SPEUHPLCDAD法测定植物油微量酚酸类化合物的方法.docx
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SPEUHPLCDAD法测定植物油微量酚酸类化合物的方法
SPE-UHPLC-DAD法测定植物油微量酚酸类化合物的方法研究
王强(1,2谢跃杰1,2胡宝丹1任彦荣1张家蓉3王波4赵富昌5任贵礼5
(重庆第二师范学院生物与化学工程学院1,重庆400067)
(重庆第二师范学院脂质资源与儿童日化品协同创新中心2,重庆400067)
(甘肃农业大学食品科学与工程学院3,甘肃兰州730000)
(甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心4,甘肃兰州730000)
(重庆江源油橄榄开发有限公司5,重庆404100)
摘要:
建立了固相萃取-高效液相色谱对植物油中9种微量酚酸类化合物进行测定的方法。
从提取及净化方式、流动相组成、流动相流速以及色谱柱温度等条件优化9种酚酸类化合物的检测方法。
结果表明,样品经正己烷溶解,二醇基固相萃取柱(Diol-SPE)净化,甲醇-水为流动相,梯度洗脱,流速0.3mL/min,检测波长为280nm时,9种酚酸类化合物的检测结果最好,该检测方法的回收率在91.35%-103.21%之间,日内及日间精密度的RSD范围分别在0.3%~0.9%和0.6%~1.1%之间。
该方法快速、准确,具有较好的重复性及稳定性,适合对植物油样品中9种酚酸类化合物的检测,结果为植物油的分类及真假判定提供了理论基础。
关键词:
酚酸类化合物植物油高效液相色谱固相萃取检测
中图分类号:
TS227文献标识码:
文章编号:
DeterminationofninetracephenolicacidsinoilbySPE-UHPLC-DAD
WANGqiang1,2XIEyuejie1,2HUbaodan1RENYanrong1ZHANGjia-rong3WANGbo4ZHAOFuchang5RENgui-li5
(CollegeofBiologicalandChemicalEngineering,ChongqingUniversityofEducation1,Chongqing400067,China)
(CooperativeInnovationCenterofLipidResourcesandChildren'sDailyChemicals,ChongqingUniversityofEducation2,Chongqing400067)
(CollegeofFoodScienceandEngineering,GansuAgriculturalUniversity3,Gansu730010,China)
(GansuEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauCentralLaboratoryofTechnicalCenter4,Gansu730010)
(ChongqingJiangyuanOlive CompanyLimited5,Chongqing404100)
Abstract:
Thisstudyoptimizedtheexperimentalconditionsincludingextractionandcleanupmethods,columntemperature,andsolventcomposition,flowrateofmobilephaseforninetracephenolicacidsdetectionbyhigh-performanceliquidchromatography(HPLC)aftersolid-phaseextraction(SPE)cleanup.Theresultsshowedthatthesamplesweredissolvedinhexane.Diolgroupbasedsolid-phaseextractioncolumn(Diol-SPE)purification,methanolandwaterasmobilephase,gradientelution,flowrateof0.3mL/min,thedetectionwavelengthwas280nm,detectionof9kindsofphenoliccompounds.Therecoveryofthedetectionmethodattherangeof91.35%~103.21%.TheRSDofintra-dayandinter-dayprecisionwasbetween0.3%-0.9%and0.6%~1.1%,respectively.Themethodwasrapid,accurate,reproducibleandstable.Itissuitableforthedeterminationof9phenolicacidsinoilsamples,andprovidesatheoreticalbasisfortheclassificationandjudgedeterminationofoilsbyanalyzingandcomparingthetypesandcontentsofphenolicacidsin16batchesofoils.
