分子生物学实验精.docx
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分子生物学实验精.docx
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分子生物学实验精
分子生物学实验
汕头大学生物系
目录
目录1
综合性实验部分2
实验一利用RAPD技术分析植物基因组的多态性2
实验二苦瓜功能基因MAP30的克隆及其原核表达的研究3
设计性实验部分4
实验一特殊环境微生物宏基因组文库的构建及功能基因的筛选4
实验二利用RFLP技术分析不同环境微生物种群多态性4
实验三利用DGGE技术分析环境微生物种群的多态性5
附录分子生物学常用实验技术5
一CTAB法微量提取植物总DNA5
二DNA的琼脂糖凝胶电泳分析及其纯化、回收6
三利用PCR技术从植物基因组DNA扩增功能基因9
四碱法微量制备质粒DNA11
五质粒DNA/PCR产物的酶切反应15
六DNA的酶连、重组技术17
七CaCl2法制备E.coli感受态细胞19
八植物基因组DNA多态性的检测21
九重组DNA的转化及在原核细胞中的表达22
十蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳25
十一蛋白质的印迹转移(WesternBlotting)27
●综合性实验部分
实验一利用RAPD技术分析植物基因组的多态性
一.实验目的
了解RAPD技术的原理,掌握该技术的操作,学习利用RAPD技术对物种基因组进行多态性分析。
二.实验原理
1990年Williams等人第一次运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记。
并将此方法命名为RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,随机扩增的多态性DNA),尽管RAPD诞生的时间很短,但由于其独到的检测DNA多态性的方式,、以及快速、简便的特点。
使这些技术已渗透于分子生物学研究的各个方面。
RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任何一特定的引物,它同基因组DNA序列有其特定的结合位点。
这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增的反应条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物之间的相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段。
因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就有可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。
通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA的变异,分析时可用引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。
因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。
二.实验流程
实验二苦瓜功能基因MAP30的克隆及其原核表达的研究
一.实验目的
了解基因克隆的原理和基本步骤,掌握基因克隆和外源基因原核表达相关的实验技术。
二.背景资料
苦瓜抗HIV蛋白(MomordicaAnti-HIVProtein),其分子量大小约30kDa,故称为MAP30。
MAP30最早是由Lee-HuangS等从苦瓜中提纯出来的一种核糖体失活蛋白,体外具有N-糖苷酶活性的特异性。
MAP30还具有抑制HIV-1整合酶的活性,表现为以下三个方面:
1.MAP30抑制HIV-1整合酶的3’末端加工活性。
2.MAP30抑制HIV-1整合酶的链转移活性。
3.MAP30对HIV-1整合酶去整合的抑制。
现有资料表明,MAP30对许多类型病毒感染的细胞、肿瘤细胞非常有效,是一种非常有效的广谱抗病毒抗肿瘤植物成分。
三.实验原理
根据苦瓜MAP30基因已知的序列,设计一对特异性引物,以苦瓜基因组DNA作为模板,利用PCR技术扩增出MAP30基因。
扩增出来的MAP30基因经特定的限制性内切酶消化后,与同样经过限制性内切酶消化的质粒载体连接,形成重组质粒。
将带有外源基因的重组质粒转化入宿主细胞内,并在一定条件下使外源基因在宿主细胞内表达,其表达产物可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹反应(Westernblotting)等方法检测。
四.实验流程
●设计性实验部分
实验一特殊环境微生物宏基因组文库的构建及功能基因的筛选
一.实验目的
1.利用所掌握的知识,搜集相关资料,自行设计实验。
2.熟悉质粒提取,大肠杆菌感受态细胞的制备,质粒的连接转化,重组克隆子的筛选和鉴定等实验技术,并应用这些技术完成设计实验。
二.实验原理
从特殊环境中直接提取微生物的总DNA,经纯化后部分酶切,然后把这些DNA片段连接到载体上,转化替代宿主细胞,形成一个重组DNA文库即宏基因组文库。
获得的克隆子根据宿主细胞获得的新功能进行筛选,或用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段,加上表达调控元件后使目的基因表达,从而获得产物。
实验二利用RFLP技术分析不同环境微生物种群多态性
一.实验目的
1.通过资料搜集,利用分子生物学技术对不同环境微生物种群的多态性进行分析。
