红曲霉中药合生元制剂中酶活力大小的分析研发.docx
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红曲霉中药合生元制剂中酶活力大小的分析研发
红曲霉-中药合生元制剂中酶活力大小的研究
摘要试验选取培养15、21和20d的成熟红曲霉-中药合生元制剂干粉和培养20d的成熟红曲霉-
中药合生元制剂湿粉作为样品,每组做3个重复,取平均值。
利用紫外分光光度法分别测定不同培养时间下
红曲霉粉中的淀粉酶活力、蛋白酶活力和纤维素酶活力。
研究结果表明:
淀粉酶活力相对较高,且略有随培
养天数增加而升高的趋势,蛋白酶活力很低,纤维素酶活力较低。
关键词红曲霉-中药合生元制剂淀粉酶活力蛋白酶活力纤维素酶活力
1材料与方法
1.1仪器
DK-8D型电热恒温水槽,上海精宏试验设备
有限公司;UV759CRT紫外可见光分光光度计,上
海佑科仪器仪表有限公司。
1.2化学试剂
可溶性淀粉溶液、pH为6.0的磷酸钾盐缓冲
液、pH为5.0的磷酸钠盐缓冲液、稀碘液、酪蛋
白溶液、0.4mol/L三氯乙酸、0.4mol/LNa
2
CO
3
、
福林试剂、1%羧甲基纤维素钠、3,5-二硝基水
杨酸、葡萄糖溶液和酪氨酸溶液。
1.3试验方法
样品选择:
A组为培养15d的红曲霉-中药合
生元制剂干粉,B组为培养21d的红曲霉-中药合
生元制剂干粉,C组为培养20d的红曲霉-中药合
生元制剂干粉,D组为培养20d的红曲霉-中药合
生元制剂湿粉,经测定D组样品含水量为29.5%。
1.3.1红曲霉-中药合生元的制作
先将山楂、红枣和山药等按照一定比例与大米
混合蒸熟备用,将250mL三角烧瓶放入高压灭菌
锅内,高压灭菌30min,取出,将蒸熟的大米平铺于
三角烧瓶底部,约4~5cm,封口,高压灭菌30min,
同时用灭菌好的无菌水配制0.2%冰乙酸待用,待
培养基冷却后,用接种环挑取耐中药的红曲霉菌株
10~12次稀释于30mL0.2%的冰乙酸溶液中,每
个三角烧瓶中接种1~1.5mL,接种量随培养基厚
度自行调整。
放入培养箱中,32℃培养14~17d,
培养好后,用玻璃棒转移至托盘中,40℃鼓风烘干
24h即可,然后粉碎制成粉末备用。
1.3.2粗酶液的制备
发酵成熟的红曲霉-中药合生元制剂,经40℃
恒温烘干后,准确称取1.000g样品,以5mL缓冲
溶液溶解,加95mL40℃温水,40℃浸提6h,以
脱脂棉过滤备用。
1.3.3淀粉酶活力测定
在20mL试管中,加入5.0mL0.5%可溶性淀
粉及1.0mL磷酸缓冲液,于40℃恒温水浴中预热
5min,然后加入1.0mL待测酶液,摇匀,准确反
应1h,取出,吸取70.0μL该反应液于3.0mL稀
碘液中,用分光光度计在660nm波长下测定其光
密度(OD)值,测定酶活力。
酶活力定义:
1g固体酶粉,于40℃及pH为
6.0条件下1h液化1g可溶性淀粉,即为1个淀粉
酶活力单位,以U/g表示。
饲料添加剂
26饲料研究FEEDRESEARCHNO.01,2013
淀粉标准曲线绘制:
分别配制质量浓度为
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的可溶性淀
粉溶液,各取5.0mL,加1.0mL磷酸缓冲液,于
40℃恒温水浴中预热5min,然后加入1.0mL去离
子水,摇匀,准确反应1h,取出,吸取70.0μL该
反应液于3.0mL稀碘液中,用分光光度计660nm
波长下测定其OD值,绘制标准曲线。
1.3.4蛋白酶活力测定
在20mL试管中,加入1.0mL待测酶液,置于
40℃水浴中预热2min,再加入1.0mL预热的2%酪
蛋白,精确保温10min,立即加入2.0mL0.4mol/L
三氯乙酸,保温20min,3000r/min离心2min,吸
取1.0mL上清液,加5.0mL0.4mol/LNa
2
CO
3
和
1.0mL福林试剂,40℃水浴保温发色20min,于
660nm下测定其OD值,测定酶活力。
