Lipstatin高产菌株筛选Word文档格式.docx
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Strainbreeding;
Inducedmutation;
Streptomycestoxytricini
收稿日期:
2006-11-29
作者简介:
韩俊茹,女,生于1966年,女,硕士。
研究方向:
生物制药。
Lipstatin(利普司他汀)是毒三素链霉菌(Stretomycestoxytricini)的代谢产物,能选择性抑制胃肠道中胰脂肪酶的活性,减少脂肪的分解和吸收,其四氢衍生物奥利司他(orlistat)已被Roche公司开发为减肥药(商品名:
赛尼可,Xenical)[1,2],是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用上市的治疗肥胖症的药物[3]。
因此,发酵法生产lipstatin备受关注。
提高lipstatin的发酵生产水平主要依赖于菌种选育和发酵工艺(培养基和培养条件)的优化这两个相辅相成的环节。
本文采用紫外线照射和微波交替处理,并结合豆油耐受性菌株的理性化筛选,选育lipstatin高产菌株,获得了高产突变株XC-lp-69,发酵水平较原始菌株(XC-lp-2)提高了2倍多,且该菌株经多次传代后高产特性稳定性较好。
1材料与方法
菌种
毒三素链霉菌(Stretomycestoxytricini)XC-lp-2由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供,发酵效价300μg/ml左右。
培养基
(1)斜面及分离平板培养基(g/L)可溶性淀粉,蛋白胨,KNO3,NaCl,KH2PO4,琼脂,去离子水配制,~。
(2)摇瓶种子培养基(g/L)冷榨黄豆饼粉,甘油,酵母膏,豆油,KNO3,MgSO4·
7H2O,自来水配制,~。
(3)发酵培养基(g/L)冷榨黄豆饼粉,甘油,大豆卵磷脂,酵母粉,豆油,自来水配制,~。
培养条件
(1)斜面培养条件培养温度(30±
)℃,相对湿度35%~50%,培养时间120~150h。
(2)种子培养条件培养温度27℃,250ml三角瓶装量25ml,转速240r/min,培养时间20~24h。
(3)发酵培养条件培养温度27℃,250ml三角瓶装量25ml,转速240r/min,培养时间120h。
诱变处理
(1)紫外线照射将单孢子悬浮液置紫外诱变箱(紫外灯功率30W,波长253nm照射垂直距离30cm)中诱变处理一定时间,用黑布包好,在红灯下用无菌水做梯度稀释后涂布平板,30℃避光培养5~6d,挑单菌落传斜面。
(2)微波处理将单孢子悬浮液置于灭菌10ml试管中,在500ml烧杯中冰浴;
然后将冰浴烧杯连同试管放入800W的微波炉中,功率开至中档,照射一定时间,经梯度稀释后涂布平板,30℃培养5~6d,待菌落成熟后挑单菌落传斜面。
耐豆油突变株筛选
将经过UV照射、微波处理或两者交替处理后得到的孢子悬液梯度稀释后,分别涂布于含一定豆油浓度的分离平板上,30℃培养。
分析方法
(1)Lipstatin发酵效价测定
试样制备取发酵液10ml,4000r/min离心15min,上清液用丙酮1∶4的比例稀释摇匀浸泡1h,取上清液再次10000r/min离心3min或膜过滤,取清液进行HPLC测定胞外效价,并用同样的方法测定菌丝体沉淀中的产物量(胞内效价)。
本文中发酵效价为胞内外效价之和。
HPLC色谱条件色谱柱C18ODS(×
250mm,5μm),柱温35℃,检测器DAD(HP1100),检测波长210nm,流动相为乙腈∶水(86∶14),流速/min。
(2)pH测定用酸度计测定。
(3)菌丝浓度测定取10ml发酵液,4000r/min离心15min,测定沉淀物在发酵液中所占比例作为菌丝浓度。
2结果与讨论
出发菌株的选择
取4℃冰箱保存的10株菌(XC-lp-2经多次自然分离或其他诱变处理,经不同模型选择的较优菌株),连续发酵三批,其结果平均值见表1。
由表1可以看出OT-3菌株lipstatin发酵效价较高,因此选择OT-3为出发菌株。
紫外线诱变处理结果
试验中对出发菌株OT-3进行不同剂量的UV诱变处理,经梯度稀释后涂布平板,待菌落生长成熟后,从每个处理剂量平板中挑取30个单菌落分别传斜面,逐一接种发酵瓶,考察诱变株的发酵水平,统计其致死率、变异率(±
10%以上)和正变率,所得结果见表2。
由表2可知,随紫外线照射时间的延长,致死率、变异率相应增加,但正变率较高出现在偏低剂量(60s),这与有关报道[4]一致,故后续试验中均采用UV照射60s。