2.学习16SrRNA文库的构建方法。
3.利用RFLP技术对16SrRNA文库的多态性进行分析。
二.实验原理
通过收集并提取不同环境的微生物的总DNA,利用通用引物扩增环境微生物的16SrRNA,结合基因克隆的方法构建16SrRNA文库。
然后提取不同阳性克隆子的重组质粒DNA,并利用限制性内切酶进行消化,不同的重组质粒DNA经酶切后在琼脂糖凝胶电泳中呈现出不同的条带,反映出环境微生物种群的多态性。
RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制性片段长度多态性)。
它的基本原理主要是通过限制性核酸酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的异同,因为限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能将之切断,而不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。
在同源染色体相应的DNA区段,用一种限制性核酸内切酶消化,由于碱基组成不同,就会产生不同长度的酶切片段,然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交,显出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。
实验三利用DGGE技术分析环境微生物种群的多态性
一.实验目的
了解DGGE技术的原理,掌握DGGE技术的基本步骤和实验操作,学习利用DGGE技术分析微生物群落多态性的方法。
二.实验原理
变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE)是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。
它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。
1985年Muzyers等首次在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术,使该技术日臻完善。
1993年Muzyers等首次将DGGE技术应用于分子微生物学研究领域,并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。
由于DGGE技术避免了分离纯化培养所造成的分析上的误差,通过指纹图谱直接再现群落结构,目前已经成为微生物群落遗传多样性和动态性分析的强有力工具。
DNA分子双螺旋结构是由氢键和碱基的疏水作用共同作用的结果。
温度、有机溶剂和pH等因素可以使氢键受到破坏,导致双链变性为单链。
DGGE技术检测核酸序列是通过不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性,发生空间构型的变化,导致电泳速度的急剧下降,最后在其相应的变性剂梯度位置停滞,经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。
该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异,可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性。
●附录分子生物学常用实验技术
一CTAB法微量提取植物总DNA
一.实验目的
1.学习掌握用CTAB法微量提取植物基因组DNA,该方法提取的DNA可用作PCR的模板和限制性酶切反应。
2.了解基因组DNA的其它提取方法
二.实验原理
本实验用物理法研磨破碎细胞,利用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)和β-巯基乙醇蛋白变性剂,再经加热使蛋白变性与DNA分离,加之EDTA螯合金属二价离子、氯仿的抽提使DNase对DNA作用降低到最低,异丙醇沉淀核酸,得到总DNA。
三.材料、试剂和仪器
1.新鲜的植物叶片
2.-CTAB(100ml):
50mMTris-Cl(pH8.0),0.7MNaCl,10mMEDTA,121℃灭菌
3.+CTAB(50ml):
在灭菌的-CTAB中加入2%CTAB和40mMβ-巯基乙醇
4.酚/氯仿/异戊醇:
25/24/1
5.70%乙醇(预冷)
6.RNaseA:
100mgRNase溶于10mMTris-Cl(pH7.5),15mMNaCl中,于100℃加热15min,分装后-20℃保存
7.异丙醇、ddH2O
8.仪器:
水浴锅、离心机、琼脂糖凝胶电泳系统等
四.实验步骤
1.将质量约为0.3g以内或适量的新鲜嫩叶片放于Eppenddorf管中,加入400μl冰冷的-CTAB,用微型研磨棒充分研磨新鲜幼叶,保持冰浴。
(也可以将新鲜嫩叶放于瓷质的研钵中,将人适量的液氮进行研磨,待叶片磨至粉末状后加入适量的-CTAB)。
2.500μl65℃预热的+CTAB70℃保温30min,不时颠倒混匀。
3.450μl酚/氯仿/异戊醇,颠倒混匀至溶液呈乳浊状—但不要震荡,离心10000rpm,3min,取上清。
4.加入450μl氯仿,混匀后离心10000rpm,3min,取上清。
5.加入600μl异丙醇,颠倒混匀,-20℃放置30min。
6.12000rpm,4℃/5min,弃上清。
7.用800μl预冷的70%乙醇洗涤沉淀(注意不要吹散沉淀)。
8.离心后吸去残余乙醇。
9.待乙醇挥发后加入20-50μlTE缓冲液(含1%RNaseA),温和混匀。
10.取5μl样品进行琼脂糖凝胶电泳,其余的样品-20℃保存。
五.思考题
CTAB、β-巯基乙醇、EDTA等试剂主要起什么作用?
