核酸分离纯化与测序PCR技术复习题及答案docx.docx
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核酸分离纯化与测序PCR技术复习题及答案
一、填空题
1.SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂,它有四个作用:
1溶解膜蛋白及脂肪,从而使细胞膜破裂;
2溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸释放出来;
3对RNase、DNase有一定的抑制作用;
4SDS能够与蛋白质结合形成R-0-S03
一...r+一蛋白质复合物,使蛋白质变性沉淀。
2.酚是蛋白质变性剂,用酚抽提细胞DNA时,具有两方面的作用:
1是蛋白质变性;
2由于它能使蛋白质变性,故也能使核小体和核糖体解聚,释放出DNA和RNA,提高DNA的得率。
3.用酚一氯仿抽提DNA时,通常要在氯仿或酚一氯仿中加少许异戊醇。
这是因为,异戊醇是一种有机溶剂,可以降低表面张力,从而减少气泡产生。
另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
4.同其他水解蛋白酶相比,蛋白水解酶K具有两个显著的优点:
①水解能力强,作用范围广;②在SDS和EDTA中仍保持高活性,可以同SDS和EDTA同时使用。
5.在分离DNA时要使用金属离子螯合剂,如EDTA和柠檬酸钠等,其目的是螯合Mg2+抑制核酸酶的活性。
6.用乙醇沉淀DNA时,通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子,如NaCl和NaAc,其目的是中和DNA分子的负电荷,增加DNA分子间的凝聚力。
7.通常可在三种温度下保存DNA:
4~5°C、-20°C、-70°C,其中以-70°C最好。
8.引物在基因工程中至少有四个方面的用途:
①合成探针;②合成cDNA;③用于PCR反应;
④进行序列分析。
9.Clark发现用DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端,而是有一个突出碱基末端的双链
DNA分子。
根据这一发现设计了克隆PCR产物的T载体。
10.在用SDS分离DNA时,要注意SDS的浓度,0.1%和1%的SDS的作用效果是不同的,前者只
将RNA分离出来,后者可将DNA和RNA一同分离出来。
11.在DNA分离过程中,通常要进行透析,其目的是除去小分子的无机离子。
12.在分离质粒DNA的菌体培养过程中,加入氯霉素有两个好处:
①可以扩增质粒DNA;
2抑制菌体数量,有利于裂解。
13.在DNA分离过程中造成DNA分子断裂的因素很多,主
要有:
①核酸酶降解;②化学降解;
3物理剪切。
14.在DNA保存液中,常加一滴氯仿,主要是起抑制真菌污染的作
用。
15.按照人们的意愿,改变基因中碱基的组成,以达到基因突变的技术称为定点突变。
16.在cDNA的合成中要用到S1核酸酶,其作用是切除在第二链合成时形成的发夹环。
17.在简并引物的设计中,常常要用到di(次黄嗦吟),原因是di可以同任何碱基相配。
18.在分离DNA时,要戴手套操作,原因是手上常有核酸酶。
19.乙醇沉淀DNA的原理是乙醇使DNA分子脱水。
20.简并引物PCR主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计一组混合引物来合成相应的基因。
21.超离心法纯化质粒DNA时,选用CsCl作介质的优点是:
①CsCl与不同DNA嵌合的能力不同;
②CsCl可以自动形成梯度密度,从而使不同分子质量的DNA分子得以分开。
22.可以用透析法除去DNA溶液中的氯化锚。
二、选择题(单选或多选)
1.从细胞或组织中分离DNA时,常用蔗糖溶液,目的是(B)。
A.抑制核酸酶的活性B.保护DNA,防止断裂
C.加速蛋白质变性D.有利于细胞破碎
2.不是所有松弛型质粒都需要进行扩增的,如pBS、pUC载体系统就不必进行氯霉素扩增,这是因为
这些质粒的拷贝数很高,达到(D)。
A.30~50B.100~200C.300~400D.500~700
3.有两种确定核酸中核昔酸序列的方法:
化学序列分析法
(Maxam-Gilbert)和酶学序列分析法
(Sanger)。
酶学测序法的基本原理/优点是(B)。
A.碱基与特殊染料间不同的相互作用B.一个合成引物的延伸和DNA合成的可靠终止
C.限制性位点与DNA末端标记的相关性D.可同时对DNA双螺旋的两条链进行测序
E.反应是DNA特异的,RNA不会带来干扰,既减少纯化步骤,也节约开支
4.CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA的原理是(C)。
A.氯化锚可以较多地插入到线状DNA中B.氯化锚可以较多地插入
到SCDNA中
C.EB可以较多地插入到线状DNA中D.EB可以较多地插入到SCDNA中
5.关于cDNA的最正确的说法是(C)o
A.同mRNA互补的单链DNAB.同mRNA互补的双链DNA
C.以mRNA为模板合成的双链DNAD.以上都正确
6.用碱法分离质粒DNA时,染色体DNA之所以可以被除去,是因为
(C)o
A.染色体DNA断成了碎片B.染色体DNA分子质量大,而不能释放
C.染色体变性后来不及复性D.染色体未同蛋白质分开而沉淀
7.下面哪一种特性不是密码所具有的?
