HSP70介导EGCG抑制呼吸道合胞病毒的作用研究.docx
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HSP70介导EGCG抑制呼吸道合胞病毒的作用研究
HSP70介导EGCG抑制呼吸道合胞病毒的作用研究
【摘要】目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用,为新型抗呼吸道合胞病毒中药开发提供基础研究数据。
方法根据细胞毒性实验确定EGCG的最大工作浓度,采用病毒滴度TCID50检测法、细胞毒性检测法、Westernblot和实时荧光定量PCR方法(qPCR)检测EGCG体外对RSV的增殖、蛋白表达和基因转录抑制效果。
采用RNA干扰敲低HSP70表达水平,检测病毒的生长曲线。
结果EGCG对Vero细胞的毒性呈现明显的梯度依赖效应,最大无毒浓度为25μM,且12μM的EGCG浓度下,细胞上清中病毒滴度抑制率达60%;同时Westernblot结果显示EGCG细胞中病毒F蛋白受到显著抑制;qPCR对细胞中RSVG蛋白的转录本的检测结果表明EGCG使病毒G蛋白的转录效率下降了85%以上。
敲低HSP70的表达水平后,病毒的滴度下降了两个数量级。
结论EGCG体外对RSV-A有较好的抗病毒作用,且可能是通过抑制其特异性底物HSP70实现的。
【关键词】EGCG;呼吸道合胞病毒;抗病毒作用
StudyontheinhibitoryeffectofEGCGonrespiratorysyncytialvirus
【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofEGCG(epigallocatechin-3-gallate)onrespiratorysyncytialvirus(RSV)invitro,andtoprovidebasicdataforthedevelopmentofnewChinesemedicineagainstrespiratorysyncytialvirus.MethodsAccordingtothemaximumworkingconcentrationofEGCG,theeffectsofEGCGontheproliferation,proteinexpressionandgenetranscriptionalinhibitionofRSVinvitroweredetectedbyTCID50assay,cytotoxicityassay,Westernblotandreal-timequantitativePCR,respectively.UsingRNAiknockdowntheexpressionofHsp70,titrationthereplicationofthevirus.ResultsToxicityofEGCGonVerocellsshowedanobviousgradientdependenteffect,withthemaximumnon-toxicconcentrationof25μM,andthetiterinhibitionrateofvirusinthecellssupernatantreached60%attheconcentrationof12μM.Meanwhile,WesternblotresultsshowedthatthevirusFproteininEGCGtreatedcellswassignificantlyinhibited.TheresultsofqPCRonthetranscriptionofRSVGproteinincellsshowedthatEGCGreducedthetranscriptionefficiencyofvirusGproteinbymorethan85%.KnockingdowntheexpressionlevelofHSP70reducedthetiterofthevirusbytwoordersofmagnitude.ConclusionsEGCGhasagoodantiviraleffectonRSV-Ainvitro,andmaybeachievedbyinhibitingitsspecificsubstrateHSP70.
【Keywords】EGCG;Respiratorysyncytialvirus;Antiviraleffect
Fundprogram:
YouthFundProjectoftheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity(YNQN2017050)
呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)属于有囊膜的单链负链RNA病毒中的副粘病毒科中的肺炎病毒亚科病毒。
它可导致需住院治疗的严重下呼吸道感染[1]。
早产儿和患有慢性肺病毒或先天性心脏病的婴幼儿被认为是患RSV呼吸疾病的高危人群,给全球儿童健康带来重大影响和负担。
据统计5岁以下儿童有3310万人患有急性下呼吸道感染,320万人入院治疗,并在2015年全球有多达11.82万人由RSV感染致死[2]。
由于RSV感染年龄早、疫苗在婴幼儿中增强感染和缺少长效免疫以致终生重复多次感染等原因,安全有效的RSV疫苗尚未开发出来[3]。
鉴于RNA病毒易突变产生耐药等特点,从宿主因子角度寻找既不影响宿主细胞正常功能又能阻遏病毒增殖的化合物成为医治婴幼儿呼吸道合胞病毒疾病的关键。
目前临床治疗RSV感染主要应用利巴韦林和干扰素治疗[4],可减轻症状和缩短病程,但疗效不稳定,毒副作用多。
另外RSV感染后,患者免疫力差,易发生再次感染。
研究表明即使母体通过胎盘传给胎儿的抗体亦不能防止婴儿被感染[5]。
至今未有安全有效的预防疫苗,而灭活疫苗接种会加重感染[5]。
因此,开发一种高效、安全、副作用少的抗RSV感染的新药,尤其是天然化合物具有重大意义。
表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)为茶多酚中主要的活性成份。
大量研究表明,EGCG具有抗氧化、抗恶性细胞增生、抗癌、抗细菌、抗炎和抗病毒、抗血栓形成和抑制血小板聚集的作用[6-8]等多种生理活性,但对其应用于RSV抗病毒治疗的报道和研究相对有限。
本研究旨在探讨EGCG体外抗RSV病毒的作用及机制,评价其作为RSV治疗药物的可行性。
1资料和方法
1.1资料来源
呼吸道合胞病毒A亚型病毒分离株(RSV-A):
为郑州大学第一附属医院呼吸科临床分离株;Vero和Hep-2细胞为本科室保存。
EGCG购自Solarbio,产品编号:
SS8490。
Anti-RespiratorySyncytialVirus兔多克隆抗体(ab12253)和山羊抗兔IgGH&L(HRP)(ab6721)二抗购自美国Abcam公司,抗GAPDH兔多克隆抗体购自杭州贤至生物科技有限公司;小干扰RNA(siRNAs)(siControl,cat.no.sc-37007;siHsp70,cat.no.sc-29352)和HSP70的RT-PCR引物(h)-PR:
sc-29352-PR购自SantaCruzBiotechnology,Inc.。
1.2方法
1.2.1病毒的扩繁提前一天将Vero细胞传代,使一瓶细胞扩繁为三瓶。
次日细胞长至80%左右汇合度的细胞单层时,接入RSV种子毒,置37℃、5%CO2培养箱中培养,观察细胞病变。
待大部分细胞出现病变时,收取细胞培养上清,以3000rpm离心去除细胞碎片,将上清进行1mL/管进行分装,置于-80℃冰箱保存。
1.2.2病毒滴度测定在接毒前将生长状态良好的正常Vero细胞铺96孔细胞培养板。
次日待细胞汇合度长至约80%时,弃去培养上清。
将RSV病毒用细胞维持液从10-1至10-8做10倍系列稀释,每个稀释度设6个重复孔,将各稀释度的病毒液取100μL接种于单层Vero细胞中,置37℃、5%CO2培养箱中培养,观察细胞病变程度并记录。
采用Reed-Muench法计算病毒培养上清和不同药物浓度处理细胞上清中的RSV病毒滴度。
1.2.3EGCG的药物毒性测定将EGCG分别用细胞维持液稀释为400、200、100、50、25、12、6、3μM8个浓度,然后分别加入Vero细胞已长成单层的96孔细胞培养板中,每孔100μL,每一浓度设置3个复孔,同时设立正常细胞对照组,置37℃、5%CO2培养箱中培养,观察48h。
每孔加入CCK810μL,避光培养1-4h。
酶标仪(波长450nm)测定各孔光吸收值OD450。
实验批间重复3次。
1.2.4EGCG的抗病毒效果检测已长成单层的细胞以含不同浓度药物的维持液处理2h后,按照MOI=0.01进行接毒,随后置于37℃、5%CO2培养箱孵育2h。
弃去含病毒维持液,以无血清培养基洗1遍,再更换含不同浓度药物的维持液,置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
培养48h后,收集上清。
测定病毒滴度,方法同1.2.1所述。
1.2.5Westernblot检测RSV病毒蛋白的表达情况Vero细胞铺于六孔细胞培养板,药物和溶剂分别预处理细胞2h,再以MOI值0.01接入RSV-A病毒,培养24h后,不同处理细胞样品进行电泳并转膜。
NC膜分加入1:
1000稀释的抗GAPDH兔多克隆抗体或抗呼吸道合胞病毒F蛋白抗体,再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗于37℃条件下摇床孵育1h,化学发光系统成像拍照分析。
1.2.6qPCR检测病毒基因的抑制情况将RSV-A病毒的糖蛋白G基因和猴GAPDH、Hsp70基因分别录入在线qPCR引物设计网站,设计qPCR引物并进行合成,,具体引物如下:
RSV-G-F:
5’-AAGCCAACCATCAACACCAC-3’,RSV-G-R:
5’-TGGGCTTAGATAGCCTTCGG-3’;GAPDH-F:
5’-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3’,GAPDH-R:
5’-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3’。
将不同处理方法处理的六孔板细胞以MOI0.01接入RSV-A病毒,培养24h后,弃去上清,以PBS洗细胞1次,每孔加入1mLTrizol裂解,抽提细胞总RNA,并反转录为cDNA。
PCR运行程序为:
95预变性10min,随后进行40个循环:
95℃10s,56℃1min以及72℃10s。
采用SYBRGreen法进行。
1.2.7HSP70的RNA干扰Hep-2细胞以HSP70和对照siRNA进行转染,转染后12h后,以MOI=0.01接RSV-A病毒进行培养,分别在感染24h、36h和48h收集培养上清,测病毒滴度。
测定HSP70转录本的表达情况。
具体参考产品说明书和方法1.2.2、1.2.6进行。
1.2.8SPSS19.0软件用于数据统计分析,不同处理组的样品转录本、病毒滴度等采用t检验进行组间两两比较,P<0.05判定为具有统计学差异,P<0.01判定为具有极显著的差异。
2结果
2.1病毒滴度测定结果
取100μL病毒母液,接入长成单层细胞的T-25细胞瓶中,每天观察细胞病变情况。
当Vero细胞中大部分出现病变时收毒(图1),测定病毒培养液中病毒滴度,记录每个稀释度不同孔的病变情况,经Reed-Muench法算得病毒滴度10-4.5TCID50/0.1mL,可以满足后续实验的需求。
图1RSV-A病毒在Vero细胞上产生的病变
MOI:
感染时间。
2.2EGCG的药物毒性测定结果
不同浓度的EGCG处理细胞48小时后,测定细胞活力。
由图2可知,EGCG的细胞毒性具有明显的浓度梯度依赖效应,其中25μM对细胞毒性与其以下浓度无显著差异,因此,EGCG对Vero细胞的最大无毒浓度在25μM以下。
图2EGCG的药物毒性浓度
2.3EGCG对RSV-A病毒增殖的抑制效果
为了更加直观清晰的评价EGCG的抗RSV效果,采用测定上清病毒滴度TCID50的办法对药物进行药效学检测。
EGCG对细胞上清中释放病毒滴度的抑制结果如图3所示,EGCG分别在25和12μM及以上浓度时,可抑制60%以上的病毒增殖;同时,在不同的EGCG浓度作用下,培养上清中子代病毒释放量随着EGCG浓度的增加而下降。
结果显示EGCG对RSV-A具有体外抗病毒效果。
图3EGCG对病毒增殖的抑制作用
2.4Westernblot检测RSV-A病毒蛋白表达受EGCG抑制的情况
将不同处理方法(正常细胞、溶剂DMSO和EGCG12μM)处理的细胞样品的检测结果如图4所示,在膜上显现出相对分子质量63kD的条带,这与RSV-A病毒蛋白F蛋白分子量大小一致。
在EGCG处理的样品中,在细胞内参蛋白GAPDH含量相同的情况下,病毒蛋白表达量显著低于对照组和溶剂处理组的细胞样品,这表明EGCG使病毒在细胞中的增殖受到明显抑制。
图4Westernblot检测RSV-A病毒蛋白表达
1,RSV-A感染细胞;2,DMSO溶剂处理RSV-A感染细胞;3,EGCG处理RSV-A感染细胞。
2.5qPCR检测EGCG处理细胞中病毒基因的转录抑制情况
由图5A可知,本研究所设计引物具有单一的溶解曲线峰,说明扩增效果良好。
由于病毒mRNA合成在病毒感染后进行,我们比较了药物处理和未处理的细胞在感染24h后G基因mRNA的转录水平。
EGCG(12μM)、DMSO溶剂和正常RSV感染对照等不同处理的细胞中病毒G基因的转录水平以GAPDH进行归一化处理,并按照∆∆Ct方法进行计算。
实验结果(图5B)显示,EGCG的处理使RSV-A病毒糖蛋白G基因组转录下降了约85%,与溶剂组和正常对照组相比具有极显著的差异(P<0.01)。
图5不同处理对RSV-A核蛋白基因转录水平的影响
A,引物的溶解曲线;B,qPCR测定不同处理细胞中RSV-A核蛋白基因的转录,将溶剂处理细胞中的G蛋白基因归一化为100%。
**P<0.01与正常细胞组比较。
2.6EGCG处理对Hsp70的转录和表达的影响