二DNA的琼脂糖凝胶电泳分析及其纯化、回收
一.实验目的
1.学习掌握核酸的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法及其运用。
2.熟练从琼脂糖凝胶中回收DNA片断的方法,为DNA克隆打好基础。
二.实验原理
1.DNA的琼脂糖凝胶电泳
由于核酸结构的重复性,核苷酸数相同的核酸几乎具有等量的净电荷,所以核酸携带的电荷的差异几乎不造成对核酸迁移率的差异,而真正决定核酸分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素取决于核酸分子的大小、构象、构型。
采用适当浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使大小、构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异,以达到分离的目的。
2.DNA的胶回收
依载有DNA的琼脂糖凝胶块的大小,离心回收上清液,再用氯仿抽提一次上清液,然后加入NaAc和乙醇沉淀回收DNA。
三.材料、试剂和仪器
1.琼脂糖(Agarose)、6×上样缓冲液(6×LoadingBuffer)
2.氯仿(Chloroform)、无水乙醇、70%乙醇、超纯水(ddH2O)
3.PCR纯化试剂盒(PCRPurificationKit)/DNA胶回收试剂盒(DNAGelExtractionKit)
4.仪器:
琼脂糖凝胶电泳系统、离心机、冰盒等
四.实验步骤
1.凝胶的制备
(1)用胶条封好10cm×7cm胶槽板的两头放在调好水平的平台上备用。
(不同电泳系统间的操作略有差异)
(2)配1%的胶:
称取0.2g的琼脂糖,置于三角瓶中,加入0.5×TAE20ml,放在微波炉中化胶,注意不能让胶溢出。
缓冲溶液的体积应小于三角瓶或玻璃容器容积的50%。
配胶和灌满电泳槽使用同一批缓冲液很重要。
因为离子强度或PH值很小的差别也会在凝胶前部产生紊乱,严重影响DNA片段的泳动。
一些限制酶缓冲液(如BamHⅠ和EcoRⅠ)含有高浓度的盐,能够减缓DNA的迁移,并使邻近孔泳带变斜。
警惕:
微波炉加热过长,琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。
仅加热所有琼脂糖颗粒完全溶解所需要的最短时间。
通常为溶解的琼脂糖呈小透明体或半透明碎片悬浮在溶液中。
戴上手套不时小心地旋转三角烧瓶或玻璃瓶以保证黏在壁上的未溶解的琼脂糖颗粒进入溶液。
溶解较高浓度的琼脂糖溶液需要较长的加热时间。
要查看煮沸后是否由于蒸发而溶液体积减少,如有必要用水恢复原体积。
(3)轻旋转三角瓶把胶混匀,使胶的温度冷却至50℃-60℃。
加入5mg/ml的EB到终浓度为0.5μg/ml(即凝胶体积的1/10000),充分混匀。
当用塑料托盘制备凝胶时,灌制凝胶前冷却融化的琼脂糖溶液至60℃之下很重要。
更高温度的溶液会使托盘变形或出现裂纹。
含有高浓度琼脂(2%或更高)的溶液应在70℃存放,以免过早凝结。
但是因为用于纯化和制备标准琼脂糖方法的改进,这种处理已没必要。
(4)在距离底板0.5-1mm位置上放置梳子,以形成加样孔。
多数凝胶托盘都有适合放置梳子的侧壁或外壁支架。
如果没有或不合适,梳齿可能会太接近托盘底面,在拔出梳子时易穿透加样孔的底部。
样品液将从凝胶和加样孔之间泄漏。
应用低浓度琼脂糖(<0.6%)或低凝点琼脂糖这种问题尤其容易发生。
(5)将琼脂糖溶液倒入胶模中。
凝胶的厚度在3-5mm之间,并防止梳子的齿下或齿间及凝胶中产生气泡。
凝胶的适宜厚度为3-5mm。
需检查在梳齿下或梳齿间应无气泡。
熔化的凝胶液中的气泡用移液枪的吸头轻触即可容易地除去。
制备低浓度琼脂糖(<0.5%)时,先倒一个1%浓度琼脂糖的支持胶,它没有加样孔。
让支持胶在托盘或玻璃板上室温下硬化,然后再直接在支持胶倒低浓度凝胶。
此方法制备的凝胶明显减少了后继操作,如照相和印迹过程中低浓度凝胶可能发生的断裂。
需要保证两个浓度的凝胶用同一批缓冲液配制,且含有相同浓度的溴化乙锭。
低熔点和低于0.5%浓度的琼脂糖凝胶也可以冷却到4℃,在冷室中电泳以减少断裂的机会。
(6)室温静置约30min,使胶能完全凝固。
把胶放入调好水平、装有适量缓冲液的电泳槽内,轻轻拔出梳子,待用。
电泳槽中的电缓冲液刚好没过凝胶约1mm。
没有必要在加样前对琼脂凝胶进行预电泳。
2.电泳
(7)在一次性膜上分滴6×的上样缓冲液(6×LoadingBuffer)2-3μl/滴,然后与10μlDNA液混匀,加入到上样孔上(用微量移液器的tip头插入1mm深处,轻轻推进样品,可以看见样品下沉)。
