蛋白复习总结.docx
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蛋白复习总结
1、蛋白质测序策略:
Ø确定蛋白质得纯度在97%以上;
Ø测定多肽链得数目;
Ø拆分多肽链;
Ø分析每一条多肽链得氨基酸组成;
Ø鉴定多肽链得N-末端与C-末端氨基酸残基;
Ø用两种以上方法把多肽链裂解成较小得肽段;
Ø测定各肽段得氨基酸序列;
Ø把各肽段拼接成完整得多肽链;
Ø确定二硫键得位置。
2、蛋白质组学得研究特点:
同一性与多样性、有限与无限、静态与动态、时间与空间孤立行为与相互作用、单一手段与多种技术、互补与互助
3、蛋白质组学研究任务
内容:
了解某种特定得细胞、组织或器官制造得蛋白质种类、明确各种蛋白质分子就是如何让形成类似于电路得网络得、描绘蛋白质得精确三维结构,揭示其结构上得关键部分,如与药物结合并且决定其活性得部位
当前任务:
发展高通量、高灵敏度、高准确性得研究技术平台
研究目得:
分离蛋白,显示差异,将表现型与功能联系起来;
寻找蛋白质之间得相互作用,动态地反映生物体所处得状态。
4、蛋白质组学研究得两种策略:
1)“竭泽法:
采用高通量得蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多得乃至全部得蛋白质。
2)“功能法”:
研究不同时期细胞内蛋白质组成得变化,如蛋白质在不同环境下得差异表达,以发现有差异得蛋白质种类为主要目标
5、蛋白质化学与蛋白质组学得不同
蛋白质化学蛋白质组学
单一蛋白质复杂混合物
全序列分析部分序列分析
强调结构与功能强调通过数据库匹配进行蛋白质鉴定
结构生物学系统生物学
6、氨基酸得分类及结构特点
1)非极性R基氨基酸Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met共8种,这类氨基酸在水中得溶解度较小;
2)极性R基氨基酸
Ø不带电荷得极性R基氨基酸Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Cys、Gly
Ø带正电荷得R基氨基酸Lys、Arg、His
Ø带负电荷得R基氨基酸Asp、Glu
7、脂肪族氨基酸:
甘氨酸Glycine、丙氨酸Alanine、缬氨酸Valine、亮氨酸Leucine
异亮氨酸Ileucine
亚氨基酸:
脯氨酸Proline含硫氨基酸:
甲硫氨酸Methionine、半胱氨酸Cysteine
芳香族氨基酸:
苯丙氨酸Phenylalanine、酪氨酸Tyrosine、色氨酸Trytophan
碱性氨基酸:
精氨酸Arginine、赖氨酸Lysine、组氨酸Histidine
酸性氨基酸:
天冬氨酸Aspartate、谷氨酸Glutamate
含羟基氨基酸:
丝氨酸Serine
含酰胺氨基酸:
天冬酰胺Asnaragine、谷氨酰胺Glutamine
8、残基:
在肽链中氨基酸之间脱去一个水分子,脱水后得残余部分叫残基(residue),因此蛋白质肽链中得氨基酸统统就是残基形式。
9、氨基酸得特性:
一般一氨基一羧基得氨基酸等电点在pH6左右,这就是由于羧基得解离程度大于氨基,故pI偏酸,碱性氨基酸pI在pH10左右,酸性氨基酸得pI在pH3左右。
氨基酸水溶液中其解离度与溶液得pH有关:
向氨基酸溶液中加酸时,羧基接受质子,使氨基酸带正电,加碱时,氨基释放质子,与OH-中与,使氨基酸带负电。
当溶液得pH=pI时,氨基酸以两性离子存在
当溶液得pH<pI时,氨基酸溶液中正离子占优势
当溶液得pH>pI时,氨基酸溶液中负离子占优势。
