:
Cellsurfacecharacteristicsofyeastaffecttheeffectofyeastinthewastewatertreatmentsystem.Twostrains(O2andG1)wereteeatedbyUVradiationunderthe30WUVlampfordifferenttime,theeffectsofUltravioletmutagenesisoncellsurfacecharacteristicsofyeastwereinvestigated.Theresultsshowedthat,thecellsurfacecharacteristicsofO2andG1strainscanbeimprovedtovaryingdegrees.WhenstrainO2wasexposedunderUVradiationfor10s,thehydrophobicitywasofthemostsignificantimprovement.Thischaracteristicincreasedby19.10%.WhenstrainO2wasexposedunderUVradiationfor20s,theemulsifyingcapacityofitwasofthemostsignificantimprovement,whichincreasedby53.85%.WhenstrainG1wasexposedunderUVradiationfor20s,thehydrophobicityandemulsifyingcapacityofitwerebothimproveddrasticallyt.Thesecharacteristicsrespectivelyincreasedby18.40%and43.75%,respectively.WhiletheeffectofUltravioletmutagenesisontheflocculabilityO2andG1strainswasnotsignificant.
Keywords:
yeasts;hydrophobicity;flocculability;emulsifyingcapacity;UVradiation
1引言
1.1紫外线诱变技术概况
1.1.1紫外线简介
紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线,波长范围为136~390nm,即1360~3900Å。
它是一种非电离辐射,紫外线波长虽然比较宽,但是诱变有效范围仅是200~300nm,其中以260nm效果最好。
所以能引起杀菌或诱变,主要是紫外线的作用光谱与核酸的吸收光谱一致,所以DNA很容易受到紫外线的影响。
1.1.2紫外线诱变机理
紫外线被DNA吸收后引起突变的原因,有的是DNA与蛋白质的交联,有的是胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用,有的是DNA链的断裂,还有的是形成嘧啶二聚体。
而形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。
使DNA分子产生嘧啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接[1],是目前研究的较清楚的一个紫外线的作用。
二聚体出现会减弱双键间氢键的作用,并引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡。
二聚体的形成,会妨碍双链的解开,因而影响DNA的复制和转录。
紫外辐射可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等[2]。
微生物在正常生长情况下进行DNA复制时,首先DNA双链解开成为单链,然后两条单链各自与细胞内游离的碱基互补配对形成新链。
如果此时双链之间有嘧啶二聚体存在,则因在一条链上出现嘧啶二聚体,则会影响到此处复制过程中碱基的正常配对。
因此,会使该处基因所表达出的形状出现异常,形成变异。
1.1.3紫外线诱变技术的应用情况
紫外线是一种使用最早、沿用最久、应用最广、效果明显的物理诱变剂。
它的诱变率高,而且不易回复突变。
在工业微生物育种史上曾经发挥过极其重要的作用,迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一。