同时上DNA分子量标准(Marker)5μl。
加样孔能加入DNA的最大量取决于样品中DNA片段的大小和数目。
能加样的最大体积是由加样孔容积决定的。
通用的加样孔0.5cm×0.5cm×0.15cm可容纳约40ul。
切忌将加样孔加得太满,甚至溢出。
为避免溢出污染邻孔样品,最好凝胶稍厚些增加孔容积或通过乙醇沉淀浓缩DNA减少加样体积。
许多情况下,不必每个样品用一个新的移液枪吸头,只需在两次加样之间用阳极池内缓冲液充分洗涤后即可再用,但是凝胶要用于印迹分析或将要回收DNA条带时,每个样品应使用一个新的吸头。
(8)盖上电泳槽并通电,使DNA向阳极移动:
先用20-30毫安的电流让样品进入胶,然后再升高电压,采用1-5v/cm的电压继续电泳。
(9)切断电流,取出凝胶,如果凝胶和电泳缓冲液中有EB,可直接在紫外灯下检查凝胶并在凝胶成像系统中摄影。
3.DNA的胶回收(碧云天TMDNA胶回收试剂盒)
(10)
加入等体积的溶液I,混匀,60℃水浴3min。
例如如DNA样品体积为100μl,则加100μl溶液I。
如果等体积混合后体积较大,可以把部分样品加入到纯化柱内,经离心处理后,再加入剩余的样品继续处理。
(11)加入到DNA纯化柱内,室温放置1min。
最高速(16000g,约12000-14000rmp左右)离心1min,倒弃收集管内的液体。
(注意:
这一步一定要达到16000g,较低离心速度会导致回收效率下降。
)
(12)在DNA纯化柱内加入700μl溶液II,室温放置1min。
最高速离心1min,洗去杂质。
倒弃收集管内的液体。
(13)再加入500μl溶液II,最高速离心1min,进一步洗去杂质。
倒弃收集管内的液体。
最高速再离心1min,除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发。
(14)将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上,加入30μl溶液III至管内柱面上,放置1min。
用1.5ml离心管作为收集管。
(注意:
溶液III需要直接加至管内柱面中央,使液体被纯化柱吸收。
如果不慎将溶液III沾在管壁上,一定要震动管子,使液体滑落到管底,以便被纯化柱吸收。
也可以用重蒸水或MiliQ级纯水替代溶液III,但是水的pH应不小于6.5。
如需得到较高浓度的DNA,可以只加20μl溶液III,但产量会略有下降。
放置较长时间例如3-5min,会对提供产量略有帮助。
)
(15)最高速离心1min,所得液体即为高纯度DNA。
五.思考题
1.哪些因素会影响核酸在琼脂糖凝胶中的泳动?
2.为什么凝胶中的RNA或单链DNA也能被EB检出?
3.怎样提高DNA的回收效率?
●附录
1.在一定胶浓度下,电场强度不变,对于线性DNA,其迁移率与其分子量的常用对数成反比,依此可以粗略估算未知DNA分子的大小。
2.胶浓度一定、分子量相同时,一定电压范围下,迁移率与电压成正比。
对构型不相同的质粒,超螺旋型质粒泳动最快,线性的DNA泳动率次此,有缺刻质粒DNA泳率最慢;当电压超过一定的界线,将不存在这种关系。
3.同一分子量的核酸,在一定电场下,随胶浓度提高其泳动率下降,有时因胶浓度过高,环状DNA分子不能进入胶孔。
下面的公式表达了线性DNA的迁移率(U)与凝胶浓度(T)之间的线性关系:
LgU=LgU0-KrT其中U0是自由泳动迁移率,Kr是滞留系数,它是与凝胶的性质、迁移分子大小和形状等有关的常数。
4.缓冲液的pH值直接影响DNA的解离程度和电荷密度,缓冲液pH值与DNA样品的等电点相距越远,样品所携电荷越多,泳动速度越快。
pH值为3.5时,DNA碱基上的氨基基团解离,只有一个磷酸基团解离,整个分子带正电,在电场中向负极泳动:
pH为8.0-8.3时,DNA的氨基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电场中向正极泳动。
实验中常用pH为8.0-8.3的0.5×TBE或0.5×的TAE,不但有利于电泳,对DNA分子也是一种保护。
5.一般用上样缓冲液中的指示剂是溴酚兰,它的分子量是670道尔顿,分子筛效应小,近似于自由电泳,在0.6%、1%、2%的琼脂糖凝胶电泳中它们分别与1kb、0.6kb、0.15kb的双链DNA片断的泳动率大致相同。
另外上样量也有一定的限制,如0.5cm宽的孔,单一分子量的片断可以上20-30μg不会影响分辨率。
