浙江工业大学生物化学实验论文对啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定研究论文.docx
- 文档编号:14504870
- 上传时间:2023-06-24
- 格式:DOCX
- 页数:27
- 大小:211.74KB
浙江工业大学生物化学实验论文对啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定研究论文.docx
《浙江工业大学生物化学实验论文对啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定研究论文.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《浙江工业大学生物化学实验论文对啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定研究论文.docx(27页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
浙江工业大学生物化学实验论文对啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定研究论文
浙江工业大学生物化学实验论文——对啤酒酵母的蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文
浙江工业大学生物与环境工程学院
生物化学实验论文
姓名:
组员:
学号:
学科:
食品科学与工程
所在院系:
生物与环境工程学院
指导教师:
邱乐泉
2012年12月1日填
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文
摘要:
为了解酶的初步提取及纯化方法,并在此基础上掌握测定酶活力的原理和方法;用Folin-酚试剂、微量凯式定氮法测定蛋白质含量的原理和方法,SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量。
除此之外,还要掌握高速离心机、Q-Sepharose柱层析法、紫外分光光度计、凯氏定氮仪、蒸馏装置、电泳等用法。
这一系列实验需要实验预制作——酵母的自溶,大约3天以后,酵母细胞壁破裂,胞液流出,经多次分别离心得到初提液A、热提液B和乙醇提取液C。
利用Q-Sepharose柱层析法洗脱乙醇提取液C得到洗脱液D并在280nm处测D的吸光值,用葡萄糖测验试纸定性进行酶活力测试,发现洗穿透峰得到的第1、2管酶活力高,从第3管以后吸光值开始下降,且吸光值大的酶活力较大。
得到4种酶提取液样品以后,便可以制作葡萄糖标准曲线,进行定量酶活力测定,葡萄糖标准曲线是一条直线,根据曲线回归方程计算4个样品的总活力单位数和酶回收率,比较计算结果可以知道随着蔗糖酶的不断提纯酶的总活力单位数和酶回收率都减少。
随后用Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量,与用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较,后者测出的总蛋白含量比前者大,并且知道随着酶的提纯,A、B、C、D4个样品的纯化系数升高,比活力升高,总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降,其中A的蛋白质含量最高,D的纯化程度最高。
最后用SDS-聚丙烯胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、考马斯亮蓝的染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离间接测定蔗糖酶的相对分子质量,得到2条蔗糖酶条带,计算的蔗糖酶相对分子质量。
关键词:
蔗糖酶;提取纯化;酶活力测定;Folin-酚试剂;微量凯式定氮法;SDS-聚丙烯胺凝胶
Summary:
Tounderstandthetheenzymespreliminaryextractionandpurificationmethods,andonthisbasistomastertheprinciplesandmethodsofdeterminationofenzymeactivity;Folin-phenolreagent,traceKayceremonywillbetheprinciplesandmethodsofnitrogendeterminationoftheproteincontent,SDS-PAGEproteindeterminationoftherelativemolecularmass.Inaddition,wemustmastertheuseofhigh-speedcentrifuges,Q-Sepharosecolumnchromatography,UVspectrophotometer,Kjeldahlinstrument,distillationapparatus,electrophoresis.
