玄参对心室重构大鼠血管紧张素Ⅱ及其1型受体基因表达的影响.docx
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玄参对心室重构大鼠血管紧张素Ⅱ及其1型受体基因表达的影响
玄参对心室重构大鼠血管紧张素Ⅱ及其1型受体基因表达的影响
【摘要】 目的探讨玄参对心室重构大鼠血管紧张素Ⅱ及其1型受体基因表达、心肌血管紧张素Ⅱ、醛固酮及血管紧张素Ⅱ受体1型基因表达水平的影响。
结果与模型组相比,玄参可显着降低动物HWI,降低心肌AngⅡ,ALD含量,降低AT1AmRNA的过量表达。
结论玄参对心室重构具有明显的改善作用,其机制可能与抑制AngⅡ,ALD生成和AT1AmRNA表达有关。
【关键词】玄参;心室重构;血管紧张素Ⅱ;血管紧张素Ⅱ1型受体;基因表达
Abstract:
ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofXuanshenontheconcentrationofangiotensinⅡ(AngⅡ)andtheexpressionofangiotesinⅡreceptor(Type1A)mRNA(AT1AmRNA)inventricularremodeling ventricularremodelingmodelswereestablished.Onewasinducedbythyroxinandtheotherwasinducedbyabdominalaorticstenosisinrats.Theheartweightindex(HWI),theAngⅡandALDconcentration,andtheAT1AmRNAexpressionweredeterminedafteraperiodofXuanshenadministration.ResultsComparedwiththoseofventricularremodelingrats,theHWI,theconcentrationofAngⅡandALDandtheexpressionofAT1AmRNAweredecreasedingroupstreatedwithXuanshen.ConclusionXuanshenhasanobviouslyeffectonpreventiveventricularremodeling.ThemechanismmayberelatedtothedeclineofAngⅡandALDconcentrationandtheinhibitionofAT1AmRNAexpression.
Keywords:
Xuanshen;Ventricularremodeling;AngⅡ;AT1AmRNA;Geneexpression
心室重构涉及心肌肥大、心肌重量增加、心腔容积增大、心室形状改变和心肌间质纤维化[1]。
对各种心室重构动物模型的研究发现,心室重构并非是一种生理性的、良性的、适应性的代偿过程,而是一种可导致心功能严重损害的病变过程。
因此在心室重构的初期即进行有效的干预意义重大。
神经内分泌因子是心室重构发生与发展的重要因素,其中血管紧张素Ⅱ是公认的核心因子,且AngⅡ随着心力衰竭的进展而升高[2]。
因此寻找对AngⅡ过度激活有抑制作用的药物,对防治心室重构具有重要的现实意义。
玄参为玄参科多年生草本植物玄参的根,是着名的传统中药。
始载于《神农本草经》,列为中品,性寒,味苦、甘、咸,可入肺经、胃经、肾经,具有滋阴、降火、生津、凉血、解毒等功效。
现代药理研究发现玄参在心血管系统具有广泛而重要的药理作用,而玄参抗心室重构的实验研究尚未见报道。
本实验采用甲状腺素致大鼠心室重构和腹主动脉缩窄致大鼠心室重构两种动物模型,并以血管紧张素Ⅱ及其1型受体基因表达及其1型受体基因表达2003-0003,饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室。
2仪器DL-50RC-L离心机;SN-682放射免疫γ计数器;FJ-200高速分散均质机;754型紫外可见分光光度计;PCR仪;电泳仪;凝胶成像;Biohit移液枪、Eppendorf移液枪。
3药品试剂
玄参,产地浙江,上海养和堂中药饮片有限公司;L-甲状腺素,Sigma公司;卡托普利,上海衡山药业有限公司;血管紧张素Ⅱ试剂盒,北京北方生物技术研究所;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒,南京建成试剂公司;醛固酮放免试剂盒,北京北方生物技术研究所;2×PCRMasterMix,上海欣百诺生物科技有限公司;RevertAidtTMFirstStrandcDNASynthesisKit,K1622,Fermentas公司,上海中晶代理。
4玄参药液制备玄参用8倍量水煎煮3次,每次微沸30min,合并滤液浓缩,冷藏备用。
实验用量按每千克给予的生药量计算。
5模型制备及分组给药抗L-甲状腺素致大鼠心室重构观察选用220~250g的雄性SD大鼠50只,随机分为5组,每组10只,分别为:
正常组、模型组、卡托普利组、玄参小剂量组和玄参大剂量组。
除正常组外,各组连续7d腹腔注射L-甲状腺素 mg·kg-1·d-1,1次/d,造成心室重构模型;正常组腹腔注射等量生理盐水。
各给药组在给予L-甲状腺素后灌胃给予卡托普利40mg·kg-1或玄参水煎液,27g·kg-1;正常组、模型组灌胃给予等量蒸馏水。
连续灌胃给药9d后,于处理前禁食不禁水12h,然后取血和心肌进行各项分析。
大鼠心肌肥厚指数的测定:
大鼠称体重后腹主动脉取血。
快速打开胸腔取心脏,去除心房组织,分离左、右心室,生理盐水漂洗去血,用滤纸吸干表面水分,电子天平准确称取左心室重量和全心重量。