Keywords:
phenolicacidcompounds,oil,highperformanceliquidchromatography,solidphaseextraction,detection
酚类化合物包括简单酚、多酚和酚酸,是植物重要的次生代谢产物。
目前,酚类化合物已达4000余种,且分为12个亚类[1-3]。
酚酸类成分作为酚类化合物重要的一类,由于其抗氧化活性,癌症预防、抗炎以及与改善心血管疾病等作用密切相关而备受关注[4-7]。
不同植物油含有不同种类及含量的酚酸类化合物,它们是植物油微量组分中重要的一部分,不仅有助于植物油对氧化的稳定性,而且能够影响其感官特性和营养质量[8]。
因此,针对微量酚酸类化合物建立一种灵敏、快速的检测方法显得尤为重要。
目前,酚酸类化合物的检测方法研究虽备受关注,但其检测主要集中在含量较高的葡萄酒[9-10],中成药[11-13]以及粮食[13-14]中,因植物油复杂的基质和较低的含量,针对植物油中酚酸类化合物的检测却鲜有报道。
酚酸类化合物常见的提取方法有液液萃取法[15]、固相萃取法[16]和超声辅助萃取法[17]等。
用于酚酸类化合物的分离检测方法多为高效液相色谱法[18-20]、毛细管电泳电化学法[21]和高效液相色谱串联质谱法[22-23]。
对于质谱法,因为质谱昂贵的价格限制了国内使用的普遍性,而高效液相色谱法和毛细管电泳电化学法多存在分析时间长,灵敏度不高以及前处理繁杂,特别是样品中的杂质对目标物的干扰较大,定量不准确,不能用于植物油中微量酚酸类化合物的同时测定。
为构建植物油酚酸类化合物的稳定方法学,本研究采用SPE-UHPLC-DAD法对植物油中的9种酚酸化合物进行检测分析,通过优化SPE前处理以及超高效液相色谱分离参数,力求在实际检测工作中建立一种快速、灵敏的检测方法。
1材料与方法
1.1材料与试剂
15种植物油样品,包括初榨橄榄油8种(O1~O8)、菜籽油3种(C1,C2,C3)、以及亚麻油2种(Y1,Y2)均购自本地区大型超市,精炼橄榄油3种(J1,J2,J3),由实验室自制。
标准品没食子酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸和反式肉桂酸;甲醇和乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备
Ultra-performance超高效液相色谱仪,配有二极管阵列检测器(DAD);SartoriusBP211D型电子分析天平(十万分之一);BondElutDiol固相萃取柱;KQ3200DB数控超声波清洗器。
1.3方法
1.3.1标准品溶液的制备
分别精密称取没食子酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸和反式肉桂酸标准品10.00mg,置10mL棕色量瓶中,加甲醇适量溶解并稀释至刻度制成1.0mg/mL的混合标准储备液,4℃保存。
分别精密量取混合标准储备液取1mL,氮气吹近干后,流动相配成0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、50.00、100.00μg/mL的系列标准工作液,4℃保存,备用。
1.3.2样品前处理
样品提取:
取5.00g植物油样品于50mL聚乙烯管中,加入10mL正己烷溶液,涡旋1.0min,待净化。
样品净化:
首先依次用10.0mL甲醇和10.0mL正己烷对固相萃取柱进行活化,流速控制在2.0mL/min;活化完成后,将样品提取液以1.0mL/min流速过Diol(二醇基)固相萃取柱,然后再用10.0mL正己烷淋洗萃取柱,弃去全部的流出液,最后用10.0mL甲醇洗脱,收集全部的洗脱液,氮气吹近干,残渣溶于2.0mL甲醇-水溶液(6:
4,v/v)中,涡旋振荡1.0min,4℃下10000r/min离心5min,取上清液,待测。
1.3.3UHPLC-DAD色谱条件
Waters公司BEH柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流动相A为0.1%甲酸甲醇(v/v)溶液,B为0.1%甲酸水(v/v)溶液;采用梯度洗脱程序(见表1);流速0.3mL/min;柱温40℃;进样量2.0μL。