经多次UV诱变选得菌株OT-63,较出发菌株OT-3效价提高20%,达到636μg/ml。
微波诱变处理结果
试验中对出发菌株进行了不同时间的微波照射处理,稀释涂平板,待菌落成熟后转接斜面,摇瓶发酵考察。
统计致死率、正突变率和产量的最大提高率,结果见表3。
由表3可以看出,随着微波照射时间的延长致死率上升,正变率下降,但产量最大提高率随时间延长而上升,故后续试验采取微波照射7min。
以OT-63为出发菌株,进行微波诱变,微波处理后的孢子悬浮液经适当稀释后涂布于分离平板,待菌落成熟后,挑单菌落传斜面,进行摇瓶发酵初筛和复筛。
得到高产菌株W-39,总发酵效价和胞外发酵效价均高于菌株OT-63,结果见图1、图2。
从图1、图2可以看出,OT-63培养至发酵结束时(5d)分泌至胞外的lipstatin只有35%,而W-39达50%,比原来提高了15%,且总的发酵效价也提高了18%。
推测微波的作用改变了菌体细胞膜的通透性,促进了胞内lipstatin的外排,减轻了lipstatin对其自身表1冰箱保存菌株产生lipstatin的情况表2不同UV剂量诱变处理结果(表3不同时间微波处理结果生物合成途径的反馈调节作用,促进lipstatin的合成。
耐豆油突变株筛选
文献报道,豆油为lipstatin的合成提供前体[5,6]。
通过选育耐豆油突变株,能充分利用培养基中的豆油合成大量前体物质参与lipstatin的生物合成,大幅度提高产量。
以OT-63的单孢子悬浮液经适当稀释后,涂布于含不同浓度豆油的分离平板上,培养观察,结果如表4。
从表4可以看出,当豆油浓度为%(V/V)时,lipstatin产生菌的生长受到严重的抑制,同时发现随着豆油浓度的增加,培养皿中菌落的生长速度也随之变慢,且菌落变小。
确定%(V/V)剂量进行耐受突变株的筛选,进一步对耐豆油变株的生产能力进行了统计分析,其产量分布结果见图3。
从图3可以观察到耐豆油突变株中,lipstatin合成能力高于出发菌株的占42%,低于出发菌株的占10%,与出发菌株持平的占48%。
如此高的正变率,说明了此筛选方法的合理性。
表4不同浓度豆油对lipstatin产生菌生长的影响
图3耐豆油变株产量分布图[耐受剂量%(V/V)]经过5轮UV和微波交替处理,高浓度豆油平板选择,得到菌株XC-lp-69发酵效价达911μg/ml,较原始菌株XC-lp-2(300μg/ml)提高了2倍多。
推测这种诱变和筛选方法有助于提高菌体的脂肪酶的合成能力或活性,或提高脂肪酶的分泌速度,增加lipstatin合成所需前体浓度,提高lipstatin的效价。
高产菌株XC-lp-69的稳定性考察
用群体传代的方法考察了高产菌株XC-lp-69的斜面传代稳定性,结果见表5。
表5XC-lp-69高产菌株的稳定性考察表5结果显示,经过连续传5代,菌株XC-lp-69的生产能力基本一致,说明菌株XC-lp-69的高产性能遗传特性稳定。
3讨论
通过UV和微波复合筛选得到遗传性能稳定的lipstatin高产菌株XC-lp-69。
【参考文献】
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[2]MeliaAT,ZhiJ,ZelaskoR,etal.Theinteractionoftheliposeinhibitororlistatwithethanolinhealthyvolunteers[J].EurJClinPharmacol,1998,54(9~10):
773
[3]HollanderPA,ElbeinSC,HirschIB,etal.Roleoforlistatinthetreatmentofobesepatientswithtype2diabetes[J].DiabCare,1998,21(8):
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[4]周德庆着.微生物教程[M].北京:
高等教育出版社,1998
[5]MarkusG,WolfgangE,AdelbertB,etal.Biosynthesisoriginofhydrogenatomsinthelipaseinhibitorlipstatin[J].JBiolChem,2000,275(28):
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[6]MarkusG,WolfgangE,AdelbertB,etal.Biosynthesisoflipstatin[J].JOrgChem,2001,66(13):
4668
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