Thisseriesofexperimentsrequiresexperimentalpre-production-yeastautolysis,aboutthreedayslater,theyeastcellwallrupture,cytosolicoutflowtothebeginningofextractsA,afterrepeatedlyrespectivelycentrifugalheatextractsBandethanolextractC.UsingQ-SepharosecolumnchromatographytoobtainaneluateDelutedethanolextractCandC
淡黄色液体
6.10
过小
VA总=VA=25.62ml
VB总=VB·[VA/(VA-3)]=24.0ml
VC总=Vc·[VA/(VA-3)]·[VB/(VB-3)]=Vc·[VB总/(VB-3)]=6.1ml
2.1.4.2分析
在这次试验中,数据为初始数据,实验结果的真实可靠是以后实验的保障。
我们的数据在A的时候偏大,C偏小,可能是因为我们离心过程的操作不是很正确,但是这不会影响到后续实验。
2.1.4.3结论
VA总=25.62ml;VB总=24.0ml;VC总=6.1ml。
2.1.5注意事项
①第一次离心后取液体时要小心。
重新离心后倒出液体留下固体。
②水浴时的温度不要超过50℃。
同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。
冰浴时要迅速操作。
③冰浴操作过程中加缓冲液使固体充分溶解,减少损失。
2.2蔗糖酶的纯化——QSepharose-柱层析法
2.2.1实验原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相,以一定pH和离子强度的溶液为流动相,流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应,利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异,而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。
由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同,它们被吸引的程度也不同。
当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时,降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来,用含阴离子(如Cl-)的溶液洗柱,含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来,增加Cl-浓度,含电荷多的蛋白质也被洗脱下来,于是两种蛋白质被分开。
分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性和定量分析。
2.2.2试剂与器材
2.2.2.1试剂
①0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液;
②1mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液;
③0.5mol/LNaOH;
④QSepharose,长期保存需置于20%乙醇中,4℃保存。
注:
整个实验要注意避免高温,以防止酶失活。
2.2.2.2器材
①层析柱;
②梯度混合器;
③磁力搅拌器,搅拌子;
④紫外分光光度计;
⑤点滴板;
⑥尿糖试纸、擦镜纸;
⑦止水夹;
⑧烧杯、试管。
2.2.3操作方法
1.离子交换柱的填充
将层析柱垂直固定,加水,排除气泡,再加少量水,装入离子交换剂,至柱高5cm,交换柱上端保留少许水(不得干柱)。
2.缓冲液盐度梯度发生器的安装
在低浓度一段装入搅拌子。
且要形成梯度。
3.柱的平衡
将柱子与恒流泵连通,用25mlTris-HClpH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后,交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。
4.加样
缓慢加样,不能把柱面冲到导致柱面不平,这是实验成功的关键之一
5.洗脱
为防止液面低于交换剂表面,加入了5ml缓冲液。
6.测OD值
在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。
得到各管的OD值如下:
表2-2
试管号
OD值
试管号
OD值
1
0.630
13
0.528
2
0.237
14
0.551
3
0.145
15
0.198
4
0.165
16
0.094
5
0.121
17
0.174
6
0.114
18
0.174
7
0.066
19
0.099
8
0.049
20
0.041
9
0.082
21
0.051
10
0.169
22
0.006
11
0.350
23
0.012
12
0.431
7.酶活力测试
用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小,由以上OD值,取13、14、19管进行测试。