10、氨基酸得化学性质
与亚硝酸得反应VanSlyke定氮
与甲醛得反应氨基滴
与酰化试剂得反应氨基保护基
与二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-Cl)得反应测序
与2,4-二硝基氟苯(FDNB)得反应测序
与Edman试剂(PITC苯异硫氢酸酯)测序
α-羧基参加得反应:
1、成盐与成酯反应:
可用于羧基得保护。
2、成酰氯反应:
可用于羧基得活化。
3、脱羧基反应:
就是生成胺类得重要反应。
4、叠氮反应:
可用于羧基得活化。
11、蛋白质功能得多样性
a)催化:
大多数酶就是蛋白质。
b)调节:
如激素与反式作用因子。
c)转运:
如血红蛋白、血清蛋白、载酯蛋白、膜转运蛋白等。
d)贮存:
如种子蛋白与卵清蛋白。
e)运动:
如肌肉、微管蛋白等。
f)结构成分:
如角蛋白、胶原蛋白等。
g)支架作用:
如锚定蛋白、连接蛋白等。
h)防御与进攻:
如抗体、毒蛋白等。
i)特殊功能:
如甜蛋白、胶质蛋白等。
12、氨基酸组成得分析
a)Edman化学降解法:
用此原理已制成蛋白质序列分析仪。
若每次循环得准确度为99%,经60次循环,准确度为:
0、9960=0、54
b)降解法:
可用氨肽酶与羧肽酶,只能测出末端得几个氨基酸。
羧肽酶Y可作用于任何氨基酸,有可能以此为基础开发出新得氨基酸得顺序测定仪。
c)根据核苷酸序列推定法:
分离mRNA,经反转录测定cDNA得核苷酸序列,再用遗传密码推定氨基酸序列。
d)质谱法:
可分析微量得肽链,短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离,按荷质比分离,依次在经碰撞池被裂解成离子碎片,在第二台质谱仪中测出各个离子碎片得谱线,推算出短肽得氨基酸序列。
在蛋白质组学中应用广泛,但不能区分亮氨酸与异亮氨酸。
13、为何要进行作图分析
1)基因组计划得基本目标就是获得全基因组顺序,在此基础之上再对所获得得序列进行解读。
获取基因组顺序得主要方法就是进行DNA测序,然后再将所获取得顺序进行组装以得到完整得基因组序列。
2)基因组测序得第一步就是构建基因组图,然后将基因组区段分解后逐个测序,最后进行组装。
3)基因组作图得基本构想:
在长链DNA分子得不同位置寻找特征性得分子标记,根据标记将包括这些序列得克隆进行连锁定位,绘制基因组图,该图一旦构建好,即可着手进行全基因组测序。
14、以基因组作图为指导得2种测序策略:
1)直接鸟枪法:
首先进行全基因组鸟枪法测序,再以基因组图得分子标记为起点将鸟
枪法DNA片段进行组装。
高密度得基因组图分子标记可以检测组装得DNA片段就是
否处在正确得位置,并校正因重复顺序得干扰产生得序列误排。
这就是一种由下至上
(bottomtoup)得测序策略。
2)重叠群(contig)法:
重叠群就是指相互间存在重叠顺序得一组克隆。
根据重叠顺序得相
对位置将各个克隆首尾连接,覆盖得物理长度可达~Mbp。
在单个得重叠群中,采用
鸟枪法测序,然后在重叠群内组装。
这就是一种从上至下(uptodown)得测序策略。
15、遗传图得绘制
①有性杂交实验根据需要有计划地实施杂交方案而后进行连锁分析,如果蝇、老鼠以及玉米、水稻等动植物得遗传学实验。
②系谱分析不能进行有计划得遗传实验,只能收集家系成员得相关资料进行连锁分析,主要涉及人类以及多年生得树木等。
③DNA转移不发生减数分裂得生物,如细菌与病毒基因组得连锁分析。
16、为什么要绘制物理图?
遗传分析绘制得基因组图为何不能指导基因组计划得测序?