6.EB是一种荧光染料,其分子结构尾扁平型可嵌入核酸双链的配对碱基之间,它在紫外光下主要吸收300nm和360nm紫外线的能量,核酸可把吸收的260nm紫外光的光能传给EB,这样激发EB发射出590nm的可见红色荧光,核酸中的EB荧光比凝胶中游离的EB荧光强度大10倍,因此非常便于观察核酸。
若用10mMMgCl2泡胶5min,使非结合在核酸中的EB褪色,可检查到10ng的核酸样品,对于单链核酸最低检出量为100ng。
若要回收核酸,应采用366nm波长的紫外仪观察,这样核酸上产生的断链缺口少,利于下步实验。
7.PCR纯化试剂盒(PCRPurificationKit)/DNA胶回收试剂盒(DNAGelExtractionKit)通常采用硅胶吸附或者离子交换柱的方法,在特定条件下,使DNA能在离心过柱的瞬间,结合到DNA纯化柱上,在一定条件下又能将DNA充分洗脱,从而实现DNA的快速纯化,无需酚氯仿抽提,无需酒精沉淀。
DNA纯化柱的容量约为15μg。
适用于PCR反应后去除引物,酶,矿物油,甘油,盐等杂质;也同样适用于酶切,连接,磷酸化,补平或切平,随机引物等反应后的DNA纯化。
所得的DNA可直接用于酶切,连接,转化细菌,测序,PCR,杂交等后续操作。
三利用PCR技术从植物基因组DNA扩增功能基因
一.实验目的
学习掌握PCR技术的原理及基本操作
二.实验原理
PCR(PolymeraseChainReaction)技术是KaryMullis在1985年建立起来的在细胞外合成DNA的一种方法,即利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性,在附加两个引物与模板杂交之后,按碱基配对的原则经酶促反应合成DNA片断,包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间的DNA的一定次数的重复循环,使包括在两个引物5’端限定的特异片断形成指数式积累。
三.材料、试剂和仪器
1.苦瓜总DNA
2.苦瓜MAP30基因扩增引物
上游引物(5’Primer)5′cgGGATCCGATGTTAACTTCGATTTGTCGACT(划线部分为BamHI内切酶位点,小写部分为保护碱基)
下游引物(3’Primer):
5′tGAGCTCTCAATTCACAACAGATTCCCCAA(划线部分为为SacI内酶切位点,小写部分为保护碱基)
3.4种dNTPs(A/T/C/G)、TaqDNA聚合酶(TaqDNAPolymerase)及其缓冲液、ddH2O
4.仪器:
PCR仪、冰盒、凝胶电泳检测系统等
四.实验步骤
20μl体系:
μl
10×Buffer(withMg2+)
2
4dNTPs(2.5mM)
0.4
5’Primer(10μM)
1
3’Primer(10μM)
1
DNA模板
1(2ng)
ddH2O
14.4
TaqDNApolymerase(2.5U/μl)
0.2
1.反应体系
在冰浴中,按以上顺序将各成分加入一无菌PCR小管中,轻弹混匀,离心收集,视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.“Smart型”反应体系
15μl
25μl
50μl
2×PCRTaqMix
7.5
12.5
25
ddH2O
4.5
9.5
22
DNA模板
1(2ng)
1(2ng)
1(2ng)
5’Primer(10μM)
1
1
1
3’Primer(10μM)
1
1
1
3.反应条件
Steps
温度(℃)
时间(min)
1
95
3
2
30
Cycles
94
1
3
55
1
4
72
1
5
72
10
6
4
2~4hours
4.PCR反应结束后,如在反应管中加有石蜡油,需用100ul氯仿进行抽提反应混合液,已除去石蜡油;否则,直接取5ul扩增产物,加3ul上样缓冲液,混合后用1%琼脂糖凝胶上样电泳,检验扩增效果(MAP30基因长度约为800bp)。
五.思考题
1.举例说明PCR技术的应用
2.影响PCR效果的因数主要有哪些?
●附录
一.引物的设计原则:
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15-30碱基之间。
④G+C含量在40%-60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,
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