乌拉甘草有效成分对人体4 种肿瘤细胞增殖与凋亡的影响.docx
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乌拉甘草有效成分对人体4种肿瘤细胞增殖与凋亡的影响
乌拉甘草有效成分对人体4种肿瘤细胞增殖与凋亡的影响
【摘要】 目的测定乌拉甘草提取物对人体4种肿瘤细胞的抑制效果。
方法应用MTT法测定甘草水提物与醇提物对宫颈癌细胞株、乳腺癌细胞株、胃癌细胞株以及肝癌细胞株增殖的抑制作用;运用Hochest33258荧光染色剂测试其诱导细胞凋亡的生物学效应。
结果甘草酸的抑瘤效果表现出浓度依赖性,与浓度呈正相关关系。
高浓度甘草酸对Bcap-37,Hela,MGC-803的增殖均有较强的抑制作用,其抑制率分别为76.37%,79.71%,71.06%,对Bel-7404细胞增殖的抑制作用较差,抑制率仅为24.29%。
在一定浓度范围内,其对4种肿瘤细胞增殖的抑制率与样本浓度大小呈负相关关系,200μg/ml剂量的甘草黄酮抑制肿瘤细胞增殖的效果最佳,其对Bcap-37,Hela,Bel-7404,MGC-803等4种肿瘤细胞增殖的抑制率分别为79.55%,79.98%,67.91%以及37.86%。
甘草酸、甘草黄酮均能有效诱导这4种肿瘤细胞发生凋亡。
结论甘草酸和甘草黄酮诱导细胞凋亡是其显着抑制肿瘤细胞增殖的重要途径。
【关键词】乌拉甘草甘草酸酮抗肿瘤细胞凋亡
Abstract:
ObjectiveAnti-proliferationeffectofglycyrrhizhinandtotalflavonesextractedfromGlycyrrhizauralensisFischonfourkindsofhumancancercells wasstudied.MethodsMTTwasusedtostudytheanti-proliferationeffect,andHoechst33258wasusedtotesttheapoptosis-inducingeffectontumorcells.ResultsItshowedthatanti-proliferationeffectofglycyrrhizinwasconcentrationdependent,higherconcentrationofglycyrrhizin hadobviousanti-tumoreffect,withincertainconcentrationof,inhibitoryeffectoftotalflavoneswasalsoconcentrationdependent,thelowerconcentration wasofthehighestinhibitoryeffect,itsinhibitingratesonBcap-37,Hela,Bel-7404,MGC-803were79.55%,79.98%,67.91%and37.86%respectively.ConclusionBothglycyrrhizinandtotalflavoneshavestrongerapoptosis-inducingeffectsonthefourkindsoftumorcells.
Keywords:
Glycyrrhizauralensis;Glycyrrhizin;Flavones;Anti-tumor;Apoptosis
乌拉甘草GlycyrrhizauralensisFisch为豆科甘草属多年生草本植物[1],是《中国药典》中收录的药用甘草之一,其性平味甘,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效[2]。
其有效成分主要为甘草酸类和甘草黄酮类物质。
最近研究表明甘草酸还具有抑制肺癌细胞增殖的作用[3~5]。
本研究以人宫颈癌细胞株、人乳腺癌细胞株、人胃癌细胞株以及人肝癌细胞株4种肿瘤细胞作为研究对象,通过体外实验研究甘草有效成分的抗肿瘤活性及其诱导细胞凋亡的效果,为甘草提取物抗肿瘤实验的研究以及甘草新药的开发提供理论依据。
1器材与方法
1.1提取物的制备
1.1.1甘草酸的制备乌拉甘草的根茎采自石河子大学甘草资源圃,80℃烘干至恒重后粉碎成粉末,过40目筛。
准确称取1.0g样品干粉,加10ml蒸馏水,于室温条件下放置48h,12000r/min离心10min,取500μl上清液加500μl甲醇混匀,12000r/min离心10min,取上清液,用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤,HPLC法测定甘草酸含量[6]。
1.1.2甘草黄酮的制备准确称取1.0g样品粉末,用250ml无水乙醇加5滴浓盐酸为提取剂在索氏提取器中于95℃的水浴加热条件下提取6h,浓缩至25ml,冷却至室温后补足溶剂至刻度,用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤,用Folin-酚试剂法测定总黄酮含量[6]。
1.2细胞株人宫颈癌细胞株、人乳腺癌细胞株,人胃癌细胞株,人肝癌细胞株,均由中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供。
1.3设备及试剂
1.3.1仪器HPLC分析仪、紫外可见分光光度仪、CO2培养箱、∑960自动酶标仪、荧光显微镜、超净工作台、血球记数板、倒置显微镜、超速离心机。
1.3.2试剂RPMI1640、小牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜、甲醇、四噻唑蓝、顺铂、Hoechst33258染色试剂盒。
1.4方法及观察指标