①遗传图得分辨率有限这一点对微生物不成问题,因为微生物基因组较小,记录成百上千次实验就能获得十分详尽得遗传图,其标记分布密度仅为数千个核苷酸。
而人类及大多数高等真核生物由于不可能获得大量得后代,只有少数得减数分裂事件可供研究,连锁分析得分辨力受到很大得限制。
因而难以达到基因组测序对基因组图得标记分辨率得要求。
②遗传图得精确性较低由于重组热点得存在使得染色体某一区段得交换频率高于其她区段,尤其就是倒位区段,由于受到交换限制,无法绘制精确得遗传图。
由于存在以上两个局限,因而在进行大规模得DNA测序之前,对大多数得真核生物得遗传图必须进行验证并利用其她得作图技术予以校正与补充。
17、常用得物理作图技术:
①限制性作图(restrictionmapping):
将限制性酶切位点标定在DNA分子得相对位置。
②依靠克隆得基因组作图(clone-basedmapping):
根据欲克隆得DNA片段之间得重叠顺序构建重叠群(contig),绘制物理连锁图。
③荧光标记原位杂交(fluorescentinsituhybridization,FISH):
将荧光标记得探针与染色体杂交确定分子标记得所在位置。
④顺序标签位点(sequencetaggedsite,STS):
通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组得DNA区段中。
18、脉冲场凝胶电泳
PFGE,pulsed-fieldgelelectrophoresis):
就是一种分离大分子DNA得方法。
在普通凝胶电泳中,大得DNA分子(>10kb)移动速度接近,在凝胶中难以形成足以区分得条带。
在PFGE中,电场不断在两种方向上(有一定夹角,而不就是相反得两个方向)变动。
DNA分子带有负电荷,会朝正极移动,相对较小得分子在电场转换后可较快转变移动方向,而较大得分子转向较为困难,因此小分子向前移动得速度比大分子快。
PFGE可用来分离从10kb~10Mb得DNA分子。
19、常用得指纹分析方法:
A限制性带型(restrictionpatterns)指纹
B重复顺序DNA指纹(repetitiveDNAfingerprints)
CSTS目录作图(STScontentmapping)
D重复DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重复顺序PCR(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)指纹。
20、STS作图原理
1)序列标签位点或STS(sequence-taggedsite,STS)就是基因组中任何单拷贝长度在100~500bp之间得DNA序列,与限制性核酸内切酶得识别序列相关联,每个基因组中仅1份拷贝,很易分辨。
2)将染色体DNA随机打断,2个标记所处得物理位置越近,位于同一片段得机率越高
3)随机打断得染色体DNA长度不一,彼此靠近得2个标记有很大得机率位于同一片段,相距较远得标记分开得机率很高。
21、作为合格得STS必须要满足2个条件:
⑴它应就是一段序列已知得片段,可据此设计PCR反应来检测不同得DNA片段中就是否存在这一顺序;
⑵STS必须在染色体上有独一无二得位置,如果某个STS在基因组中多个位点出现,则由此得出得作图数据将就是含混不清得。
22、寻找STS得常用方法:
⑴表达顺序标签(expressionsequencetag,EST)这就是一些从cDNA克隆中找到得小段序列。
EST转变成STS得条件就是:
这个EST来自单拷贝基因而非基因家族成员,后者常常含有相同或相似得序列。
⑵简单序列长度多态性(simplesequencelengthpolymorphism,SSLP)SSLP产生于重复顺序得可变排列,同一位点重复顺序得重复次数不同,表现出DNA序列得长度变化。
与RFLP不同得就是,SSLP具有多等位性(multiallelic),每个SSLP都有多个长度不一得变异体。
具有多态性并已在连锁分析中定位得SSLP具有特别得价值,因其可直接建立遗传图与物理图之间得联系。
⑶随机基因组顺序从克隆得DNA中随机测序可获得有用得序列,也可从数据库中寻找感兴趣得某些序列。
23、SAGE
特点:
1)进行转录物组研究,也就就是转录水平得研究;
2)通过快速与详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同得SAGE标签序列,从而接近完整地获得基因组得表达信息;
3)SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术得主要特点就是可用于寻找那些较低丰度得转录物,最大限度地收集基因组得基因表达信息,这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱得首选策略;
4)SAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段得细胞与组织表达图谱构建,对不同状态下基因表达水平得定量或定性比较,特别就是对疾病组织与正常组织得比较发展迅速。
理论依据:
1)来自转录物内特定位置得一小段寡核苷酸序列(9-11bp)含有鉴定一个转录物特异性得足够信息,可作为区别转录物得标签(tag);
2)通过简单得方法将这些标签串联在一起,形成大量多联体(concatemer),对每个克隆到载体得多联体进行测序,并应用SAGE软件分析,可确定表达得基因种类,并可根据标签出现得频率确定基因得表达风度(abundance)。
步骤:
a)将5μg含有oligodT(引物)得磁珠与RNA混合。
b)合成双链cDNA。
c)用NlaⅢ酶消化形成一条链末端有标签得产物。
d)将样品分成两份,连接成含有识别序列得产物,以备用BsmF1消化。
e)用MmeI切割每一个样品形成约60bp得标签。
f)延伸5秒,连接成约130bp得双链标签。
g)PCR扩增。
h)用NlaⅢ酶切130bp产物释放34bp双链标签。
i)连接片断形成串联体。
j)克隆到pZErO-1+里,并测序。
24、基因芯片得主要应用
1)基因表达检测拟南芥、酵母基因表达研究等;
2)突变检测BRCAⅠ基因外显子、CFTR基因、β-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等得突变检测等;
3)基因组多态性分析人类基因组单核苷酸多态性得鉴定及分析及人线粒体16、6kb基因组多态性得研究等;
4)基因文库作图通过确定重叠克隆得次序从而对酵母基因组进行作图。
25、生物大分子得制备得主要特点:
⑴生物材料得组成极其复杂,常含有数百种乃至上千种化合物。
⑵许多生物大分子在生物材料中得含量极微,分离纯化步骤繁多、流程长。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物得体内环境就极易失活,因此在分离过程中如何防止其失活,就就是生物大分子制备得最困难之处。
⑷生物大分子中得各种具体物质得组成比例不同。
⑸制备几乎都就是在溶液中进行得,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成得综合影响,很难准确估计与判断。
26、生物大分子得制备步骤:
⑴明确生物大分子制备得目得与要求;
⑵建立相应可靠得分析测定方法;
⑶通过文献调研与预备性实验;
⑷生物大分子制备方案得选择与探索;
⑸生物材料得破碎与预处理;
⑹目得产物得提取及进一步得分离纯化;
⑺生物大分子制备物得均一性(即纯度)鉴定;
⑻目得产物得浓缩、干燥与保存。
27、生物大分子得分离纯化方法可粗略地分类如下
⑴以分子大小与形态差异为依据得方法:
差速离心、区带离心、超滤、透析与凝胶过滤等。
⑵以溶解度差异为依据得方法:
盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀与结晶等。
⑶以电荷差异为依据得方法:
电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析与离子交换层析等。
⑷以生物学功能专一性为依据得方法:
亲与层析等。
28、生物大分子样品得早期分离纯化:
(1)特点:
①粗提取液中物质成份十分复杂;②欲制备得生物大分子浓度很稀;③物理化学性质相近得物质很多;④希望能除去大部分与目得产物得理化性质差异较大得杂质。
(2)对所选方法得要求:
①要快速、粗放;②能较大地缩小体积;③分辨力不必太高;④负荷能力要大。
(3)可选用得方法:
吸附;萃取;沉淀法(热变性、盐析、有机溶剂沉淀等);离子交换(批量吸附、胖柱交换);亲与层析;
29、生物大分子样品得晚期分离纯化:
(1)可选用得方法:
吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲与层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。
(2)要注意得一些问题:
①盐析后要及时脱盐。
②用凝胶过滤时如何缩小上样体积,因为凝胶层析柱得上样体积只能就是柱床体积得1/10~1/6,也可使用串联柱以加大柱床体积。
③必要时也可重复使用同一种分离纯化方法,如分级有机溶剂沉淀、分级盐析、连续两次凝胶过滤、离子交换层析等。
④分离纯化步骤前后要有科学得安排与衔接,尽可能减少工序,提高效率。
如吸附不可放在盐析之后,以免大量盐离子影响吸附效率;离子交换要放在凝胶过滤之前,因为离子交换层析得上样量可以不受限制,只要不超过柱交换容量即可。
⑤分离纯化后期,目得产物得纯度与浓度都大大提高,此时对于很多敏感得酶极易变性失活,因此操作步骤要连续、紧凑,尽可能在低温下(如在冷室中)进行。
⑥得到最终产品后,必要时要立即冰冻干燥,分装并写明标签,-20℃或-70℃保存。
30、蛋白质样品制备原则与纯化方法:
原则:
(1)在适宜盐浓度下,可重复溶解所有蛋白质,包括疏水性蛋白质,并使样品中得分子以分离得形式存在;
(2)避免溶解性低得蛋白质(如胰蛋白)在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出;
(3)防止蛋白质得化学修饰,包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起得修饰;
(4)排除核酸、多糖、脂类与其她干扰分子;
(5)获得得目标蛋白质应在可探测水平,有时需要去除高丰度蛋白质与不相关蛋白质。
纯化方法:
1)沉淀法:
有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法、共沉淀法
2)根据形态差异建立得方法:
透析、超滤、离心分析
3)依据电荷特性设计得分离方法:
吸附交换分离法、聚焦层析、电泳法
4)根据稳定性建立得分离纯化方法:
热变性法、酸碱变性法、表面变性法
5)根据亲与作用建立得纯化方法:
亲与电泳、免疫吸附层析、疏水作用层析、共价层析
、金属螯合层析
6)高效液相色谱分离分析法:
体积排阻色谱、离子交换色谱法、反相色谱法、高效疏水作用色谱
31、双向凝胶电泳得基本原理
双向电泳得第一向就是等电聚焦电泳,根据蛋白质得PI不同进行分离,第二向为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据分子量不同进行分离,样品经过电荷与质量两次分离后,得到等电点与分子量得信息。
32、双向电泳得分类
非变性2D-PAGE、非变性/SDS-2D-PAGE、非变性/还原/SDS-2D-PAGE、变性2D-PAGE
33、双向电泳分析中得样品制备:
1)应使所有待分析得蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。
2)防止样品在聚焦时发生蛋白得聚集与沉淀。
3)防止在样品制备过程中发生样品得抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。
4)完全去除样品中得核酸与某些干扰蛋白。
5)尽量去除起干扰作用得高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白得可检测性。
34、双向凝胶电泳得基本流程?
(1)等电聚焦:
标记胶条→样品上样及水化→置于聚焦盘内→设定IEF电泳程序→加矿物油覆盖胶面
(2)胶条平衡:
先在含有SDS、还原剂DTT但不含碘乙酰胺得平衡液中平衡,再在含碘乙酰胺得平衡液中平衡
(3)SDS-PAGE:
制胶→样品制备→加缓冲液→连接电源→电泳
(4)染色:
染色液及脱色液得配制→染色→脱色
35、双向电泳中第一向到第二向进行平衡过程得机理?