齐秀兰等[3]以妥布霉素产生菌黑暗链霉菌ATCC17920为出发菌株,经紫外线处理,获得一株产量较高且稳定的菌株UV259,其效价比原株提高92.3%。
周建琴等[4]用康乐霉素(K2C)产生菌的自然突变株ST291为出发菌株,采用UV诱变和自然分离纯化的方法,筛选出1株突变株U102S24。
发酵条件优化后,5吨罐上K2C效价比ST291提高460多倍。
王筱虹等[5]用UV照射红霉素产生菌红色链霉菌的原生质体,得到比对照菌株效价提高225.8%的高产菌株。
值得注意的是,白兰芳等[12]以紫外线、光复活处理西罗莫司产生菌,得到正变株UV28261的效价较出发菌株高2~3倍,且紫外照射后,光复活处理比暗修复处理的正变率高得多,这与UV处理菌种后必须暗修复的传统观点恰恰相反。
1.2酵母菌在废水处理中的应用
1.2.1酵母菌
酵母菌是一种单细胞真菌,酵母菌主要分成两类:
(1)发酵型酵母,是一种只能利用六碳糖进行酒精发酵的酵母;大部分酵母菌是属于此类;
(2)氧化型酵母,它包括假丝酵母、球拟酵母、汉逊酵母等,这类氧化型酵母菌正是水处理所利用的重点对象;因为它能利用多种有机物(简单糖、有机酸、醇等),有的酵母菌种能利用复杂化合物,因为这类酵母菌体内含有特殊的氧化分解酶。
所以酵母菌具有很强的代谢能力,在某些条件下还可以凝聚沉降,由于其菌体较大,易于沉降,可以像活性污泥工艺一样运行和管理;另外,它们在快速分解有机污染物的同时,能获得酵母蛋白,既消除了环境污染,又进行综合利用,形成良性的生态循环,为造福人类作出有益贡献[6]。
1.2.2工业用酵母菌的分类
工业上常用的酵母菌有以下几种:
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、卡尔斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、异常汉逊氏酵母(Hansenulaanomala)、球拟酵母(Toruiopsis)、假丝酵母(Candida)、毕赤氏酵母(Pichia)、红酵母(Rhodotorula)、棉病针孢酵母(Nematsporagossypii)、白地霉(Geotrichumcandidum)。
1.2.3酵母菌菌株的筛选
酵母菌是广泛存在于石油污染环境中的一大类真菌,具有耐酸、耐高渗透压、生长快、代谢效率高的特点。
研究发现,相比于细菌酵母菌对某些难降解物质及有机物质具有较强的分解能力。
并且在降解强疏水性物质如PAH时,酵母菌相对其他微生物具有较强的优势。
因此,想要得到好的废水处理效果,酵母菌菌株的筛选是很重要的。
许多研究者在进行酵母菌处理废水实验之前都是经过了精心挑选才选定菌种投入实验的。
汪严明从冀东油田钻井现场采集的受钻井废水污染的土壤样品中筛选到两株具有降解石油烃的能力的酵母菌(Wickerham-ielladomercqii和Candidaboidinii)[7]。
实验室选用热带假丝酵母(O2和G1菌株)进行此次实验。
1.2.4酵母菌在废水处理中的应用
酵母菌在很久以前就得到了应用,早在几千年前,人类就开始用酵母发酵面包和酒类,在发酵面包和馒头的过程中面团中会放出二氧化碳。
随着人类对酵母菌特性的认识不断加深,人类对酵母菌的开发和利用也日趋全面和深入,并开发出以酵母菌为核心技术的新型污水处理新技术,该技术是集污水处理、能源回收等多功能为一体的污水综合处理技术,全方位体现了可持续发展的思想。
利用酵母菌处理废水可以追溯到第二次世界大战时期,在德国等一些国家,由于蛋白质大量缺乏,利用石油特别是有机废料如酒精废水、糖蜜废水生产单细胞蛋白(SCP)的工作受到一定程度的重视,生产也形成了一定的规模。
到了20世纪70年代,日本就有人进行了利用酵母菌处理废水的探索性研究。
从日本新兴起来的使用酵母菌进行污水处理,比传统的活性污泥法工艺具有一定的特异性,效率是活性污泥法工艺的8~10倍。
到了90年代,日本就成功地实现了酵母菌废水处理技术的工程应用。
其一制油厂利用酵母处理高含油废水,对于平均含油量达11900mg/L的废水,除油率可达99%[8]。
日本西原环境卫生研究所把酵母菌处理定位为高浓度有机废水的前处理技术,提出了酵母菌技术与活性污泥技术组合的独特工艺,该工艺现已成功应用于油脂加工、海产品加工以及制酱等许多食品加工废水的处理工程中。
目前,日本已建成了近50套使用该工艺的处理装置,用于处理含油废水、水产品加工废水、发酵工业废水、制酱废水等。