(C)
A.偏爱性B.简并性
C.重叠性D.连续性
8.用SDS-酚抽提DNA时,SDS的浓度是十分重要的,当SDS的浓度
为0.1%时,(B)。
A.只能将DNA抽提到水相B.只能将RNA抽提到水相
C.可将DNA、RNA一起抽提到水相D.DNA和RNA都不能进入水相
9.关于碱解法分离质粒DNA,下面哪一种说法不正确?
(D)
A.溶液I的作用是悬浮菌体B.溶液II的作用是使DNA变性
C.溶液III的作用是使DNA复性
D.质粒DNA分子小,所以没有变性,染色体变性后不能复性
10.异戊醇的作用是(D)。
A.使蛋白质脱水B.使DNA脱水
C.帮助DNA进入水相D.减少气泡,促进分相
11.关于PCR扩增停滞的原因有很多种,但下列各项中,(B)不是主要原因。
A.底物(模板)过剩B.dNTP的大量消耗
C.产物的聚集D.非特异性产物的竞争性抑制
12.Clark做了一个有趣的实验,发现Ta^DNA聚合酶可以不需要模板在双链DNA的末端加一个碱基,
主要是加(B)。
A.dGTPB.dATPC.dCTPD.dTTP
13.PCR反应的必备条件是(B)□
A.至少有100个起始DNA分子B.拟扩增的目的DNA片段的部分序列信息
C.扩增需要cDNA模板D.至少100kb长度的模板
E.未损坏、未降解的DNA样品
14.哪项技术适于分离完整染色体长度级别的DNA分子?
(E)
A.PCRB.Southern印迹C.杂交D.转化E.脉冲电场凝胶电泳
15.DNA带电荷的性质如何,是什么赋予DNA这种电荷性质?
(C)
A.正电性,来自磷酸根B.正电性,来自碱基
C.负电性,来自磷酸根D.负电性,来自碱基E.负电性,来自核糖基
16.当载有文库的菌落被转移到杂交膜上用于筛选时,需要碱性溶液处理的步骤,这一步骤的意义何
在?
(E)
A.促使文库DNA结合到杂交膜上B.启动杂交探针与互补序列间的反应
C.标记DNA,便于检测D.刺激DNA复制,增加质粒拷贝数
E.裂解菌体细胞,并使DNA变性
17.在某些PCR反应中必须使用简并引物,这是因为(A)。
A.设计的模板是蛋白质的一段肽链B.简并引物合成较为方便
C.简并引物的退火温度较低D,简并引物与模板杂交的效率最高
18.你打算扩增下面所示的两段序列之间的DNA,
5'-GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG-3'
3'-CTGGACACCTTCGGTATGCCCTAAC-5,
最适合的引物序列是(B)。
A.
引物1,
5,
-CTGGACACCTTCG引物2,
5,
-GTATGCCCTAAC
B.
引物1,
5,
-GACCTGTGGAAGC引物2,
5,
-CAATCCCGTATG
C.
引物1,
5,
-CGAAGGTGTCCAG引物2,
5,
-GTTAGGGCATAC
D.