计算左心室重量/体重、全心重量/体重,分别记为左心室肥厚指数(LVWI)、全心肥厚指数(HWI)。
心肌组织AngⅡ含量测定:
取大鼠的心肌组织约200mg,加入2ml生理盐水在冰浴环境中快速匀浆,3500r·min-1离心10min,取上清200μl加生理盐水800μl,制备成2%的心肌组织匀浆,按血管紧张素Ⅱ试剂盒说明书及考马斯亮蓝蛋白测试盒说明书进行操作测定AngⅡ及蛋白浓度。
结果以每毫克蛋白中的AngⅡ含量表示。
抗腹主动脉缩窄致大鼠心室重构观察大鼠用戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉,仰位固定,打开腹腔,钝性分离腹主动脉,用内径为mm的银夹不完全结扎左右肾动脉之间的腹主动脉,使之外径狭窄至mm,制备压力超负荷性心室重构模型。
假手术组动物仅分离腹主动脉后不做结扎。
术后肌肉注射青霉素1×104U·kg-1·d-1,共3d,预防感染。
造模后2周手术组大鼠随机分组,每组10只。
给药1次/d,连续给药8周。
玄参小剂量组灌胃给予玄参水煎液g·kg-1;玄参大剂量组灌胃给予玄参水煎液27g·kg-1;卡托普利组灌胃给予卡托普利水溶液40mg·kg-1;假手术组和模型组大鼠灌胃给予等量蒸馏水。
心脏指数:
给药8周后,动物称重,颈动脉取血处死后,快速打开胸腔,分离心脏称重如前“大鼠心肌肥厚指数的测定”项下所述。
心肌组织AngⅡ含量测定:
取大鼠的心肌组织测AngⅡ含量,步骤如前“心肌组织AngⅡ含量测定”项下所述。
血清醛固酮含量测定:
取血,静置1h后,3500r/min离心10min取上清液,按醛固酮试剂盒说明书进行操作。
心肌组织AngⅡ受体1型基因的表达水平观察:
提取总RNA及逆转录反应:
每组取5个心肌标本,每个约100mg,Trizol试剂盒提取总RNA,取2μg总RNA逆转录合成cDNA,-20℃保存。
所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。
表1β-actin,AT1A引物序列
PCR反应:
以稀释10倍后的cDNA为模板,用目的基因引物进行PCR反应,同时设β-actin作为内参,并根据实测的基因的mRNA丰度建立最佳循环数,优化反应条件。
在冰上配制如下反应体系。
见表2。
表2PCR反应体系配制表
配制完毕,放入PCR仪中进行如下反应:
95℃预变性5min;进行29个循环:
95℃变性30s;55℃退火30s;72℃延伸40s;72℃最后延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳检测:
配制%的琼脂糖凝胶,PCR产物3μl,上样缓冲液2μl,120V电压电泳30min。
用凝胶分析软件Tanon2500,根据条带强度进行积分计算分析读取数据,以AT1A/β-actin作为心肌组织AT1AmRNA表达的半定量指标。
6统计学处理实验数据以±s表示,采用Excel统计软件进行t检验,用直线回归分析双变量相关性。
以P,分别表示统计学意义显着和非常显着。
2结果
玄参对L-甲状腺素致大鼠心室重构的影响
对心脏指数的影响模型组LVWI,HWI分别比正常组显着性升高;在腹腔注射L-甲状腺素的同时,玄参大剂量组和卡托普利组灌胃9d后,LVWI和HWI与模型组相比显着降低。
玄参小剂量组的LVWI、HWI与模型组比较无显着性差异。
结果见表3。
对心肌组织AngⅡ含量的影响与正常组动物相比,模型组动物心肌组织中的AngⅡ含量显着性升高,玄参大剂量组和卡托普利组灌胃9d后,与模型组比较左心室心肌组织中AngⅡ的含量显着降低;玄参小剂量组左心室心肌组织中AngⅡ与模型组比较无显着性差异。
结果见表3。
表3玄参对L-甲状腺素致大鼠心室重构的影响(略)
玄参对腹主动脉缩窄致大鼠心室重构的影响
对心脏指数的影响与假手术组比较,模型组心脏指数显着增加。
与模型组比较,玄参大剂量组和卡托普利组心脏指数显着性降低,玄参小剂量组心脏指数虽有下降,但差异不显着。
结果见表4。
对醛固酮、血管紧张素Ⅱ含量的影响与假手术组比较,模型组ALD、AngⅡ含量显着增加。
与模型组比较,玄参小、大剂量组、卡托普利组均能显着性降低其含量。
结果见表4。
表4玄参对腹主动脉缩窄致大鼠心室重构的影响(略)
对心肌组织AT1AmRNA表达水平的影响AT1AmRNA电泳图(图1)经分析统计后的结果如表5所示:
与假手术组比较,模型组AT1AmRNA含量显着增加。
与模型组比较,玄参小、大剂量组、卡托普利组AT1AmRNA含量显着降低。
表5玄参对腹主动脉缩窄大鼠AT1AmRNA表达的影响(略)
各指标间相关性分析结果见表6。
表6各指标间相关性分析
3讨论
心脏指数是一项病理学指标,是反映左心功能不全程度较为准确的指标,所以采用动物心室重构模型时,可用心脏指数来评价左心功能不全的严重程度[3]。
本实验结果揭示玄参水提液能显着降低两种模型动物左心和全心指数增加,对防治心室重构意义明显。
AngⅡ具有较强的致心肌纤维化的作用,它可以通过AT1受体的介导直接作用于心脏成纤维细胞引起胶原合成的增加[4],促进心室重构,加速心力衰竭。
AT1是一个含有7个跨膜肽链的膜蛋白,可通过G蛋白耦联途径介导AngⅡ的作用[5]。
AT1亚型又进一步分为AT1A和AT1B,其中AT1A占90%左右,是AngⅡ作用于心血管系统的主要受体亚型[6]。
本实验观察到甲状腺素致心室重构大鼠的AngⅡ与其左心指数呈明显正相关均呈明显的相关性,证实了上述说法。
玄参可明显降低ALD含量,这可能也是其抑制AngⅡ含量增加从而防治心室重构的作用机制之一。
玄参抗心室重构的作用值得进一步研究,其作用机制还有待进一步地阐明。
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