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中药指纹图谱按的研究进展
中药材指纹图谱的研究进展
袁琴琴
菏泽学院生命科学系,山东菏泽274000
摘要:
讨论了中药材指纹图谱的研究现状、概念、特点、建立和评价方法,为指纹图谱技术在中药材上的应用提供了一定参考。
Abstract:
Theresearchdiscussthefingerprintofchinesemedicinalmaterialsofstatus,concept,characteristicsandestablishmentandevaluationmethod.Itsupplyingreferencesfortheapplicationoffingerprinttechnologyinchinesemedicinal.
关键词:
指纹图谱建立方法研究进展
Keywords:
FingerprintEstablishmethodResearchprogress
我国现有中药材品种众多,资源丰富,为了更好的控制中药材质量,确保用药安全,进一步实现中药的现代化和国际化,如何找到一个既符合中医临床传统用药习惯,又能很好的保证中药材内在特性,进而提高现行中药质量标准的技术含量,一直是人们研究的热点[1]。
随着现代分析测试技术的发展,质量控制方法已经从传统的手摸、眼观等感官检查发展到理化鉴别、显微鉴定、光谱和色谱等技术进行中药材质量控制[2-3]。
目前,中药指纹图谱技术作为中药材质量控制的方法已成为一种国际共识,在中成药生产、检验和研究过程中发挥着越来越重要的作用[4]。
1.中药指纹图谱的概念及特点
1.1中药指纹图谱的概念
中药指纹图谱是指某种中药材或者中成药经过适当的处理后,运用现代分析技术为手段对其化学成分的信息进行表征并加以描述,进而得到能够标志该中药材或者中成药特征的色谱图或者光谱图,是一种综合的、可量化的化学鉴定手段。
中药指纹图谱可以鉴别某种药材真伪或者产地的“共性”,并且可以评价这种药材或者中药材半成品的质量的稳定性、真实性以及优良性,它强调的是同一中药材的相似性,而不强调个体的唯一性[5-6]。
因此中药指纹图谱对于促进中药材的现代化发展和提高其质量具有十分重要的作用。
1.2中药指纹图谱的特点
1.2.1系统性:
是指指纹图谱中所显示出来的信息包含了这种药材的大部分成份。
1.2.2特征性:
是指指纹图谱中所显示出来的诸如保留时间,相对保留时间等信息应具有的较强的选择性。
这些信息经过综合的分析后,能够区分该中药材的优劣、来源以及判别真伪,使这一指纹图谱能够成为某一中药材的“化学条码”。
1.2.3稳定性:
是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下,即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内,以体现其通用性和实用性。
只有图谱的特征峰能保持相对的稳定,才能有效控制其样品的质量[7-8]。
3.指纹图谱的发展现状
近年来,中药质量的控制已经从化学成分的定量分析发展到整体质量评价的阶段,因此在中药质量的综合评价过程中指纹图谱的技术就起到了十分重要的作用[9]。
20世纪80年代中药指纹图谱技术就已经用于中药质量的检测,例如采用薄层色谱的方以及采用红外光谱等来制定某种中药材或者中成药的的指纹图谱[10]。
近年,随着中药现代化的深入发展,中药指纹图谱引起中药领域科研人员的极大关注[11]。
