分子生物技术在水产动物病害防治研究中的应用及其展望精Word格式.docx
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分子生物学技术已经成为研究水产动物病害的一个重要手段,对于我国水产养殖业高效和可持续发展也有着十分重要的影响。
1 应用于水产动物病害防治研究的分子生物技术
1.1 DNA分子标记技术
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,直接揭示来自DNA的变异。
分子标记的发展对动物遗传学产生了革命性的影响,利用分子标记可以快速直接的观察和探究到整个基因组的基因变异。
如今,其已被广泛应用到基因定位与克隆、作物遗传育种、物种鉴定及疾病诊断等领域中。
目前应用于水产研究的分子标记有同工酶、线粒体DNA、RFLP、RAPD、AFLP、微卫星、SNP和
[1]
EST标记8种。
这里主要介绍应用于水产病害的3种标记:
RFLP标记、AFLP标记以及微卫星标记。
1.1.1 RFLP标记
RFLP(restricfragmentlengthpolymorphism)即限制性片段长度多态性,限制性酶可识别DNA上较短的序列,在识别位点上切开DNA,单个核苷酸的变化即可导致限制性酶切位点的缺失和增加,总DNA酶切后产生限制性酶切多态性。
然后可与DNA探针或其它技术相结合对病原菌进行检测和鉴定。
Nicholson等(1996)在对水产上引起多种鱼病的双RNA病毒进行基因组差异分析时,应用RFLP技术,对编码VP2蛋白的一段cDNA进行酶切、分析,为不同地区水产双RNA
[2]
病毒的分类提供依据。
Marina等(2004)为了增加对不同地区鲑鱼致病菌Lactococcusgarvieae菌间的遗传关系的认识,利用RFLP结合血清学数据,研究了采自不同地区的病原菌间的遗传相似性,结果显示各发病地点的病菌均为纯
3]此外,RFLP技术也已被应用于检测一些鱼类致病菌在环境中的分布情况,以及其在不同时期的存活情况[4]。
1.1.2 AFLP标记
AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism)———扩增片段长度多态性技术,是建立在RFLP基础上的选择性PCR,可产生丰富而稳定的遗传标记,被认为是一种理想有效的分子标记技术,现已广泛的应用于遗传连锁图谱,遗传多样性分析和基因定位等研究中。
Nakamvra等(2001)利用AFLP标记技术和分群分析法结合构建了虹鳟白化病个体的遗传图谱,发现其中有4个标记与白化病基因位点相关并紧密连锁。
这将有助于克隆虹鳟显性白化病基因,为从分子水平诊断、防治虹鳟白化病提
[5]
供一条有效的途径。
Lund等(2002)对引起多种鱼疖病或溃疡病的气单胞菌属进行了遗传多样性分析,结果表明从大比目鱼、大菱鲆和鲑鱼中所分离到的该菌的遗传多样性要高于狼鱼和鳕鱼[6]。
Thomas等(2004)应用AFLP技术对抗鲑鱼贫血症的个体和染病死亡个体进行了基因型分析,得到了340个AFLP标记,并与TDT方法结合来检测其QTL(QuantitativeTraitLoci)[7]。
Arias等(2004)为了了解鱼类致病菌共质菌属柱形菌的种内差异,应用AFLP结合16S
rDNA的RFLP分析,对采自不同地区的30条养殖鱼类体内分离到的F1柱形菌进行了研究,为研究该菌引起的鱼类流行病提供了资料[8]。
1.1.3 微卫星DNA标记