此外,通过在反应器中接入功能菌株能增加目标底物的降解,降低其毒性[9-10]。
同时也可以缩短降解时间,酵母已被成功应用于处理高浓度含油废水以及石油的脱蜡等[11-13]。
酵母菌作为废水处理中非常珍贵的菌种资源,它具有良好的耐渗透压、耐酸和代谢效率高等优点,有关数据显示,某些酵母菌能在水的活度值为0.60~0.70时生存,酵母菌对某些难降解物质及有机毒物具有较强的分解能力。
而且它还为含有高氨氮、高硫酸根离子的高浓度有机废水的处理提供了较多的手段和方法。
此外,酵母菌的应用越来越广泛,逐渐被利用到更多加工及养殖行业的废水处理中,包括工业乙醇生产、沙拉油制造业、橄榄油加工行业以及养猪场废水的处理[14-16]。
但是在国内,利用酵母菌的废水处理技术还不够成熟,尚处于研究阶段,基本停留在生产单细胞蛋白的基础上。
从1998年开始国内着手进行有关酵母菌处理技术的研究工作,目前已经从色拉油加工废水、味精废水、油田废水、染料废水等环境中筛选出了一批酵母菌,有关色拉油加工废水、味精废水的酵母菌处理研究已经取得了一定的进展[17]。
众多工业及废水处理实例证明,酵母菌污水处理系统比驯化后的活性污泥法工艺无论是在反应速率还是污染物去除效率方面都具有很大的优势,所以酵母菌污水处理技术是值得推广的。
酵母菌污水处理技术作为一种可持续发展的技术,必将会得到越来越多的应用。
此项污水处理技术不仅能大大改善水质,将大部分有机污染物转化成细胞蛋白,而不是CO2,而且与此同时产生的细胞蛋白也是人类所难得的宝贵资源,而不是剩余污泥。
同时酵母菌对环境条件的要求相当宽松,其优越性远远超出了传统污水处理工艺。
1.3研究的目的与意义
吕文洲等人比较系统地分析了影响酵母菌在色拉油废水处理系统中稳定性的各种因素,发现酵母细胞的疏水性是该高含油废水处理系统选择优势菌的最重要因素,而细胞是否具有乳化作用是影响菌株能否在处理高含油废水中处于优势地位的另一个重要因素,同时,酵母菌的絮凝性、生长速度等因素也可能不同程度地影响着优势菌的选择。
一些研究表明,当疏水性物质以水包油的乳化形式在水中存在时,其表面面积增加,微生物可利用性也会上升。
乳化剂属于高分子量表面活性剂,通过乳化或增溶作用可促进有机物的溶解或分散,增大有机物与降解菌细胞的接触面积,提高其可利用性,最终导致其生物可降解性的上升。
酵母菌株的乳化能力对于其在生物强化体系中的稳定性可能起到重要的作用。
因此,利用紫外线对相关酵母菌菌株进行照射,使其诱变以得到疏水性好、乳化能力强、絮凝性好的菌株,此类优势酵母菌能够进一步提高废水中的有机物降解速率以及其去除率,从而能够取得更好的废水处理效果。
此类酵母菌株不仅能够有效提高废水中的COD去除率,还能产生能被人类用作资源的细胞蛋白。
2材料与方法
2.1实验仪器与试剂
2.1.1实验仪器
1、基本实验仪器:
烧杯、容量瓶、移液枪、玻璃棒、硬质试管、锥形瓶、量筒、玻璃比色皿、离心管、培养皿等;
2、BS224S电子天平;
3、PHS-3C精密pH计;
4、LDZX-50KDS立式压力蒸汽灭菌器;
5、HZQ-C空气浴振荡器;
5、BSC1500Ⅱ-A/B生物安全柜;
6、philips紫外线灯管(30W);
7、7200型可见光分光光度计;
8、TBL-40B离心机。
2.1.2主要试剂
1、YPD培养基:
10g蛋白胨、10g牛肉膏、6g酵母膏溶于1000mL水中,pH调节至5.5,使用前经120℃灭菌20min;
2、YPD固体培养基:
葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,琼脂2%,蒸馏水配制,自然pH值,使用前经120℃灭菌20min;
3、0.2mol/LNaAc溶液:
称取1.6047gNaAc放入100mL容量瓶中,加水定容至100mL;
4、0.2mol/LHAc溶液:
量取2.88mL冰乙酸倒入250mL容量瓶中,加水定容至250mL;
5、醋酸-醋酸钠缓冲液:
取配好的溶液(3)45mL,溶液(4)205mL于1000mL的容量瓶中,加水定容至1000mL,调节pH为4.0;
6、0.4mol/LNaAc溶液:
称取3.2094gNaAc放入100mL容量瓶中,加水定容至100mL;
7、0.4mol/LHAc溶液:
量取5.76mL冰乙酸倒入250mL容量瓶中,加水定容至250mL;
8、醋酸-醋酸钠缓冲液:
取配好的溶液(6)50mL,溶液(7)200mL于1000mL的容量瓶中,加水定容至1000mL,调节pH为3.0;