2001年在广州举行的有关指纹图谱的研讨会议起了引导作用,促使国家药品监督管理局正式将指纹图谱的研究纳入考察某一中药材质量标准的行列中[12]。
在国外,许多国家也将指纹图谱的技术作为中药质量控制的手段,日本在20世纪80年代就使用高效液相指纹图谱作为控制中药材质量的方法,在印度和美国的草药典也建立指纹图谱作为评价中药材的质量好坏的方法之一。
因此,运用中药指纹图谱的方法控制中草药质量已经被国际公认[13-16]。
4.中药指纹图谱建立的方法
4.1紫外光谱法(UV)
紫外光谱法比较适用于中药材内含有较强紫外吸收能力的物质,但是中药材化学成分复杂,紫外光谱各吸收峰叠加现象明显,特征性不足。
因此可通过导数光谱,寻找隐藏的吸收峰,从而提高紫外光谱法的特征性和分辨率[17]。
徐澜[18]等利用紫外光谱法提测定了酪氨酸的含量,结果较为满意。
4.2红外光谱法(IR)
红外光谱法是对药品鉴定的一种权威的分析技术,它的原理是利用物质的分子对红外辐射的吸收能够得到与分子结构相似的红外光谱图。
红外光谱有很高的特征性,每一个化合物都有其独特的红外光谱。
然而对中草药而言,每一种药材的成分都是非常复杂,它的红外光谱就是叠加所有化学成分的红外光谱。
傅兴圣[19]等利用红外光谱法建立了13个地点的生磁石样品的指纹图谱,结果表明13批生磁石样品的共有峰在指纹图谱上均有体现,通过夹角余弦法计算其相似度较好,可以为磁石的质量评价提供一定的依据。
4.3核磁共振指纹图谱
核磁共振方法的原理是利用中药材有效成分中特定的元素原子,用其吸收电磁的辐射进而得到的图谱就是这种药材的核磁共振指纹图谱,在色谱图中的纵坐标则为峰的强度,横坐标为吸收的频率。
这种方法所需样品量少,扫描的时间短,而且结果具有很高的重复性和稳定性[20],因此在中药指纹图谱中这种方法的应用比较广泛。
孙庆雷[21]等利用核磁共振指技术获得黄芩提取物的指纹图谱,实验结果表明此方法建立的不同批次黄芩的核磁共振指纹图谱重复性和特征性都较好,可以为黄芩鉴别真伪提供一定依据。
4.4薄层色谱(TLC)指纹图谱
薄层色谱法具有操作简便、快速分离、检测时间易于掌控等优点,是最早也是现在最普遍的一种研究中药指纹图谱的方法。
这种方法的原理是将吸附剂涂于薄层板上,使其成为一个均匀薄层,然后将供试品溶液用毛细管点样,干燥后将薄层板放入含有合适展开剂的展开槽内,以使供试品所含的成分分离,按同样的方法处理对照物,从而做出对中药材的质量评价[22-23]。
在中国药典里有很多的药材是选用薄层色谱的方法来鉴别,但是薄层板的制备,展开剂的配比比例等诸多的因素对薄层色谱检测有一定的影响,这就限制了薄层色谱方法在中药材研究中的应用[24]。
丁平[25]等利用薄层色谱法建立了灵芝三萜类化合物的薄层色谱指纹图谱,取得了比较满意的结果。
4.5高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱是以液体为流动相的,采用高压输送系统,根据不同的化学成分在流动相和固定相吸附、解吸附的能力不同而达到分离目的的一种方法。
高效液相色谱具有适用范围广、高速、高效、灵敏、重现性好的优点,并且不受样品沸点、稳定性、分子量大小的限制,因此在药物分析、食品分析、污染分析、化工分析以及生物制药领域中应用非常广泛,在中华人民共和国药典中,共有超过约400种的中药质量控制和超过600种化学合成药物应用高效液相色谱法[26-27]。
高效液相采用很多新型的检测器,其中最常见的是二极管阵列检测器,利用这种检测器可得到某种成分的三维图谱,因此这种技术更适用于分析多种复杂成分在紫外光区均有吸收的药物;另外高效液相的方法和质谱技术的联用使其灵敏度得到显著提高,这种技术使HPLC高效的分离能力与MS的高度选择性、灵敏性相结合,因此不但弥补了紫外检测的不足,而且还可以提供化学成分的结构信息,为进一步分析复杂样品的成分分析成为可能[28-29]。