微卫星标记是共显性的分子标记,能够揭示等位位点的遗传差异,具有RAPD等标记所无法比拟的稳定性,可以方便的用于辅助育种、覆盖目标基因的连锁遗传图谱的构建,是分子标记辅助育种的前提,通过基因图谱可以详细了解控制那些有价值的抗病性状的位点组成和表达调控机制,以便于操纵这些基因,更有效的避免一些病害的爆发。
Maria等(2003)应用111个微卫星标记和352个AFLP标记构建了日本比目鱼的第一个遗传连锁图谱。
目前困扰全球比目鱼养殖业的疾病主要有病毒性表皮增生,病毒性神经坏死和体色异常等,该图谱的构建对于查找这些疾病致病基因的位点有很大帮助[9]。
1.2 PCR及其相关技术
PCR又称DNA体外扩增技术,其原理是通过设计核苷
收稿日期:
2005-06-16;
修回日期:
2005-07-191 基金项目:
辽宁省科技攻关项目(2004203001);
大连市科技攻关项目(2004BINS030);
国家自然基金资助项目(30571410)1 作者简介:
刘晓慧(1982-),女,硕士研究生,研究方向:
动物分子生物学;
通讯作者:
周遵春(1967-),男,副研究员,研究方向:
海洋
生物技术1
第2期
刘晓慧等:
分子生物技术在水产动物病害防治研究中的应用及其展望
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酸引物,在特定条件下使其与模板DNA相结合,并进行扩增。
20世纪90年代起,PCR及其相关技术相继被应用于各种疾病的诊断,与传统诊断方法相比,其具有灵敏度高、反应快、操作简便等优点。
现已被应用于水产动物病害的诊断中,并已显示出广阔的应用前景。
1.2.1 常规PCR技术
PCR扩增法可迅速而且直接的从样品中检测到病原体,尤其是对于一些需复杂营养条件的微生物病原体更为适用[10]。
Gibello等(1999)利用特异性引物对于回接和自然感染病毒的鲑鱼个体进行扩增,结果检测为阳性,且无其它同属病原菌的扩增产物出现[11]。
Byers等(2002)利用rDNA操纵子的16S-23SrDNA基因间隔区设计特异性引物,进行PCR扩增,检测鲶鱼体内感染的黄杆菌属柱形菌,结果表明这种特异性的引物灵敏度非常高,原菌的存在也可以检测得到[12]。
)鱼类黄杆菌属柱形菌的,特异性引物进行到一段1193bp,而在其它相关菌中无此结果出现。
该PCR产物在模板低于0.1ng的情况下也可被检测出来[13]。
应用PCR检测RNA类的病原体需使用RT-PCR技术,即先将RNA反转录成cDNA,再以此为模板进行扩增。
Mikalsen等(2001)应用RT-PCR技术检测鲑鱼贫血症感染早期的情况,对染病5,15,25d的养殖鲑鱼进行了病毒检测,结果发现直到所有器官被感染为止,该病毒在体内呈现稳定的增加趋势[14]。
陈信忠等(2001)应用RT-PCR技术检测了闽南地区紫石斑幼鱼爆发性传染病病原,结果检出为神经坏死病毒,且在不同日龄的幼体体内均为阳性,说明幼体易感,并对该病毒的RT-PCR产物进行了核酸测序和序列分析[15]。
1.2.2 PCR衍生技术
由于常规的PCR技术受多因素的影响,存在非特异性扩增,假阳性等问题,近年来PCR技术迅速发展,形成了一系列的适用于不同目的的衍生技术,如巢式PCR、套式PCR、定量PCR、real-timePCR、锚定PCR、多重PCR和mR2NA差异显示等。
William等(1999)应用巢式PCR与RT-PCR相结合的技术,检测大西洋鲑鱼体内的病原菌Renibacteriumsalmoninarum,解决了组织或细胞培养物中病毒含量低而不易检测的问题,且增强了PCR扩增的特异性,避免非特异性条带的干扰,降低了假阳性[16]。