酶活力测试方法:
在点滴板中滴2滴5%蔗糖,再加2滴待测洗脱液,用玻璃棒搅匀,放置5min,浸入葡萄糖试纸,1s后取出,60s比较颜色深浅。
将其合并成一管,VD=5.6ml
2.2.4结果与分析
2.2.4.1结果
VD=5.6ml
VD总=VD·VC总/V样=5.6×6.1/0.5=68.32ml。
由数据得表如下:
图2-1QSepharose-柱层析法提纯酶数据处理表
2.2.4.2分析
先用25mlTris-HCl洗穿透锋,得到8只试管。
但是如果在用量筒接的时候每管不是3ml,那么也许就没有8只了,这是实验的大忌。
会造成很大的误差,用梯度洗脱时,测得的OD值会成波动形式,而不是直线上升或者直线下降。
如果上提取液c中的酶浓度不够高,也可能导致提纯酶浓度不够高,以后在检验活力的时候会发现D根本就没有酶活力,于是实验重做,我们在做这个实验的时候应该想到各种情况带来的实验误差。
在收集D时,我们不小心到出了些,考虑到可能不够用,所以多取了一试管的D液。
在使用Q-Sepharose纯化方法之前还有过DEAE-纤维素层析方法和DEAESepharose层析方法,但比较这几种方法,用Q-Sepharose纯化方法有如下特点:
(1)提高实验效果。
琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。
蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。
(2)缩短实验时间。
梯度洗脱时间由原来的100min缩短到现在的50min,减少不必要的实验重复,实验过程比较紧凑。
(3)节约实验支出。
离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢,柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变,不能承受0.1M以上NaOH清洗,重生效果差,寿命短。
琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。
且其化学稳定性极高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重生效果好,可以使用数百至上千次,因而降低了成本。
2.2.4.3结论
VD5.6ml
VD总=68.32ml。
2.2.5注意
①在整个柱操作过程中,要严格防止液面低于交换剂的表面。
当液面低于交换剂表面时,空气进入交换剂内,形成气泡,而影响分离效果。
②加样不可太快,以免搅浑交换剂的表面,而使分离不纯。
③恒流泵的流速要控制好,要速度有利于液体滴下来,同时防止液体下滴过快而引起干柱。
是绝对不能干柱。
2.3蔗糖酶活力的测定
2.3.1实验原理
本实验用DNS法测还原糖的含量,进而计算酶的活力。
蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖均是还原性糖,可以在氢氧化钠和丙三醇的作用下与2,3,5-二硝基水杨酸反应,生成的棕红色氨基化合物在540nm波长处有最大吸收。
在一定范围内还原糖的量与其吸光值呈线性关系,于是做出葡萄糖标准曲线以后,就可以利用比色法可测出样品中的还原糖含量。
酶活力是指某种酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解的能力,通常以一段时间后底物的减少量或产物的生成量多少来表示。
酶活力单位数(U):
在一定条件下,3min内能水解蔗糖成还原糖1mg所需的酶量,称为1个活力单位数。
总活力单位数=(V测体积测出的葡萄糖克数/V测)*(试管溶液总体积/2)*V总*n
V总为各种提取液在提取过程中的总体积。
酶回收率=(各提取液的总酶活/处提取液A的总酶活)*100%
2.3.2试剂与器材
2.3.2.1试剂
①3,5-二硝基水杨酸
(1)甲液:
溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
(2)乙液:
称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中,再加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7~10天后使用。
②葡萄糖标准溶液(0.2mg/ml)准确称取20mg分析纯葡萄糖(预先在105℃干燥至恒重),用少量蒸馏水溶解后,定量移入100ml的容量瓶中,定容。
5%蔗糖、;
③0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液溶解10.83g醋酸钠于水中,加近260ml的1mol/L醋酸调pH到4.6,稀释至2L;
15%蔗糖用0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液配置;
22mol/LNaOH溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。
2.3.2.2器材
①电炉;
②恒温水浴;
③紫外分光光度计;
④试管、吸管;
2.3.3操作方法
1.葡萄糖标准曲线的制作
取6支试管,分别按表3-1加入各种试剂。