检测波长为280nm。
表1梯度洗脱条件
时间
(Time)
流速
(mL/min)
A/%
(0.1%甲酸甲醇,v/v)
B/%
0.1%甲酸水,v/v)
曲线
0
0.3
5
95
-
20
15
85
8
30
45
55
6
31
5
95
6
35
5
95
6
2结果与分析
2.1流动相的选择
流动相的组成体系是影响目标物分离及色谱峰形的重要因素之一,根据酚酸类化合物的极性,本实验在相同洗脱条件下(见表1),研究水-乙腈体系以及水-甲醇体系下9种酚酸类化合物的分离效果。
根据目标物的保留时间、峰形以及分离度等因素确定最佳的流动相体系。
如图1所示,当流动相为甲醇-水体系时,9种酚酸类化合物的分离度良好,且分离时间适中。
当流动相为乙腈-水体系时,由于在反相色谱分离中,乙腈对于目标物的洗脱能力强于甲醇,在相同洗脱梯度条件下(见表2),9种酚酸类化合物的保留时间均有提前,且咖啡酸和香豆酸完全重合,未能达到分离要求,鉴于此,本研究选用甲醇-水体系为检测酚酸类化合物的最佳流动相体系。
图1甲醇-水体系(A)及乙腈-水体系(B)下9种酚酸类化合物的分离色谱图
2.2流速的选择
在传统反相液相色谱分离过程中,在系统压力允许的范围内,流速的大小与整个分离分析时间的长短有着必然的关系,当流动相的流速越大,被分离物质出峰时间越快,峰型尖锐,灵敏度较高;较小的流速会造成分析时间过长,色谱峰展宽而影响检测的灵敏度。
本实验使用超高效液相色谱,考虑到流动相的黏度和系统最高压力的限制,流速在0.1~0.4mL/min范围内进行优化,见图2;当流速为0.1mL/min时,在固定的35min分离时间内,反式肉桂酸(9)因为较强的保留而未被洗脱下来。
此外,香草酸(3)、咖啡酸(4)和绿原酸(5)拖尾严重,没食子酸
(1)甚至出现了峰分叉现象,不仅不能满足快速、高通量分析,而且还影响定量的准确性及分析的灵敏度。
当流速为0.4mL/min以上时,由于梯度洗脱过程中随着时间的增大,当甲醇比例在达到30%时,系统压力超出了最高压力的85%,为了保证较好的灵敏度、系统压力以及尽可能与杂质的分离,本实验最佳流速选择为0.3mL/min。
图2不同流速的分离色谱图
峰注:
1.没食子酸;2.对羟基苯甲酸;3.香草酸;4.咖啡酸;5.绿原酸;6.丁香酸;7.p-香豆酸;8.阿魏酸;9.反式肉桂酸
2.3色谱柱温度的选择
温度对目标物在反相色谱中分离的影响主要体现在主要体现在柱温的改变,直接影响到流动相的密度及黏度以及样品分子的传质速率,从而改变目标物与固定相和流动相之间的作用力,影响其保留时间;为了使9种酚酸类化合物得到较好的分离,本实验在保持其它色谱条件不变的前提下,在25~40℃的范围内考察了柱温对目标物分离的影响,见图3。
结果表明,随着温度的升高,酚酸类物质的保留时间逐渐减小。
当温度为35℃时,目标物中香草酸及咖啡酸分离度(R)仅为1.1,不仅不能满足分离要求,在实际样品的应用中使得杂质很容易干扰目标物,影响定量的准确性,当温度为40℃时,因为没食子酸与流动相及固定相之间作用力的改变,使得色谱峰出现了分叉,其余化合物的峰展宽增加,且咖啡酸和香草酸完全重合。
当温度为25和30℃时,目标物均得到分离,为了保证9种酚酸类物质在较短时间内达到分离,并且在分析过程中相互之间不被样品中的杂质所干扰,本实验选择最佳分离温度为30℃。
图3不同温度的分离色谱图
峰注:
1.没食子酸;2.对羟基苯甲酸;3.香草酸;4.咖啡酸;5.绿原酸;6.丁香酸;7.p-香豆酸;8.阿魏酸;9.反式肉桂酸
2.4固相萃取柱的选择
由于固相萃取柱操作简便、成本较低、能有效分离杂质和目标物,净化及富集效果明显优于液液萃取,鉴于此,本研究以9种酚酸类化合物的标准工作液(1.00μg/mL,10mL)作为目标物,分别采用HLB以及Diol(二醇基)固相萃取柱通过上样及淋洗两个步骤考察9种酚酸类化合物的吸附效果,结果表明,当使用HLB固相萃取柱时,没食子酸在上样过程中已损失近70%;当使用Diol固相萃取柱时,9种酚酸类化合物均有较好的吸附,使用正己烷进行淋洗也未检测到没食子酸以及其它目标物。