引物1,
5'
-GCTTCCACAGGTC引物2,
5'
-CATACGGGATTG
19.DNA变性:
(ACE)。
A.包括DNA双螺旋的解链B.可以由低温产生C.是可逆的
D.是磷酸二酯键的断裂E.包括氢键的断裂
三、判断题
1.氯霉素扩增时,加氯霉素的时间是主要的,因为加的太早,菌数
不够;加入时间过迟,菌龄过老,
容易自溶。
正确
2.所谓引物就是同DNA互补的一小段RNA或DNA分子。
正确
3.脉冲凝胶电泳采用一个很强的电场来分离非常长的DNA分子,其原理在于迫使DNA分子根据长
度的不同而具有不同的速度,并按大小顺序通过凝胶。
错误,以S形移动,移动速度与长度无关,
电场方向周期性变化,迫使DNA改变方向,分子越大,改变方向所需
时间越长,移动速度越慢
4.琼脂糖-EB电泳法分离纯化CCCDNA原理是根据EB可以较多地插入到CCCDNA中,因而迁移
速度较快。
错误,EB插入少,体积小,迁移快。
插入EB会使DNA负
超螺旋向正超螺旋转化,EB
会使DNA显的紧缩,即向正超螺旋转化
5.如果PCR的每一次循环都把上一次循环中合成的DNA增加了1倍,那么10个循环就扩增了1000
倍,20个循环就扩增了100万倍,30个循环就扩增了10亿倍。
正确
6.PCR既能用于扩增任何天然存在的核昔酸序列,又能重新设计任何天然核昔酸序列的两个末端。
因
此,任意两个天然存在的DNA序列都能快速有效的扩增,并拼接在一起。
正确
7.最有效的制备纯RNA的方法是让其在细胞中超表达,然后提纯。
错误,最好是克隆编码该RNA的
DNA片段到病毒RNA聚合酶有效识别的启动子下游,然后体外转录
8.大量制备已被克隆基因编码蛋白质产物的常用方法是体外转录和
翻译。
错误,常有方法是让蛋白质
在细胞中过量表达,然后纯化
9.通过报告基因与来自于目的基因上游和下游各种DNA片段的结合,研究基因的调控序列。
正确
10.温度敏感突变型是非常有用的,在这些突变型中,可以通过对温度的改变控制这些突变体中异常
表型的出现。
正确
11.用人工合成的含有所需碱基变化的寡聚核昔酸,可以将特殊突变引入克隆的基因。
正确
12.简并引物是根据已知DNA序列设计的引物群。
错误,根据已知蛋白质氨基酸序列设计的引物群
13.在DNA储存液中加一滴三氯甲烷,可防止真菌的污染。
正确
14.密码的偏爱性是指不同种属的生物对简并密码具有不同的使用频率。
正确
15.引物设计时必须使引物的5,端与模板链一致,而3,则可以人为地修改以加入酶切位点序列。
错误。
正相反
四、问答题
1.分离DNA时,为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA和蔗糖?
答:
①EDTA是螯合剂,可同Mg2+螯合,使核酸酶失去了作用的辅助因子,而被抑制活性。
②蔗糖增加缓冲液的黏度,保护DNA不易断裂。
2.分离DNA用酚抽提蛋白质时,离心后,为什么蛋白质总是停留在水相和酚相之间?
答:
酚使蛋白质分子间脱水而变性,变性蛋白的密度比水大,但比酚小,因此停留在中间层。
3.溶菌酶是破坏细菌细胞的有效方法。
但有些细菌抱子对溶菌酶不敏感,因如何处理?
答:
添加DTT、疏基乙醇或8.Omol/L的尿素等增加细菌抱子对溶菌酶敏感性。
4.为什么从细胞中分离DNA时往往会断裂?
答:
(1)胞内存在很高的核酸酶活性,DNA裸露后,很容易遭到核酸酶的降解。
(2)在分离DNA的过程中,要用到一些酸碱等化学试剂,也会使DNA断裂。
(3)在DNA的分离过程中要经过多次离心、吸取、转移等,产生的机械张力剪切会使DNA断裂。
5.在DNA分离过程中,酚通常与氯仿联合使用,即使不联合使用也
要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一
次,为什么?
答:
原因是酚和水有一定程度的互溶,所以单独使用酚抽提DNA,最终不能除去酚,残留的酚会
使起切割和连接作用的限制性内切核酸酶和连接酶变性。
氯仿也是蛋白质变性剂,它不与水互溶,但
是能够同苯酚互溶。
这样,酚和氯仿联合使用,就可以带走残留的酚。
6.何谓简并引物(degenerateprimer)?
