运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株.docx
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应用微生物技术实验设计
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运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株
一.实验目的
1.学会从土壤中筛选到植酸酶菌株。
2.掌握紫外诱变菌株的方法。
3.学会从变异的菌株中筛选高产菌。
二.实验原理
植酸(又称为肌醇六磷酸)在多种植物组织(特别是米糠与种子)中作为磷的主要储存形式,其结构是肌醇的6个羟基均被磷酸酯化生成的肌醇衍生物。
植酸以植酸钙镁钾盐的形式广泛存在于植物种子内,也存在于动物有核红细胞内,可促进氧合血红蛋白中氧的释放,改善血红细胞功能,延长血红细胞的生存期。
植酸本身就是对人体有益的营养品,植酸在人体内水解产物为肌醇和磷脂,前者具有抗衰老作用,后者是人体细胞重要组成部分。
植酸酶,是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称,属磷酸单酯水解酶。
具有特殊的空间结构。
植酸酶作为一种新型的饲料添加剂,能分解饲料中的植酸,形成禽畜可利用的磷酸,提高饲料中有机磷的利用率,减少添加无机磷,降低饲料成本,减轻磷污染,同时解除植酸的抗营养作用,提高饲料的营养价值,具有非常可观的经济效益和生态效益。
以微生物的自然变异作为基础的筛选菌种的机率并不很高。
因为自发突变率小,一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。
为了加大突变频率,可采用物理或化学的因素进行诱发突变。
物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV,UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯,其光谱比较集中在253.7nm处,这与DNA的吸收波长一致,可引起DNA分子结构发生变化,特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体,从而引起菌种的遗传特性发生变易。
在生产和科研中可利用此法获得突变株。
从土壤中筛选到一株植酸酶高产菌株,利用紫外线对该菌株进行诱变提高植酸酶产量,并采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素阴离子交换层析和sephadex G-100 凝胶过滤层析对植酸酶进行分离纯化。
三.实验材料
1.材料
(1)筛选培养基:
1%植酸钙,3%葡萄糖,200U/ml青霉素钠,0.5%NH4NO3,0.05%KCl,0.003%,MnSO4.4H2O,0.05%MgSO4.7H2O,0.003%FeSO4·7H2O,1.5%琼脂,pH5.5。
(2)液体发酵培养基:
1.5%葡萄糖,0.3%蛋白胨,0.2%(NH4)2SO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.05%KCl,0.003%MnSO4·4H2O,0.003%FeSO4.7H2O,pH5.5。
(3)查氏合成培养基:
硝酸钠2g,磷酸氢二钾1g,氯化钾0.5g,硫酸镁0.5g,硫酸亚铁0.01g,蔗糖30g,琼脂15~20g,水1000mL,pH自然,121℃灭菌20min。
(4)斜面培养基:
0.05%MgS04·7H2O,0.003%MnSO4·7H2O,0.003%FeSO4·7H20,麸皮汁100ml,1.5~2%琼脂,pH5.5。
(5)土壤:
去除土层表面枯枝、杂草和砂石,收集距表层5cm-10cm的土壤。
2.仪器
水浴锅、培养箱、烧杯、培养皿、灭菌锅、漏斗、试管、摇床、分光光度计、pH试纸、电炉、干燥箱、超净工作台、移液管等
四.实验步骤
1.流程
土壤样品稀释液
测量各透明圈与
菌落直径的大小
初筛
保藏菌种
菌种鉴定
复筛
4
6
8
10
去离子水
(ml)
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0
钒钼终止液
2
2
2
2
2
2
OD
值
按表
1
加入试剂后,在
415nm
波长下测
OD
值,并绘制标准曲线。
复筛
测酶活
保藏菌种
制备单孢子菌悬液
紫外诱变
4
6
8
10
去离子水
(ml)
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0
钒钼终止液
2
2
2
2
2
2
OD
值
按表
1
加入试剂后,在
415nm
波长下测
OD
值,并绘制标准曲线。
复筛
菌种鉴定
紫外诱
4
6
8
10
去离子水
(ml)
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0
钒钼终止液
2
2
2
2
2
2
OD
值
按表
1
加入试剂后,在
415nm
波长下测
OD
值,并绘制标准曲线。
复筛
菌种鉴定
紫外诱变
平板初筛
摇床复筛
测酶活
保藏菌种
分离纯化
2.方法
(1)菌株的筛选:
土壤样品稀释1×10^5倍,涂布于筛选培养基上,30℃培养72h,挑取产生透明圈的菌株。
对初筛得到的菌株进行摇瓶复筛,在220r/min的转速下发酵培养,测其酶活。