基于以上的优点,高效液相色谱法己经广泛用于中药指纹图谱的建立,作为其质量控制的标准为中药材的鉴别以及质量的评价提供了更全面和可靠的依据[30]。
马金花[31]等采用了色谱柱PLATISILODS(250mm×4.6mm,5.0μm);甲醇-0.2%的磷酸水为流动相进行梯度洗脱,建立了重庆不同产地杜仲叶的HPLC指纹图谱,结果显示HPLC方法具有很好的重现性、稳定性,因此可以为控制杜仲叶的内在品质提供有效可靠的依据。
4.6GC指纹图谱
气相色谱以气体为流动相,具有高效、高灵敏、高选择性、进样量少等优点,主要用于含有挥发性成分物质的鉴别。
通常和质谱技术联用,这种联用技术不但可以区分不同中药材中挥发性成分的差异,还以鉴定被检测成分的结构,缺点是仅适用于低沸点的物质[32]。
田吉等采用GC-MS的方法建立了11批金银花药材的气相色谱指纹图谱,通过实验结果得出该方法有较好的稳定性和重复性,并对11批金银花药材进行了相似度分析,为评价金银花品质提供了一定的依据[33]。
4.7HSCCC指纹图谱
高速逆流色谱法是国际上一种新型的液-液分配的逆流色谱技术[,34],此方法不使用固相的载体做固定相,因此克服了固相载体带来的样品损失、吸附、峰形拖尾、污染等的缺点。
高速逆流色谱法具备回收率高、超载制备能力强的优点,因此特别适合用于分离极性大的化合物。
现在HSCCC技术在国内对中药材分析方面的应用还处于开始阶段,但这一技术的应用前景是非常广阔的[35-36]。
关荣琴[84]等采用高速逆流色谱技术对花椒中的生物碱进行分离,此实验选择的容积体系是乙酸乙酯-正己烷-水-甲醇(5:
5:
5:
7),并对分离出的成分通过薄层色谱分和高效液相色谱法进行检测,结果显示此方法比较适合用于成分的分离和纯化。
顾铭[37]等采用HSCCC技术分离丹参脂溶性成分,并且通过分光光度计和液质联用的技术对高速逆流方法分离出来的成分进行鉴定,实验结果显示建立中药指纹图谱时选用HSCCC法是可行的。
4.8HPCE指纹图谱
HPCE方法是电泳和色谱结合起来的一项新型高效分离的色谱技术,也是目前发展最快的一种分离技术。
它具有高柱效、速度快、进样量小、抗污能力强、前处理简单、成本低、选择性强等优点。
HPCE建立指纹图谱有很多的优点,但也存在这一定的不足,比如重现性差,谢莹等提出采用对照品校正和保留指数等方法来提高高校毛细管电泳的重现性[38]。
程伟采用高校毛细管电泳法构建了5个不同产地连钱草的的指纹图谱,结果确定这5批次连钱草药材共有峰有16个,各个样品图谱的重叠率低于60%,主要成分也不同产地的因素也有很大的差异。
而且此试验的稳定性、重复性比较好,因此可以作为控制连钱草药材质量的方法[39]。
4.9DNA指纹图谱
目前,DNA指纹图谱技术发展非常的迅速,这一方法采用的是PCR技术合成DNA片段,而不同生物样品中DNA片段数目不等、大小也不相同,利用这种差异进行鉴别所形成的指纹图谱称为DNA指纹图谱[40]。
这一技术具有类似于人指纹的高变异性、简单、稳定、多位点性的特点,因而自其诞生就引起了人们的高度重视,是中药品种鉴别中一种非常准确而又可靠的技术[41-42]。
目前通常采用随机扩增多态DNA、扩增片段长度多态性DNA、限制性内切酶片段长度多态性DNA进行中药材DNA指纹图谱的构建[43]。