平衡buffer1:
还原(将S–S键转化为SH),DTT
平衡buffer2:
烷基化物(使每个SH均烷基化以防止S–S键得重新形成),碘乙酰胺
36、有机染料与银染
1)考染灵敏度为30~100ng,线性范围就是20倍;银染得线性范围就是40倍,灵敏度就是考染得100倍。
2)胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE得无背景染色,其极限灵敏度为8~10ng,但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析得结果。
3)胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)与/或硝酸纤维素膜上得蛋白质得染色。
4)银染得缺点就是:
对某些种类得蛋白质染色效果差,对其后得蛋白质测序与质谱分析造成影响。
5)这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。
37、预防酶自解与微生物得污染:
⑴使用较好得测序级TPCK-Trysin;
⑵在加酶使胶块吸胀后,一定要去掉多余得酶液,不要认为这样会影响酶解效率;
⑶酶解时间不宜过长,~24hr;
⑷电泳玻板、染胶得器皿等用前要清洗;
⑸所用试剂与溶液得纯度要高,以保证质谱分析得可靠性;
⑹尽量用干净得乳胶手套与洁净得EP管及Milliq水;
⑺尽量减少不必要得操作步骤,简化操作程序;
⑻要有一个洁净得操作环境。
38、胶内酶解注意事项:
⑴若样品种类较多,应将离心管编号,样品对号入管;
⑵考染方案各注释均适用银染方案;
⑶整个操作过程应注意角蛋白等得污染;
⑷佩戴一次性乳胶手套,使用洁净得离心管及Millipore水;
⑸不同公司得酶需要不同得最适得pH,因此,需调pH值。
39、样品得纯化与浓缩:
⑴操作步骤
⑵配制适当得溶液
⑶对不同质量范围得蛋白质或肽段得提取效率应事先估计
⑷注意事项:
①整个操作过程润湿体积>0、6µl(因填料为0、6µl);
②pH<4;
③整个过程不能引入气泡;
④注意流速,最好速度均匀。
40、蛋白质定量分析策略
41、定量蛋白质组学?
内容:
就是把一个基因组表达得全部蛋白质或一个复杂得混合体系中所有得蛋白质进行精确得定量与鉴定得一门学科。
通常情况就是只需对两种不同状态细胞得蛋白质进行比较,只需相对含量得变化进行准确得定量即可。
意义:
研究方法:
(1)体内标记:
Ø15N体内代谢标记:
用富含15N得介质来培养细胞,15N被渗入合成得蛋白质中,从而充当其定量得内部标准,每结合一个15N,该肽比正常14N得相同肽大一个质量单位,使得不同细胞状态来源得肽段得以区分,肽质谱峰信号成对出现,从而根据质谱峰得信号强度来进行准确得定量。
☹缺点:
由于相同肽段得不同同位素标记形式之间得质量变化依赖于氮原子数目,因此对未知蛋白难以进行定量。
Ø稳定同位素标记得必需氨基酸标记:
在培养介质中加入稳定同位素标记得必需氨基酸,如Lys、Leu、Phe等。
这主要用于高等动物细胞中蛋白质得定量以及鉴定。
优点:
省去了标记化学反应与分离纯化等步骤,因而减少了样品得损失,有利于低丰度蛋白质得高灵敏度检测。
缺点:
1、不能对组织来源得蛋白质进行分析。
2、同位素介质可能会影响蛋白质得表达水平。
3、受成本限制,不能对整个动物体进行标记。
4、无法确定标记物与肽段之间量得关系。
(2)同位素亲与标签技术ICAT
ICAT试剂包括三部分:
1、反应基团,可特异地与蛋白质侧链上得半胱氨酸(Cys)残基得-SH进行反应,使试剂共价结合在蛋白质侧链上;2、同位素标记得接头,含有稳定同位素(H与D)得标记;3、亲与标记得生物素,用于分离标记得蛋白质或多肽。
ICAT试剂中8个X位置被H取代时,称为轻试剂(D0),8个X位置被D取代时,称为重试剂(D8)。
轻试剂与重试剂得相对分子量差8Da或4Da(肽段带两个电荷)
在质谱图上这对标记蛋白质得肽段离子峰m/z相差8或4,从而能将来自不同样品得同一蛋白质分离开。
ICAT策略得优点:
:
a)若一种蛋白质酶切产生至少一个Cys残基得肽段得话,就可以对其进行鉴别与定量。
含有Cys残基得肽段越多,结果对照得出得结论就越准确;
b)鉴定得肽段中肯定都会有至少一个Cys,因此在进行数据库搜索时就增加了一个有效得约束条件;
c)肽段根据标记情况有选择性地得到了富集,从而减少了下游质谱分析得复杂程度;
d)分离出来得标记多肽可直接与后面得RP-µLC-MS分析系统在线偶联操作;
e)可直接对混合样品进行分析;
f)可对低丰
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