因此,本实验确定Diol为最佳固相萃取柱。
2.5方法学考察
2.5.1稳定性实验
取植物油样品(O1)5.00g,准确加入高、中、低三种不同浓度的9种被测组分混合标准工作液(0.25、1.00、5.00mg/L)各1.0mL,按照“1.3.2”处理样品,按照“1.3.3”所述色谱条件,分别在0、4、12、24、48h分别进样分析,每个时间点进样3次,取平均值。
植物油中9种酚酸类物质(没食子酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸和反式肉桂酸)的峰面积RSD分别为0.03%,0.48%、0.57%、0.52%、0.68%、0.69%、0.71%、0.65%和0.84%;结果表明样品溶液在48小时内稳定。
2.5.2精密度试验
分别对仪器精密度进行考察;按照“1.3.3”所述色谱条件,准确加入高、中、低三种不同浓度的9种(没食子酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸和反式肉桂酸)被测组分混合标准工作液(0.25、1.00、5.00mg/L)各1.0mL,重复进样6次,见表3;由表3可得9种目标物的日内精密度的RSD范围在0.3%~0.9%之间;日间精密度的RSD范围在0.6%~1.1%之间,由此可以看出该仪器对9种酚酸类物质具有较好的日间和日内精密度,能够满足植物油样品中9种主要酚酸类物质的检测要求。
表39种酚酸类化合物的稳定性及精密度
分析物
浓度(mg/kg)
日内精密度(n=6)
日间精密度(n=6)
检测值(mg/kg)
RSD(%)
检测值(mg/kg)
RSD(%)
没食子酸
0.25
0.25
0.8
0.25
0.9
1.00
0.99
0.6
0.98
1.0
5.00
4.98
0.9
4.99
0.9
对羟基苯甲酸
0.25
0.24
0.5
0.25
0.8
1.00
0.98
0.6
0.99
1.1
5.00
5.00
0.7
5.00
0.9
香草酸
0.25
0.25
0.5
0.25
0.8
1.00
0.99
0.6
0.98
0.9
5.00
4.99
0.4
5.00
0.7
咖啡酸
0.25
0.24
0.5
0.25
0.8
1.00
0.98
0.5
0.99
0.7
5.00
4.98
0.7
4.99
0.9
绿原酸
0.25
0.24
0.6
0.25
0.8
1.00
1.00
0.8
1.00
0.8
5.00
4.99
0.6
4.99
0.9
丁香酸
0.25
0.24
0.5
0.24
0.7
1.00
1.00
0.5
0.98
0.6
5.00
4.99
0.9
4.98
0.8
p-香豆酸
0.25
0.25
0.7
0.25
0.9
1.00
1.00
0.3
0.98
0.6
5.00
4.99
0.5
4.97
0.7
阿魏酸
0.25
0.25
0.7
0.24
0.9
1.00
1.00
0.8
1.00
0.9
5.00
4.98
0.8
4.97
1.0
反式肉桂酸
0.25
0.25
0.6
0.24
0.9
1.00
1.00
0.6
0.98
0.9
5.00
4.99
0.8
4.97
1.1
2.5.2专属性实验
取所得植物油样品溶液(O1)、混合标准溶液、阴性供试品溶液,按“1.3.3”所述的色谱条件进样分析,将阴性样品与混合标准溶液色谱图和样品色谱图比较,在9种酚酸类化合物(没食子酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸和反式肉桂酸)的出峰位置无干扰,表明该方法测定方法专属性好。
2.5.3线性范围及定量限
分别精密量取混合标准储备液取1.0mL,氮气吹近干后,使用流动相配成0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、50.00、100.00μg/mL的系列标准工作液,按“1.3.3”所优化的色谱条件进样(n=3),以峰面积平均值A为纵坐标,浓度C(μg/mL)为横坐标,绘制标准曲线;此外,将标准工作液(0.10μg/mL)逐级稀释,通过信噪比(S/N)为10考察定量限,(S/N)为3考察检出限。