李明军,杜明凤采用RAPD标记的方法,对17种淫羊藿植物的DNA指纹图谱进行分析研究,结果17种淫羊藿植物均具有各自的特有的谱带、共同拥有谱带和共同缺失的谱带,这些谱带可以为淫羊藿物种的鉴别提供准确有效的资料[44]。
5.中药指纹图谱的评价方法
如何对所得到的指纹图谱分析,继而获得最全面有价值的信息,在指纹图谱图的研究工作也是非常重要的。
中药指纹图谱两个最基本的属性是“整体性”和“模糊性”,因此对中药指纹图谱的评价时首先应从指纹图的“整体性”出发即尽可能把图谱中所包含全部信息显示出来;“模糊性”的重点是指待测样品与对照品图谱之间的相似性,而不是完全一致的去追求细枝末节。
5.1直观分析比较法
这种方法是指应用标准品与待测样品的图谱外观和所得实验数据直接比较,这种方法通过视觉直接对比、分析和判断,具有强烈的主观性,此法仅适用于干样品的定性快速鉴别或者对图谱中数据比较少的情况,但目前比较少采用此法进行指纹图谱的评价。
5.2相似度计算法
相似度计算法常用的两种方法是夹角余弦和相关系数法[45]。
夹角余弦法是将中药材的指纹图谱数据看作多维空间向量,是指指纹图谱特征变量上的变化模式的相似度,它体现一种成比例相似性的关系,可以为中药材鉴别真假相似性提供信息[46]。
王龙星等运用夹角余弦法对不同产地的11批吴茱萸的HPLC的指纹图谱进行了相似度评价,结果显示利用角余弦法能够较好的评价11批吴茱萸指纹图谱之间的相似性[47]。
夹角余弦法的计算公式如下:
相关系数法与变量的单位无关,对各个特征的变量值不敏感,特征变量的变化模式受变量值相互间的差异影响不大。
此方法是测量各个样品之间在特征变量上的相似性状的相似度,不但可鉴别样品的真伪优劣,而且可以提供一定信息的相似度[48]。
公式如下:
5.3模式识别法
模式识别(Pattemrecognition)是用机器替代人对事物进行分析、判别和描述,是从化学计量学分离出来的一种数学方法。
它的作用是识别出某个样品与其他样品之间的关系,也就是说在一定观测的基础上把某种样品划分到属于自己的模式中。
它划分的标准可以采用UV、HPLC、GC、MS等方法对样品中所含化学组成成分进行测定,然后分类[49]。
模式识别的结果是能够对未知的样品进行分类和归属,模式识别还能对无法直接测量物质隐含的性质进行辨别给定的事物或者与它相似或者相同的事物,模式识别也能够理解成是模式分类,就是把样品分几类,然后判断某种事物是属于哪一类。
模式识别可以使人们在即使影响因子非常多的情况下也能够对多种问题进行恰当的处理,通过使用计算机的技术对数据进行整理总结,找出目标与众多因子之间的特定联系。
6.中药指纹图谱的展望
目前,中药指纹图谱的技术作为评价中药材品质的最佳手段,越来越受到科研人员的重视,但是在建立指纹图谱的过程中也存在着许多不稳定的因素[50],如何减少这些因素的影响是建立相对稳定的指纹色谱有待解决的难题。
首先样品的采集地点、品种、预处理,以及采收季节等原因对中药材的化学成分都有一定的影响,因此对中药材建立规范的GAP管理就显得至关重要,例如从何进行药材的选种,采收等方面都要进行严格的规范。
其次对指纹图谱方法学考察也是建立稳定指纹图谱的必要条件。
只有尽可能消除不稳定因素,才可以保证所建立的指纹图谱具有重复性,专属性和唯一性等[51]。
中药指纹图谱用于中药材的研究还在初始的探索阶段,虽然存在着一些问题,但是随着现代分析技术的不断发展以及多学科的相互渗透等原因,中药指纹图谱将逐步能真正的反映中草药利用的安全性,在中药质量控制的领域有十分广阔的前景。
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