-[崔志芳,刘娜,季爱云.植酸酶产生菌的快速筛选及发酵条件优化[J].中国酿造.2010(07)]
(2)酶活的测定:
钒钼酸铵法略加改进后进行测定。
取1ml粗酶液加入2ml植酸钠溶液并摇匀(对照加入2ml钒钼终止液),37℃保温反应30min,立即加入2ml钒钼终止液(对照加入2ml植酸钠溶液),415nm测OD值,参照磷标准曲线计算酶活。
酶活定义:
按上述方法,在pH5.5的条件下,每分钟从0.0051mol的植酸钠溶液中释放1umol无机磷所需的酶量为一个活力单位(U)。
磷标准曲线制备
原理:
利用植酸酶水解植酸盐释放无机磷,通过加入酸性钼一钒试剂,使水解反应停止,同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应,形成黄色的钒钼磷络合物,在415nm波长下测定磷的含量
试管号
1
2
3
4
5
6
标准磷溶液(ml)
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
无机磷浓度(mmol/l)
0
2
4
6
8
10
去离子水(ml)
2
1.6
1.2
0.8
0.4
0
钒钼终止液
2
2
2
2
2
2
OD值
按表加入试剂后,在415nm波长下测OD值,并绘制标准曲线。
-[杨平平,王燕,史宝军,陶文沂.对发酵生产植酸酶过程中植酸酶活性测定方法的初步探讨[J].食品与发酵工业.2003(09)]
(3)菌种鉴定:
将复筛酶活力最高的菌接种于查氏合成培养基上,28℃恒温培养箱培养3d后,观察菌落形态变化。
(4)单孢子菌悬液制备:
将复筛酶活力最高的黑曲霉菌斜面用10ml无菌水洗下,倒入盛有玻璃珠的无菌三角瓶中,手持振荡20min,用带有无菌脱脂棉的漏斗过滤,然后用无菌生理盐水将所得孢子洗涤2-3次,制成单孢子悬液。
(5)诱变处理:
取复筛酶活力最高的菌株的孢子悬液10ml加入直径为9cm的无菌培养皿中,在15W紫外灯下,距离28cm,进行诱变处理,时间依次为0、3、6、9、12、15min。
经紫外线诱变后得到的突变株,将其中透明圈与菌落直径比值较大的进行复筛,测定突变株的酶活。
-[焦秀凤,盛晓莉,单继阳,蒋立建.纤维素分解菌的筛选及其紫外诱变[J].化学与生物工程.2010(01)]
(6)斜面低温保藏法:
将菌种接种在适宜斜面培养基的上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间(保藏期)再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断。
(7)植酸酶的分离纯化:
①取发酵后的培养液在4℃,4000r/min离心20min,取上清液,分别加入固体硫酸铵,使硫酸铵饱和度分别为20%~90%,对植酸酶进行沉淀。
沉淀重新溶解在乙酸缓冲液中,对蒸馏水透析脱盐。
②透析后的植酸酶溶液用DEAE-纤维素阴离子交换层析柱进行分离纯化,用NaCl溶液进行线性梯度洗脱,于280nm检测蛋白质,分部收集,测定每管酶活力。
③将上述洗脱液用SephadexG-100凝胶柱进一步分离,用乙酸缓冲液进行洗脱,于280nm波长检测洗脱液中蛋白质的含量,记录洗脱曲线,分部收集酶活力较大的部分。
(8)酶学性质研究:
①用纯化的植酸酶分别在pH2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.6、7、7.5、8的乙酸缓冲液中进行酶促反应,测定酶的最适pH。
将不同pH的植酸酶溶液,在37℃处理30min,测定酶活力,研究酶的pH稳定性。
②纯化后的植酸酶溶解在乙酸缓冲液中,分别在不同温度(20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃)下进行酶促反应,测定植酸酶的最适温度。
将植酸酶溶液分别在不同温度下保温30min,再在37℃测定酶活力。
五.注意事项
1.紫外线对人体的细胞,尤其是人的眼睛和皮肤有伤害,长时间与紫外线接触会造成灼伤。
故操作时要戴防护眼镜,操作尽量控制在防护罩内。
2.空气在紫外灯照射下,会产生臭氧,臭氧也有杀菌作用。
臭氧过高,会引起人不舒服,同时也会影响菌体的成活率。
臭氧在空气中的含量不能超过0.1%~1%。
3.去除土层表面枯枝、杂草和砂石,收集距表层5cm-10cm的土壤。
4.应用菌株采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌株生长充分以后,转移至4~8℃冰箱中保存。
此法仅用于应用菌种的短期保存,并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况,经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同,细菌:
1个月;酵母菌:
2个月;霉菌及芽胞:
3个月。
.
参考文献
1.杨平平,王燕,史宝军,陶文沂.对发酵生产植酸酶过程中植酸酶活性测定方法的初步探讨[J].食品与发酵工业.2003(09)
2.崔志芳,刘娜,季爱云.植酸酶产生菌的快速筛选及发酵条件优化[J].中国酿造.2010(07)
3.焦秀凤,盛晓莉,单继阳,蒋立建.纤维素分解菌的筛选及其紫外诱变[J].化学与生物工程.2010(01)
4.夏广欣.土壤放线菌的筛选、鉴定及其发酵产物的活性研究[D].东北农业大学2012
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- 关 键 词:
- 运用 紫外 诱变 获得 筛选 植酸酶 高产 菌株