1.4.1细胞培养细胞用含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养基,置于37℃,5%CO2孵箱中培养。
实验用细胞均处于对数生长期,常规苔酚蓝计数活细胞大于95%。
1.4.2体外抗肿瘤实验体外抗肿瘤实验分5个浓度、阴性对照、空白对照。
对数生长期细胞100μl/孔接种于96孔板,37℃饱和湿度,5%CO2条件下培养6h,待细胞均已贴壁,加入100μl不同浓度的受试物,各设5个复孔。
在48h取出96孔板,倒置显微镜下观察后,每孔加MTT溶液20μl,37℃继续孵育4h,终止培养。
小心吸弃孔内培养上清液。
每孔加入150μlDMSO,振荡10min,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收OD值,记录结果。
抑制率=×100%
1.4.3细胞凋亡率实验细胞凋亡实验在同一浓度下进行,实验设阴性对照、阳性对照、空白对照。
取普通、洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡10min,0.9%NaCl溶液洗涤3遍,再用细胞培养液洗涤一遍。
将盖玻片置于六孔板内,种入细胞培养过夜,使约为70%~90%满。
加入样品,继续培养48h,吸尽培养液,加入0.5ml固定液,固定10min。
去固定液,用0.9%NaCl洗两遍,3min/次,吸尽液体。
加入0.5mlHoechst33258染色液,染色5min。
用0.9%NaCl洗两遍,3min/次。
滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片。
荧光显微镜下随机选取10个视野拍照后计数。
凋亡率=凋亡细胞/×100%。
1.5统计学处理实验所得所有数据均经SPSS12.0软件处理并对处理组间进行单因素方差分析,P<0.05时表示存在显着性差异。
2结果
2.1甘草酸体外抗肿瘤实验结果光镜下观察到,未经任何处理的肿瘤细胞接种48h后,细胞约占孔底面积的90%~98%。
高剂量甘草酸处理肿瘤细胞48h时,细胞数量少,间距大,多数细胞体积固缩变小、失去原有肿瘤细胞形态而略呈圆形、椭圆形,说明对肿瘤细胞的生长与增殖具有显着的抑制作用。
结果见表1。
表1甘草酸对4种肿瘤细胞增殖的抑制效应
从表1可见甘草酸的抑瘤效果表现出浓度依赖性,与浓度呈正相关关系。
高浓度甘草酸对Bcap-37,Hela,MGC-803的增殖均有较强的抑制作用,其抑制率分别为76.37%,79.71%,71.06%,对Bel-7404细胞增殖的抑制作用较差,抑制率仅为24.29%。
2.2甘草黄酮体外抗肿瘤实验结果(见表2)。
从表2中可得知,甘草黄酮处理肿瘤细胞48h后,在一定浓度范围内,其对4种肿瘤细胞的抑制率与样本浓度大小呈负相关关系,即样本浓度越低,对肿瘤细胞的抑制率越高,200μg/ml剂量的甘草黄酮抑制肿瘤细胞增殖的效果最佳,其对Bcap-37,Hela,Bel-7404,MGC-803等4种肿瘤细胞增殖的抑制率分别为79.55%,79.98%,67.91%以及37.86%;在极低浓度时,甘草黄酮对这4种肿瘤细胞生长均无明显抑制作用。
表2甘草黄酮对4种肿瘤细胞增殖的抑制效应
细胞凋亡实验从图1~3中可以看到,4种肿瘤细胞经荧光染色后,正常细胞的细胞核呈弥散均匀状,凋亡细胞的细胞核由于凋亡致使细胞核固缩成团,在荧光下呈致密浓染或碎块状,颜色较正常细胞更深更亮。
甘草活性成分诱导BCAP细胞凋亡的实验结果见表3。
表3不同处理对4种肿瘤细胞凋亡的影响
本研究中我们以临床常用肿瘤治疗药物顺铂做阳性对照,从结果中我们可以看出与阴性对照组相比甘草黄酮与甘草酸均具有极显着的诱导4种肿瘤细胞凋亡的生物学效应,甘草黄酮能很好的诱导人乳腺癌细胞、人宫颈癌细胞以及人肝癌细胞的凋亡,其效果均优于等剂量的顺铂;而对胃癌细胞凋亡的诱导效果不及顺铂。
高浓度的甘草酸只对人宫颈癌细胞的诱导凋亡效应与200μg/ml的顺铂相当,对其余细胞的诱导凋亡效果均不及顺铂。
图1阴性对照组
图2阳性对照组
图3样品处理组
3讨论
细胞凋亡是一种与细胞坏死具有不同形态及生化特征,且受基因调控的主动性细胞死亡。
与诱导细胞坏死相比,通过诱导细胞凋亡杀死癌细胞不会引起机体强烈的炎症反应[7]。
因此,通过诱导细胞凋亡来杀伤和清除肿瘤细胞,已经成为一种筛选抗癌药的快速有效的方法。
为了探讨甘草活性成分甘草酸、甘草黄酮在抗肿瘤作用中的潜在治疗价值,实验中笔者以人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人胃癌细胞、人肝癌细胞为研究对象,以顺铂作为阳性对照,观察甘草酸、甘草黄酮对这4种肿瘤细胞的增殖抑制及其诱导凋亡作用。
结果显示甘草黄酮类化合物对人宫颈癌细胞、乳腺癌细胞以及肝癌细胞的增殖均具有显着的抑制及诱导细胞凋亡的效果;甘草酸只在高浓度条件下才对人胃癌细胞显示出较强的抑制增殖作用,其对胃癌细胞的诱导凋亡效应不佳,这与以往的研究结果是一致的[7]。
综上所述,甘草酸、甘草黄酮抑制这4种肿瘤细胞增殖与诱导其细胞凋亡的结果是相一致的;因此,甘草酸和甘草黄酮诱导细胞凋亡是其显着抑制肿瘤细胞增殖的重要途径。
鉴于甘草黄酮类化合物的抑瘤效果优于甘草酸,所以在进行甘草抗癌药物筛选时,应优先考虑甘草黄酮类物质。
【参考文献】
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[8]田莉,高晓黎.甘草的抗肿瘤作用[J].西北药学杂志,2004,19:
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