酶活力定义:
在40℃,每分钟水解酪蛋白产生
1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力,以U/g表示。
酪氨酸标准曲线绘制:
分别配制质量浓度为20、
40、60、80和100μg/mL的酪氨酸溶液,各取1.0mL,
加5.0mL0.4mol/LNa
2
CO
3
和1.0mL福林试剂,
40℃水浴保温发色20min,于660nm下测定其OD
值,绘制标准曲线。
1.3.5纤维素酶活力测定
取20mL试管,加2.0mL1%羧甲基纤维素
钠,于50℃水浴中预热2~3min,加0.5mL待测
酶液,加入1mLpH5.0的磷酸钠盐缓冲液,保温
30min,取出加入2.5mL3,5-二硝基水杨酸,沸
水浴煮沸5min,冷却后,分光光度计530nm处测
定其OD值,测定酶活力。
酶活力定义:
在50℃及pH为5.0条件下,30min
水解羧甲基纤维素钠生成1μg葡萄糖的酶量,为1
个纤维素酶活力单位,以U/g表示。
葡萄糖标准曲线绘制:
分别配制质量浓度为40、
60、80、100、150、160、200、210和300μg/mL的葡
萄糖溶液,加入2mL去离子水和1mLpH5.0的磷
酸钠盐缓冲液,保温30min,取出后加入2.5mL3,
5-二硝基水杨酸,沸水浴煮沸5min,冷却后,分
光光度计530nm处测定其OD值,绘制标准曲线。
2结果与分析
2.1淀粉酶活力
淀粉标准曲线为y=3399.5x+0.0183,R
2
=
0.9974。
表1不同培养时间红曲霉粉淀粉酶活力大小
组别淀粉加入量/g淀粉反应量/g淀粉剩余量/g淀粉酶活力/(U·g
-1
)
A组0.0250.0244630.000537244.63
B组0.0250.0244130.000587244.13
C组0.0250.0244290.000570244.29
D组0.0250.0242260.000774242.26
从表1可见:
A、B和C组样品中淀粉酶活力
均在244~245U/g,处于相对较高水平,D组样品
淀粉酶活力值为242.26U/g,较其他3组活力低的
原因是由于D组样品为红曲霉-中药合生元制剂湿
粉,含水量为29.5%,造成酶活力值偏低。
淀粉酶属于一种水解酶类,是催化淀粉、糖原
和糊精中糖苷键的一类酶的总称。
广泛分布于自然
界,几乎所有微生物、动物和植物都含有淀粉酶,
是一种来源和用途都非常广泛的酶类。
淀粉酶是最
早实现工业生产并且迄今为止用途最广且产量最大
的酶制剂品种,约占酶制剂市场份额的25%,在
食品、发酵、纺织、造纸业、制药业和化学药品工
业等领域都有广泛应用,还将扩展到其他领域,所
以,测定红曲霉-中药合生元制剂中淀粉酶的含量
和活力大小,具有较为实际的应用价值,还可进一
步筛选高产淀粉酶的红曲霉菌株,为在更广泛的领
域中应用红曲霉奠定基础。
2.2蛋白酶活力
酪氨酸标准曲线为:
y=0.0166x-0.0002,
R
2
=0.9994。
表2不同培养时间红曲霉粉蛋白酶活力大小
组别OD值酶液对照值蛋白对照值蛋白酶活力/(U·g
-1
)
A组0.9030.2200.6260.172
B组0.9140.2370.6260.154
C组0.9200.2370.6260.172
D组0.7820.0970.6260.178
从表2可见:
4组样品的蛋白酶活力都很低,
几乎为零,由于培养基为大米培养基,蛋白质含量
较低,所以得出此组数据为正常值。
由于蛋白酶应用于洗涤及皮革等行业中较多,
且用量大,市场上常有供不应求的现象,当前,国
内外主要对蛋白酶高产菌株和微生物菌种进行定向
选育,目的性强,技术也很成熟,徐子渊等和郑铁
曾等都对如何提高菌体蛋白酶产量做了大量工作,
结果表明:
利用诱变育种等手段可以显著提高蛋白
酶产量,对于红曲霉-中药合生元制剂的蛋白酶产
量,是否可以通过改变培养基成分(下转第31页)饲料添加剂
饲料研究FEEDRESEARCHNO.01,201331