Lovdal(2002)应用巢式RT-PCR检测环境样品中低水平的鲑鱼贫血症病毒,结果在鲑鱼生存的海水和运输器皿中均检测到病毒的存在[17]。
Cerro(2002)基于16SrRNA基因序列,应用多重PCR法同时检测3种主要的鱼类病原体,气单胞菌、黄杆菌和耶尔森氏菌。
结果显示该方法对于常规的实验室检测以上3种病菌是一种灵敏、精确、快速且重复性好的方法[18]。
Mata等(2004)应用多重PCR法同时检测鱼类致病菌链状球菌的4种菌,结果表明其对于常规检测鱼类感染链状球菌是一种非常实用的方法[19]。
徐丽美等(2001)应用定量PCR检测方法,对携带少量白斑杆状病毒,被认为存在着病毒潜伏感染可能性的对虾进行检测,研究了WSBV感染程度与疾病爆发之间的关系,初步确定了病毒从潜伏期进入快速复制增殖期的危险临界值[20]。
Munir(2004)应用real-timeRT-PCR检测鲑鱼贫血症病毒,试验结果表明,对于同一样品,此种检测方法较常规RT-PCR方法在灵敏性上高出近
100倍,证明real-timeRT-PCR是一种灵敏、迅速、高重复性的方法,且可以用于定量检测生物样品中的ISAV病毒[21]。
此外,对于复杂环境样品中细菌的定量检测,real-[22]
timePCR也被证明是一种很有效的方法。
Abdenour等(1999)应用mRNA差异显示技术对正常和感染了VHSV病毒的虹鳟鱼,进行了基因表达差异分析,结果找到由病毒诱导产生的新基因(vig-1),为该病毒的防治提供了进一步的资料[23]。
Boudinot等(2001)在对感染VHSV病毒的虹鳟鱼的研究中,应用mRNA差异显示技术,分离得到一种由VHSV诱导产生的新的反转录产物(Vig-2),实验证实该
[24]
Vig-2基因为一种干扰素基因。
1.2.3 ,,核,以及光谱技术的高灵敏性和可计。
分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。
这种荧光探针是一种由茎环结构所组成单链DNA分子,茎杆区的序列互补,探针的5’-端及3’-端分别联用荧光素分子及猝灭剂(quencher)分子。
分子信标可以与PCR反应体系联系在一起,如果在反应体系中存在与荧光探针完全互补的靶基因,探针的茎环结构打开,环状结构与靶基因单链形成杂交体,荧光基团与相应的淬灭剂分开,淬灭作用消失,通过荧光PCR检测仪可以检测到荧光。
与当前常用的病原微生物检测方法比,PCR分子信标法具有特异性强,灵敏度高,污染少等特点[25]。
章晓波等(2000)将分子信标探针技术应用于对虾白斑杆状病毒PCR检测,在引物特异性扩增的同时进行探针的特异性杂交检测,极大的简化了检测手段,提高了方法的特异性[26]。
Starkey等(2004)应用real-timePCR与分子信标结合,检测主要的海鱼致病菌。
在临床检测中,该方法能准确的检测出样品中的阳性个体,而RT-PCR只检测到80%阳性[27]。
1.2.4 PCR与免疫技术相结合
目前比较常用的PCR与免疫结合的技术主要有免疫PCR和PCR-ELISA技术两种。
免疫PCR是一种抗原检测系统,将对蛋白的检测转化为核酸的检测,因此极大的提高了传统免疫测定的灵敏性[28]。
Kakizaki等报道了在感染的鲥鱼中运用免疫PCR检测病原巴斯德氏菌,结果表明利用它可检测出34cfu/ml的病原菌,而对照使用的ELISA方法只能检测出3.4×
100cfu/ml的菌[29]。
与免疫PCR相反,PCR-ELISA是用免疫学方法检测PCR产物。