答:
所谓简并引物是指根据肽链的氨基酸序列(或部分序列),并充分考虑密码子的简并性而设计的、
用于PCR扩增的混合引物群体,这种混合引物之间具有不同的碱基组成,但碱基的数量是相同的。
由
于充分考虑了密码的简并性,在这种混合引物中必定有一种引物是可
以和该基因的DNA序列精确互
补。
7.简并引物设计的一般原则是什么?
答:
(1)选择保守区设计简并引物。
(2)选择简并性低的氨基酸密码区设计引物。
(3)注意密码的偏爱性。
(4)使用尽可能短的引物,以降低简并性,最短可用15〜20个碱基。
(5)由于Ta^DNA聚合酶在PCR扩增时容易掺入错误碱基,所以设计
的引物,其3'端尽量使用具
有简并密码的氨基酸。
8.如何用PCR制备突变DNA分子?
答:
可用PCR进行定点突变(SiteDirectedMutagenesis),即在
特定位点引入点突变。
该突变可以
是碱基替代、插入或者缺失。
为了在靶基因特定位点导入突变,在PCR
引物设计时,将一条引物设计
成与靶序列互补但在预期位点作碱基替换或缺失。
在引物中的诱发突
变序列应该位于引物的5,端或在
引物中间部位,但绝不能位于3,端。
诱变引物的3,区域(至少6〜10
个碱基)必须与靶DNA完全互补
以使引物与模板的退火完全而且沈Q酶能延伸引物。
PCR反应先在低特异性环境下反应5〜10个循环
以使错配得以发生(即在松弛的温度下),一旦少量的突变模板产生,就可以作为靶序列与引物完全互补。
扩增反应的终产物即是所需的含有突变的扩增DNA分子,然后通过克隆和序列分析进行确证。
9.用PCR技术扩增目的DNA片段时,需要一对特意合成的引物来限
定目的片段的扩增区域,试说明
引物序列合成应遵循什么样原则。
答:
1)引物长度一般为15〜30个核昔酸。
2)引物的碱基尽可能随机,G+C含量一般占45%~55%°Tm=4(G+C)+
2(A+T)
3)引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。
4)两个引物之间不应存在互补序列,尤其应避免3,端的互补重叠。
5)引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70%,引物3,末端连
续8个碱基在待扩增区以
外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
6)引物3,端碱基是引发延伸的起点,因此一定要与模板DNA配对。
7)引物与模板结合时,引物的5,端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。
8)引物的5,端可以修饰,如附加限制酶位点,引入突变位点等。
10.PCR技术体外扩增DNA分子的基本原理是什么?
答:
PCR是在试管中进行的DNA复制反应,基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理,以
及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质,人为地控制体外合成系统的温度,以
促使双链DNA变成单链,单链DNA与人工合成的引物退火,然后耐热
DNA聚合酶以dNTP为原料
使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。
PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。
需要重
复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成,即高温变性、低
温退火、中温延伸3个步骤构成PCR反应的一个循环,此循环的反复进行,就可使目的DNA得以迅
速扩增。
DNA模板变性:
模板双链DNA单链DNA,94°C。
退火:
引物
+单链DNA杂交链,引物
的Tm值。
引物的延伸:
温度至70°C左右,TaqDNA聚合酶以4种dNTP为原料,以目的DNA为模
板,催化以引物3'末端为起点的5,一3,DNA链延伸反应,形成新
生DNA链。
新合成的引物延伸链经
过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR,就是如此反复循环,
使目的DNA得到高效快速扩增。
11.TaqMan定量PCR扩增的原理是什么?
答:
TaqMan定量PCR使用3个引物,或两个引物和一个特异性探针。
两个引物接合到目的DNA
上下游,以进行目的DNA的合成。
第三个引物,或称探针,是特异合
成的一段短的DNA片段,可特
异性第接合到一条DNA链中间。
探针带有两个修饰基团,5,端荧光
报告基团(R)和3,端的荧光淬灭
基团(Q),这两个基团由于距离靠近会发生荧光淬灭而检测不到荧光。
随着PCR的进行,TaqMan
探针接合到目的DNA序列上,并且被具有外切酶活性的TaqDNA酶逐
个切除而降解。
被切下来的荧
光基团(R)解除了荧光淬灭的束缚,会在激发光下发出荧光,因此所产生的荧光强度直接反应了扩增靶DNA的总量。
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