表6不同水平底料组成和接种量对发酵产物中植酸酶活性的影响
项目
E接种量/(mL·100g
-1
)F底物比例(棉粕∶玉米)
显著水平
13579SEM100∶090∶1080∶2070∶3060∶40SEM
植酸酶活性/
(U·g
-1
)
63.6879
aA
62.1011
aA
59.7745
aA
74.4687
aA
71.4717
aA
1.1171.7489
aA
72.9289
aA
63.2828
aA
64.2674
aA
59.2759
aA
1.11
P
E
0.0025
P
E
×P
F
0.9998
P
F
0.0052
注同表3
表7不同水平底料组成和接种量对优化发酵产物中的枯草芽孢杆菌菌数的影响
项目
E接种量/(mL·100g
-1
)F底物比例(棉粕∶玉米)
显著水平
13579SEM100∶090∶1080∶2070∶3060∶40SEM
枯草芽孢杆菌/
(10万CFU·g
-1
)
23.3217
cC
34.2333
bcBC
49.1447
bB
95.6113
aA
49.0997
bB
1.1152.9667
aA
63.922
aA
59.6777
aA
48.833
aAB
26.0113
bB
1.11
P
E
0.0225
P
E
×P
F
0.0001
P
F
0.3889
3结论
产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料发酵参数的优
化组合为14(A
3
B
4
C
1
D
3
),即温度37℃,时间周
期72h,底物初水分30%,初始pH为7.0。
底料
组成和接种量的优化结果为E
4
F
2
,即底料组成为棉
粕90%,玉米10%;接种量为7.0mL/100g。
通信地址:
新疆石河子大学北区动物科技学院
14号楼404室
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
832003
(上接第26页)
和其他手段进行筛选育种,从而得到高产菌株还有
待进一步研究。
2.3纤维素酶活力
葡萄糖标准曲线为:
y=0.0028x-0.0299,
R
2
=0.9961。
表3不同培养时间红曲霉粉纤维素酶活力大小
组别OD值
羧甲基纤维素
钠对照值
酶液
对照值
3,5二硝基水
杨酸对照值
酶活力/
(U·g
-1
)
A组1.7740.0711.7280.122.5
B组1.7690.0711.7060.131.0
C组1.7720.0711.7140.128.5
D组1.4910.0711.4380.126.0
从表3可见:
在消除了羧甲基纤维素钠、粗酶
液和3,5-二硝基水杨酸的影响后,对应葡萄糖标
准曲线,计算出的纤维素酶活力分别为22.5、31.0、
28.5和26.0U/g,可以看出,在一定范围内,随着
培养时间的延长,纤维素酶活性有升高的趋势,具
体趋势如何,有待进一步试验验证。
自然界中,纤维素类物质是一类最廉价且最丰
富的可再生资源,如果天然存在的这些纤维素可以
有效降解,在化石能源日益枯竭的今天,对解决能
源危机和环境污染等社会焦点问题具有重大的现实
意义,利用纤维素酶的水解作用水解纤维素就是一
条很好的环保无污染的利用纤维素的途径。
目前,
纤维素的微生物降解机制已经被普遍接受,但是纤
维素酶的产量和活性都不高,成本却很高,今后,
应该加强菌种选育的基础研究工作,分离和筛选出
高产纤维素酶的菌种,多菌种共同发酵的时候,更
要注意兼容性和混菌发酵效果。
3结论
试验结果表明:
在红曲霉-中药合生元制剂干
粉和湿粉中,淀粉酶活力在241~245U/g,水平相
对较高;蛋白酶活力很低,几乎没有。
纤维素酶活
力在22~31U/g,水平相对较低。
通信地址:
吉林省延吉市公园路977号延边大
学农学院动物科学系动物营养与饲
料科学教研室133000
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