9、0.001mol/LCaCl2溶液:
称取0.111g无水氯化钙,溶于蒸馏水中,移至1000mL容量瓶中,加水定容至1000mL,调节pH为4.0;
10、三氯甲烷-甲醇萃取液:
各量取50mL的三氯甲烷和甲醇后混合均匀,储存于棕色试剂瓶中;
11、0.9%生理盐水:
称取9gNaCl溶于蒸馏水中,移至1000mL容量瓶中,加水定容至1000mL备用;
12、正十六烷:
分析纯(AR),实验室购买。
2.2实验方法
2.2.1酵母菌的培养及筛选
从实验室原有的斜面培养基中选出五个菌株,分别为O2、G1、O3i、W1、O5,将这五个菌株分别接种到无机盐培养基中,无机盐培养基需预先灭菌并向其中加入2mL食用油。
放入HZQ-C空气浴振荡器中,28℃,175rpm下摇瓶培养2d。
取出锥形瓶,静置2h后观察,O2、G1菌液出现明显乳化现象。
因此,本次实验选取O2、G1为实验菌株。
从斜面培养基中分别接取一环O2、G1酵母菌至预先灭菌过的100mLYPD液体培养基中,再放入HZQ-C空气浴振荡器中,28℃,175rpm下摇瓶培养2d。
2.2.2酵母菌的疏水性测定[18]
O2、G1酵母菌菌株YPD液体培养基中培养获得的48h菌株,每个菌株的菌液取45mL于离心管中,放入TBL-40B离心机中,离心机的参数设置为3000rpm,离心三分钟后倒去上清液,加入醋酸-醋酸钠缓冲液至40mL再次离心,离心三分钟后再次倒去上清液,并再加入醋酸-醋酸钠缓冲液40mL进行离心。
将得到的细胞培养物悬浮于絮凝缓冲液中,调节细胞培养物的浓度使得悬浊液的吸光度OD620=2,接着取出4mL悬液于10mL的带帽小试管中,用移液枪吸取1mL正十六烷加入小试管中,放在振荡器上漩涡振荡60s(振荡30s后间歇5s,再继续下一个30s),两相分离5分钟后,用移液枪取出下层的水相于玻璃比色皿中在7200型可见光分光光度计上读出OD620,并记录下数值。
疏水性计算为:
粘附%
。
(A0为初始吸光度,A1为最后吸光度)。
2.2.3酵母菌的絮凝性测定[19]
O2、G1酵母菌菌株YPD液体培养基中培养获得的48h菌株,每个菌株的菌液取45mL于离心管中,放入TBL-40B离心机中,离心机的参数设置为3000rpm,离心三分钟后倒去上清液,加入40mL去离子水振荡使粘附在离心管壁的细胞培养物完全溶于水中,放入离心机中离心三分钟后取出倒去上清液,如此清洗两次后,将得到的细胞培养物悬浮于絮凝缓冲液中,调节细胞培养物的浓度使得悬液的OD620=2,接着取4000微升到比色杯中,漩涡混合20s,立即翻转5次,置于7200型可见分光光度计上每隔10-30s读取OD620值,0min和20min时测定菌体悬浮液的OD620分别记作D0和D1。
絮凝百分率计算为:
絮凝%=
。
2.2.4酵母菌的乳化能力测定[20]
乳化剂的量(g/L)定义为每升废水处理液中所产生的乳化剂的质量;菌体细胞产生乳化剂的量(
菌体)定义为每100个活菌落所产生的乳化剂的量。
乳化剂粗提取:
取一定量废水处理液,放入离心机,3000rpm离心四分钟,取出离心管去上层水样约50mL,用25mL的三氯甲烷-甲醇萃取液萃取2min,萃取3次,初步分离得到生物乳化剂。
乳化力测定:
将初步分离得到的乳化剂以15mg溶于2mL蒸馏水中进行稀释,然后取稀释液2mL于10mL的小试管中,加2mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.0)及1mL正十六烷,再将混合液放在漩涡振荡器上强烈振荡后静置10min,然后在540nm下于7200型可见光分光光度计上测定溶液的吸光度值,吸光值乘以稀释倍数即可代表乳化能力。
2.2.5紫外线处理酵母菌细胞[21]
紫外线诱变辐射条件:
1、紫外灯功率:
30W;
2、照射距离:
30cm;
3、照射环境温度:
25℃。
处理:
将诱变所需的仪器设备在灭菌操作台上灭菌,紫外灯打开预热30min。
紫外灯预热期间,用移液枪各吸取0.5mL含有O2、G1菌体的培养基,用无菌生理盐水分别均稀释至250mL(稀释500倍)。
UV诱变:
将菌液与无菌生理盐水混合均匀后再吸取5mL至直径为90mm的培养皿中,放在紫外灯下30cm处照射。
O2、G1两菌株均设置三个平行样。
第一批菌株照射10s,第二批照射20s,第三批照射40s,照射完毕后关闭紫外灯。
菌种再培养:
将经紫外线照射的处理样品分别划线接种到高温灭菌后的平板培养基中,并标明记号。
将培养基正放入恒温培养箱中30min后再倒置,28℃培养1d。
1d后,分别从六个平板培养基中选出出现较早、生长速率较快、形态不同的五个菌落接入经高温灭菌的100mL的YPD液体培养基中,将标记好的六个锥形瓶放入HZQ-C空气浴振荡器中,28℃,175rpm下摇瓶培养2d。
2.2.6诱变后酵母菌相关表面性质的测定
将培养2d后的六个菌株从摇床中取出,再根据相应的测定方法依次测定试验样品的疏水性、絮凝性以及乳化能力等表面性质,并记录下相关的实验数据。
3结果与分析
3.1诱变前酵母菌表面性质分析
通过将O2、G1、O3i、W1、O5五个菌株接入添加2mL的无机盐培养基培养2d后,观察培养基的乳化情况。
经对比发现,O2、G1的乳化现象明显,此类菌株较其他酵母菌菌株有更好的油脂降解能力。
因此,选取O2、G1为实验菌株,测定其诱变前的疏水性、絮凝性以及乳化能力来与诱变后的菌株表面性质进行对比。
3.1.1诱变前酵母菌的疏水性
根据既定的实验方法,进行疏水性测定后,得到O2菌株的OD620=1.345(即A1=1.345),G1菌株的OD620=1.639(即A1=1.639)。
根据疏水性计算公式:
%粘附
,可得O2菌株的粘附%=0.3275,即O2的粘附率为32.75%;G1菌株的粘附%=0.1805,即G1的粘附率为18.05%。
由O2、G1的粘附率可见,两酵母菌菌株均具有一定疏水性,且O2菌株的疏水性较G1菌株的好。
因此,这两株酵母菌在废水处理系统当中的稳定性较好,能与有机物较充分地接触,从而能在较大程度上降解有机物,降低废水中的COD含量。
图3-1酵母菌的疏水性
图3-1当中所列的分别是G1、O2、O3i、W1、O5的疏水性测定结果。
由图可见G1、O2菌株的粘附效果最佳,因此本实验选取此2株酵母菌作为实验对象。
3.1.2诱变前酵母菌的絮凝性
由絮凝性测定方法可得,O2菌株0min时菌体悬浮液的OD620=1.964,即D0=1.964,20min时的OD620=1.946,即D1=1.946;G1菌株0min时菌体悬浮液的OD620=1.984,即D0=1.986,20min时的OD620=1.971,根据絮凝百分率计算公式:
絮凝%=
,求得O2菌株的絮凝%=0.916%,G1菌株的絮凝%=0.755%。
O2、G1菌株的絮凝百分率较低,絮凝性较差。
这2株酵母菌对于废水当中有机污染物的吸附絮凝效果欠佳,对于分子量小的有机物的去除效果不是很理想。
因此,本研究试图通过紫外线诱变使2菌株的絮凝性得到改善,从而使其絮凝百分率提高。
3.1.3诱变前酵母菌的乳化能力
将乳化剂稀释至其含量为7.5g/L后,在540nm波长下O2菌体所处理废水中萃取得到的乳化剂混合液的吸光度为0.013,G1菌体所处理废水中萃取得到的乳化剂混合液的吸光度为0.016。
由吸光度值乘以稀释倍数,求算得到O2菌株的乳化能力为97.5ng/mL/100菌体,G1菌体的乳化能力为120ng/mL/100菌体。
O2、G1菌株均具有一定的乳化能力,并且G1的乳化能力强于O2的乳化能力。
因此,O2、G1酵母菌能够通过乳化或增溶促进废水中有机物的溶解或扩散,增大了有机物与酵母菌体的接触面积,可以使有机物的生物可降解性上升。
O2、G1菌株在废水处理系统中能将有机物溶解并对其进行生物降解。
O2、G1具有的疏水性和乳化能力能使废水中的有机物得到生物降解。
虽然其絮凝性较差,但是由于该性质不是酵母菌处理废水效果的主要影响因素,因此O2、G1菌株对于废水中的COD仍然有去除作用。
3.2诱变后酵母菌表面性质分析
将O2、G1菌株在紫外线下的照射时间列为下表:
表3-1不同菌株的紫外线照射时间
菌株
照射时间(s)
Time1
Time2
Time3
O2
10
20
40
G1
10
20
40
由于不同的紫外线照射时间下,菌株的致死率不同。
因此,现将不同紫外线照射时间下的菌株致死率列为下表:
表3-2紫外线照射时间对菌株致死率的影响
菌株
不同照射时间下的致死率(%)
Time1
Time2
Time3
O2
35.6
65.4
86.1
G1
37.9
64.3
84.3
从表3-2中可见,紫外线照射时间越长,酵母菌株致死率越高,且不同菌
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 紫外线 诱变 改善 酵母菌 表面 性质 研究 毕业 作品