为了进一步探讨EGCG可能的抗RSV作用机制,对EGCG处理的细胞中HSP70和糖蛋白G基因的转录本进行实时荧光定量PCR检测。
由图6A不难看出,EGCG的处理能够使HSP70的转录本水平下调约60%,在病毒感染细胞能够达到相同的效果;而病毒RSV-A的感染未使Hsp70转录水平发生明显的变化,这与前人研究结果相吻合。
同时,在蛋白水平上,EGCG的处理使得RSV感染前后的细胞中的HSP70的表达水平受到明显抑制(图6B)
图6EGCG的处理前后RSV感染前后细胞中的HSP70的表达水平
A,EGCG处理正常细胞和RSV-A感染细胞后HSP70转录水平的变化;1,未感染细胞;2,EGCG处理的未感染细胞;3,EGCG未处理的感染细胞;4,EGCG处理的感染细胞。
B,EGCG处理正常细胞和RSV-A感染细胞中HSP70蛋白的表达情况变化。
2.7RNAi证实HSP70为RSV-A的治疗靶标
鉴于EGCG具有多种生理活性,但其抗RSV-A的活性是否是通过抑制其特异性底物HSP70来实现,本研究采用RNA干扰的手段进行了初步探索。
由图7A可知,RNA干扰敲低了细胞中HSP70的表达水平。
而在该细胞培养上清上病毒滴度(102.26TCID50/0.1mL)显著低于实验对照组(104.87TCID50/0.1mL)(图7B)。
图7Hsp70的RNA干扰对RSV-A增殖的影响
A,Hep-2细胞在转染后siRNAs后,Hsp70基因的转录情况,将未转质粒的对照组归一化为100%;B,不同处理Hep-2细胞培养上清中病毒的一步生长曲线。
**P<0.01与对照组比较。
3讨论
RSV感染是婴幼儿患呼吸道疾病的最常见的诱因之一,特别早产儿,当然也是年老和免疫缺陷人群发病和致死的重要原因。
尽管目前已有大量检测不同中药成份的抗RSV效果研究报道[9-12],但至今仍然没有有效的特异治疗干扰措施或疫苗。
茶多酚是从茶叶中提取的组成复杂,分子量、性质与化学结构各异的多羟基酚类混合物,其中以儿茶素为主的黄烷醇类化合物是茶多酚的主体部分。
儿茶素占茶多酚总量的60%-80%,包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表儿茶素(EC)。
其中EGCG是茶叶中特有的儿茶素,含量最高,约占茶多酚制品的50%左右[13],它因其结构中有6个邻位酚羟基而具有优于其他儿茶素的许多特性。
药理研究表明EGCG具有抗氧化、抗感染、抑制肿瘤生长、提高免疫力,且对痢疾、伤寒、金黄色葡萄球菌等微生物具有明显的抑制作用[14]。
体外实验已证明EGCG可通过抑制HIV-1逆转录酶的活性发挥抗HIV作用[15]。
EGCG还可通过抑制细胞内内涵体或溶酶体的酸化来降低流感病毒的感染率[16]。
已有文献证明EGCG抗RSV,但机制尚不明确[17]。
热休克蛋白(HSP)是一组在进化上高度保守、具有重要生理功能的蛋白质家族,是生物在应激条件下产生的一种非特异性防御产物,在调节免疫应答和抗病毒反应中起重要作用。
其中HSP70通过激活天然免疫细胞活化等方式参与天然免疫,通过调节抗原呈递细胞对抗原的加工与呈递,增强免疫应答和参与免疫球蛋白组装等方式发挥对适应性免疫的影响,进而参与感染与免疫。
GaieBrown等[18]研究发现,随着感染的发生HSP70会被转运至病毒诱导包涵体中,也能够与病毒N蛋白和脂筏共定位,HSP70在RSV感染中发挥着一定的功能。
本研究中,我们测定自然界广泛存在中药成分EGCG的体外抗RSV-A活性,证实其确实具有抗RSV-A治疗药物潜力。
因此,我们推测,EGCG的良好抗RSV效果是通过抑制HSP70的蛋白表达,进而影响病毒感染中诱导的内涵体和脂筏的形成,从而使病毒子代的产生受到影响。
因此,笔者进一步通过qPCR、Westernblot和商业化RNA干扰序列的转染成功验证了我们的设想,即EGCG可能是通过作用于Hsp70实现抑制RSV-A的增殖的。
传统测定中药抗RSV效果评价经常采用细胞病变抑制实验(CPEI),该方法尽管简单直接,成本低,但是实验数据主观性大,难以准确量化病毒滴度的变化,尤其对于药物靶点针对宿主细胞蛋白和病毒接毒量大的情况下,难以准确评价。
本研究中采用直接测定药物处理细胞上清中病毒滴度的办法对药物抗病毒效果进行测定,能够准确测定出病毒的抑制率。
同时,配合细胞中病毒蛋白表达情况和基因转录情况等不同水平和技术手段,确认了EGCG的抗RSV-A效果及其初步的作用机制。
综上所述,EGCG作为一种有效的抗RSV效果的茶多酚成分,有望用于RSV感染引起的呼吸道感染疾病的治疗。
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