结果见表4,9个成分的相关系数r2均大于0.99,表明各成分在线性范围内线性良好。
表49种酚酸类物质线性范围及定量限
分析物
线性范围(μg/mL)
回归方程
相关系数(r2)
检出限
(μg/mL)
定量限
(μg/mL)
没食子酸
0.25-100
y=20514x–2117.5
0.9999
0.1
0.25
对羟基苯甲酸
0.25-100
y=10258x-158.89
0.9998
0.1
0.25
香草酸
0.25-100
y=12162x+377.99
0.9999
0.1
0.25
咖啡酸
0.25-100
y=22696x-660.16
0.9999
0.1
0.25
绿原酸
0.25-100
y=10089x-412.99
0.9998
0.1
0.25
丁香酸
0.25-100
y=21763x-67.785
0.9998
0.1
0.25
p-香豆酸
0.25-100
y=34539x-288.56
0.9999
0.1
0.25
阿魏酸
0.25-100
y=22937x-402.82
0.9998
0.1
0.25
反式肉桂酸
0.25-100
y=50573x-591.03
0.9999
0.1
0.25
2.5.5加标回收率试验
准确称取6份同一批(O1)植物油样品,准确加入高、中、低三种不同浓度的9种被测组分混合标准工作液(0.25、1.00、5.00mg/L)各1.0mL,按“1.3.2”进行样品处理,按“1.3.3”所述的色谱条件进样分析,加样回收率实验显示,没食子酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸和反式肉桂酸含量的加样平均回收率范围分别在91.35%~103.21%之间,植物油中9种酚酸类物质的回收率的RSD范围在0.36%~1.11%之间,结果见表5,结果表明本实验方法准确可靠。
表5.植物油样品中9种酚酸类化合物的回收率
分析物
样品含量(mg/kg)
添加量(mg/kg)
检出量(mg/kg)
回收率(%)
RSD(%)
没食子酸
n.d
0.25
0.25
101.35
0.43
1.00
0.98
98.36
5.00
4.97
99.47
对羟基苯甲酸
0.46
0.25
0.68
96.35
0.36
1.00
1.37
94.13
5.00
5.49
100.62
香草酸
n.d
0.25
0.26
102.11
0.56
1.00
1.00
99.65
5.00
4.72
94.36
咖啡酸
0.35
0.25
0.24
95.63
0.74
1.00
0.98
98.24
5.00
4.72
94.35
绿原酸
n.d
0.25
0.25
98.61
0.54
1.00
0.95
95.31
5.00
4.66
93.29
丁香酸
n.d
0.25
0.25
100.47
0.85
1.00
0.99
98.63
5.00
4.96
99.24
p-香豆酸
n.d
0.25
0.25
99.52
0.68
1.00
0.96
96.35
5.00
4.87
97.37
阿魏酸
0.31
0.25
0.56
99.87
0.89
1.00
1.20
91.35
5.00
4.95
93.24
反式肉桂酸
1.39
0.25
1.69
103.21
1.11
1.00
2.32
97.25
5.00
6.41
100.35
n.d:
未检出
2.5.6重复性试验
准确称取同一植物油样品(O1)6份,添加混合标准工作液(1.00mg/L)1.0mL,按“1.3.2”进行样品处理,按“1.3.3”所述的色谱条件进样分析,并计算9种酚酸类化合物的含量及RSD,其结果可以看出,6份同一植物油样品(O1)中没食子酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸和反式肉桂酸含量的RSD
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- SPEUHPLCDAD 测定 植物油 微量 酚酸类 化合物 方法