其原理是PCR扩增时应用生物素标记引物,使PCR产物可以结合到亲和素包被的塑料板上,再用地高辛
标记的探针与PCR产物杂交,然后利用酶标抗地高辛抗体进行ELISA检测。
Gonzalez等(1999)应用一种基于1amB基因的PCR-ELISA方法快速分析牡蛎中的大肠杆菌,该方法检测范围可达10~105cfu/g,实验结果说明PCR-ELISA法是一种快速、精确、可定量的检测感染抗原的方法[30]。
1.3 核酸杂交技术
核酸杂交技术即一个核酸单链与另一被测核酸单链形成双链,已测定某一特定序列是否存在的技术。
探针标记与核酸分子杂交相结合产生了多种检测目的核酸的实用方法,是目前分子生物学不可缺少的重要手段。
目前较常用的核酸杂交主要有原位杂交、斑点杂交、Southern印迹杂交、
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水 产 科 学
第25
卷
Northern印迹杂交等。
核酸杂交技术在水产病害研究中已
得到了广泛的应用,特异性的核酸探针杂交是鉴定病原体
有效的方法。
Gou等(1991)为了检测鲑鱼疱疹病毒(OMV),利用两种OMVDNA的BamHⅠ消化的片段作为探针,进行South2ern杂交,可从鱼类体内和养殖环境中检测到OMV病毒的存在[31]。
Durand等(1998)应用原位杂交技术,采用不同的分子探针,对采自不同地区的BP-type病毒感染虾进行了检测,结果证明同一虾个体内至少被两种不同的BP-type病毒所感染[32]。
Nippon等(1998)用旋转酶B基因作为分子诊断的探针,在人工接种V.paralaemolyticus病毒的27个虾样本中检测到该病毒,为检测对虾体内该病毒提供了一个快速、可靠、灵敏的方法[33]。
Cerda-cuellar等(2000)利用一种特异的16SrRNA基因探针(V3VV),应用dot结合PCR扩增技术来研究V.vulnificus,它菌株呈现明显阳性,[(2001)采用DNA斑点杂交法,、行了对虾白斑病综合症病毒的检测,为了解该病毒的分布积累资料,并为养殖对虾白斑综合病的预防及制定防病措施提供参考[35]。
1.4 16SrRNA技术
以16SrRNA基因为基础,结合cDNA扩增技术,近年来发展出一种新的分子生物学手段,即通过对16SrRNA基因的DNA序列分析,可以分析细菌的种类信息,并且已经逐渐成为微生物分类和鉴定中非常重要且有用的指标和手段。
关于16SrRNA检测技术在水产动物病害防治方面的应用目前也已有报道。
Ragnhild等(1995)通过对分离于大西洋鲑鱼、虹鳟鱼、大菱鲆和鳕鱼中的致病弧菌的16SrRNA序列进行比对,对鱼类致病弧菌进行分类[36]。
Carlos等(1999)通过对26株不同来源的鱼Photobacteriumdamselae病菌的16SrRNA基因序列的分析,并与巢式PCR相结合,可以从10fg~1pg感染鱼组织DNA中监测到病毒,也可从无症状但怀疑带菌的个体中检测到病原[37]。
应用已知的16SrRNA序列也可以设计特异性的分子探针,结合核酸杂交和PCR扩增技术对病毒进行分离和检测。
ANN-SOFI等(1989)通过比较7株不同的Vibrioanguillarum菌株的16SrRNA序列,设计一段250bp的寡核苷酸作为一种特异性探针,应用狭缝斑点杂交对鱼类致病菌V.anguillarum进行鉴定[38]。
Cerda-cuellar等(2001)利用一种特异的16SrRNA基因探针(V3VV),应用dotblot结合PCR扩增技术对V.