将各管内液体混合均匀,在沸水浴加热5min。
取出后立即用冷水冷却到室温,于540nm波长处测OD值,以葡萄糖的毫克数为横坐标,OD值为纵坐标,画出标准曲线。
表2-3葡萄糖标准曲线的制作
试管号
0
1
2
3
4
5
葡萄糖
0.0
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
蒸馏水
3.0
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
DNS
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
总体积
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
OD
0.000
0.121
0.236
0.359
0.482
0.599
2.酶活力测定
①将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释:
初提取液A(1:
200);热提取液B(1:
200);乙醇提取液C(1:
200);柱分离液D(1:
20)。
②取8支试管,按表3-2加入各种试剂。
表2-4酶的催化反应
项目
A(1:
200)
B(1:
200)
C(1:
200)
D(1:
20)
加样
A对
A样
B对
B样
C对
C样
D对
D样
酶液/ml
2
2
2
2
2
2
2
2
2NNaOH
0.5
—
0.5
—
0.5
—
0.5
—
35℃预热10min,同时预热5%蔗糖
5%蔗糖
2
2
2
2
2
2
2
2
立即摇匀,准确计时,反应3min
2NNaOH
—
0.5
—
0.5
—
0.5
—
0.5
总体积/ml
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
③取反应液A0.25ml,B0.25ml,C0.20ml,D0.3ml进行DNS反应,测定540nm处OD值。
得到ODA=0.193ODB=0.161ODC=0.306ODD=0.284
2.3.4结果与分析
2.3.4.1结果
①绘制葡萄糖标准曲线
图2-2
总活力单位数=mg/V测·4.5/2·V总·n
酶的回收率=(各提取液的总酶活/初提取液A的总酶活)·100%
本次试验最终结果:
表2-5
项目
初提液A
热提取液B
乙醇提取液C
柱分离液D
V测/ml
0.25
0.25
0.2
0.3
mg
0.185
0.174
0.222
0.215
V总/ml
25.62
24
6.1
68.32
总活力单位数/U
8531.46
7516.8
3046.95
2203.32
回收率/%
100
88.1
35.7
25.8
2.3.4.2分析
本次实验基本还算成功,葡萄糖标准曲线的线性较好,乙醇提取液C的回收率较低,可能实验操作带来的误差。
本次试验的计算公式有严格的要求,经过反复演算方才能得出实验结果。
实验公式可以改为:
总活力单位数=mg/V测*4.5/V配*V总/V取
其中,V取表示稀释时的取样数
V配表示稀释后的毫升数
这是第一次用办公软件处理数据,感到很新鲜,也意识到计算机在科学研究中的重要性。
2.3.5注意
①做葡萄糖标准曲线时,加完各种试剂后要充分摇匀。
要求测得的OD值在0.1~0.7
②测定酶活力时,要准确反应3min,这个反应时间应该精确把握,不要多1秒也不要少1秒
③测得在线性范围外的OD值,需重新配液显色反应。
2.4蔗糖酶的蛋白质含量测定及比活力计算
2.4.1实验原理
比活力是指单位质量(mg)蛋白质中酶的含量(U),常用来表示酶的纯度。
比活力=酶的含量(U)/蛋白质含量(mg)
测定蛋白质含量的方法有福林-酚试剂法、微量凯式定氮法、紫外吸收法、考马斯亮法等,本实验采用的是福林-酚试剂法,或称Lowry法,蛋白质与Folin-酚A试剂(碱性)在碱性条件下形成铜-蛋白质复合物,然后加入Folin-酚B(酸性),铜-蛋白质复合物将其还原形成深蓝色钼蓝和钨蓝化合物。
因为Folin-酚B中的磷钼酸-磷钨酸可被蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸还原生成蓝色化合物。
蛋白质浓度增高,产物颜色加深,这一蓝色溶液在750nm和660nm有较强的吸光值。
故可用比色法测定已知浓度的标准蛋白质溶液的OD值,然后据此测出未知样品的蛋白质浓度[5]。
2.4.2试剂与器材
2.4.2.1试剂
①试剂A(碱性铜试剂)取Na2CO3(AR)10g和NaOH(AR)2g,加蒸馏水30ml,微热溶解:
另取酒石酸钠(Na2C2H3O3•2H2O,AR)0.1g和CuSO4•5H2O(AR)0.05g,再加入30ml蒸馏水微热溶解,冷却后将上述两溶液混合,再用水稀释至100ml,即为试剂A。
该试剂为含10%Na2CO3,0.1%酒石酸钠和0.05%硫酸铜的0.5mol/LNaOH溶液。
保存于塑料试剂瓶中,24℃至少可使用1个月。
溶解于500毫升蒸馏水中。
;
②试剂B(酚试剂)在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4•2H2O),25克钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂(Li2SO4),50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。
稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。
使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1mol/L左右。
③标准浓度牛血清白蛋白溶液(200μg/ml)精确称取结晶牛血清蛋白或酪蛋白,必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量,根据其纯度精确称重配成。
牛血清白蛋白溶于水若混浊,可改用0.9%NaCl溶液。
;
2.4.2.2器材
①分光光度计(使用直径为10nm的比色皿);
②刻度吸管0.5ml(×1),2ml(×1),5ml(×1);
③试管1.5cm×15cm(×8);
④具塞试管10ml(×3);
⑤恒温水浴箱(55℃);
2.4.3操作方法
1.标准曲线的制作
表2-6标准曲线的配置加样表
管号
0
1
2
3
4
5
BSA
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
水
4.5
4.3
4.1
3.9
3.7
3.5
试剂A
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
静置10min(立即充分混匀)
试剂B
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
静置10min(立即充分混匀)
试剂B
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
混匀55℃水域5min,测A660
OD600
0.000
0.191
0.346
0.502
0.646
0.789
2.未知蛋白浓度的测定
按A(1:
100)、B(1:
100)、C(1:
20)、D(不稀释)进行稀释,A稀释液去0.4ml,B、C、D稀释液各取5ml测定OD660(所得数据如上表所示)。
【注意】Folin-酚B试剂在酸性条件下稳定,而Folin-酚A试剂在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。
当Folin-酚B试剂加入后,应迅速摇匀(加一管,摇一管),使还原反应产生在试剂被破坏之前。
2.4.4结果与分析
2.4.4.1结果
表2-7实验结果数据记录表
标准牛血清蛋白
(ml)
标准牛血清蛋白
(μg)
OD660
0.2
40
0.191
0.4
80
0.346
0.6
120
0.502
0.8
160
0.646
1
200
0.789
样品
A1
B1
C1
D1
OD660
0.412
0.303
0.277
0.156
图2-3
表2-8实验处理结果总汇表
总体积/ml
总酶活/u
总蛋白/mg
比活力/u/mg
蛋白回收率/%
酶活回收率/%
纯化倍数/倍
初提取液A
25.62
8531.46
506.87
16.83
100
100
1.00
热提取液B
24
7516.8
333.41
22.54
65.9
88.1
1.339
乙醇提取液C
6.1
3046.95
9.52
320.06
1.87
35.7
19.02
柱分离液D
68.32
2203.22
0.81
2720.14
0.16
25.8
161.61
2.4.4.2分析
此实验标准曲线线性较好,从纯化倍数来看,A与B似乎没有进行提纯,而C与D都大大的增加。
但是就蛋白质的回收率来看几乎为0,由此可见蛋白质的回收与总酶活之间没有绝对的联系,可能回收的蛋白质不一定都是具有酶活的。
这也证明了蛋白质的多样性。
此次方法的优点是操作简单,灵敏度高;缺点是蛋白质浓度和光密度线性关系不够严格,而且不同的蛋白质会因Tyr和Trp的含量不同,造成显色程度有差异。
2.4.5注意
①试剂A加完后,立即充分混匀,静置10min。
再向各管加B后放置10min,再加第二次。
2每次加A、B后应立即迅速充分混合。
2.5微量凯氏测总蛋白
2.5.1实验原理
凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首创,是一种元素分析方法。
根据取样量分类,可以分为常量和微量。
而不同蛋白质中含氮量平均16%,凯式定氮仪测定含氮量,然后乘以蛋白质换算系数6.25,得到蛋白质含量。
N/16%=N×6.25=蛋白质含量
实验共需消化、蒸馏、滴定3个步骤,其中消化是为了将有机氮转化为无机氮,然后在碱性条件下蒸馏,让无机氮转化成氨气出来,用硼酸试剂吸收,最后用盐酸滴定。
滴定指示剂在碱性条件下是绿色,当溶液由绿色--灰色--红色时可认为是滴定完全。
NH2CH2COOH+H2SO4→2CO2+3SO2+H2O+NH3
2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4
(NH4)2SO4+NaOH→Na2SO4+2H2O+2NH3
2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 浙江工业大学 生物化学 实验 论文 啤酒 酵母 蔗糖 提取 提纯 测定 研究