[36]
vulnificus病毒进行检测。
1.5 基因芯片技术
基因芯片是20世纪90年代初随着人类基因组计划的发展而兴起的技术。
目前该技术已应用于基因表达分析,DNA测序,多态性分析和基因诊断等各个方面。
利用基因芯片技术,不仅可以在DNA水平上寻找和检测与疾病相关的内源基因及外源基因,而且可以在RNA水平上检测致病基因的异常表达,从而对某些疾病作出检侧,对疾病抗药性作出判断,具有高亲合性、高精确性、高灵敏性、操作简便、结果客观性强等优点,是许多疾病诊断与治疗的一个发展方向[39]。
Stephen等(2003)应用人类cDNA微阵列对健康和感染Aeromonassalmonicida病菌的大西洋鲑鱼肝脏内基因表达的差异进行比较。
结果发现4个位点的基因表达在染病个体内有明显增加。
证明了应用人类cDNA微阵列检测鲑鱼体内差异表达基因的可行性[40]。
Santiago等(2004)结合多
重PCR技术和DNA微阵列技术对海鱼的5种重要的病原体进行检测,结果证实其对于检测引起人和鱼类多种疾病的多重病原体是一种敏感性强、精确度高的实验手段[41]。
1.6 DNA疫苗的制备
对于水产动物病害防治的研究,制备更高效的免疫疫苗也是解决问题的方法之一。
当前对于病毒性传染病的预防主要是依靠疫苗接种,随着分子生物学的发展,产生了许多具有良好应用前景的新型疫苗,核酸疫苗就是其中最为热门的研究方向之一。
其原理是将核酸目的基因(病毒中转录抗原蛋白)导入宿主细胞,在真核表达系统的调控下表达抗原蛋白,诱导机体产生免疫应答,达到免疫效果[42]。
已应用DNA疫苗的病毒(IH2)、鲤春病病毒(SVCV)和
[43]
()。
实验研究抗虹鳟鱼IHNV病疫苗结果表明,这种疫苗在使用初期会引起短暂的非特异性抗滤过性病原体阶段,之后则可起到长期特异性的保护作用[44]。
Traxler等(1999)将一种编码IHNV糖蛋白的裸质粒DNA注入大西洋鲑体内,对IHNV进行免疫。
研究结果表明,这种DNA疫苗能有效的对大西洋鲑的IHNV病毒进行免疫[45]。
Mikalsen等(2004)构建了5种编码感染性胰腺坏死病毒(IPNV)基因开放阅读框的质粒,之后对大西洋鲑种群进行免疫接种,检测结果显示该质粒诱导出一种高水平的免疫防护[46]。
DNA疫苗的优点是注入裸DNA在体内表达,免疫效价较高,但主要缺点是对病原蛋白的结构和组成需要详细的了解。
再者,即使优化的疫苗也趋向于一个较窄的效应范围,而且对大多数水产动物而言,免疫机理还不够清楚。
2 展望
分子生物学技术的飞速发展,使得新的方法技术层出不穷,而应用于水产病害的分子手段还是相对有限和落后的,随着病害研究的不断深入,有必要引入一些更先进的分子生物学技术,从而使病害研究的手段更加完善,使研究结果更加精确。
2.1 cDNA-AFLP技术
AFLP分析的模板可以是基因组DNA,也可以是cDNA,后者因为与基因的表达密切相关,可用于研究基因的表达与调控。
通过cDNA-AFLP分析,研究基因不同时空的表达,降低了经典mRNA差异显示技术的假阳性率,同时对低水平表达基因更敏感,并使操作更安全。
cDNA-AFLP所反映的是功能基因之间在表达上的差异,这对于寻找个体间的优良性状基因、提高水产品的质量、防治水产动物疾病,都具有重要的意义。
目前国内外关于cDNA-AFLP的研究主要是应用于植物和微生物方面。
Qin等(2000)应用cDNA-AFLP技术对推定的土豆包囊线虫Globoderarostochiensis致病性进行了鉴定,得到了3种与致病相关的基因,其与任何已知的基因都不具有同源性[47]。
Mao等(2003)为了研究水稻中铝中毒和铝耐受的调控机制,应用cDNA-AFLP技术对两种铝耐受的热带水稻根部铝调节基因进行检测,在得到的34个铝调节基因中有19个为已知功能的功能基因片段[48]。
而在水产动物病害研究中cDNA-AFLP的应用还未见报道。
2.2 反义技术
反义技术主要是设计一类能有效抑制某一目的基因表达的反义RNA、反义DNA及核酶,将其导入细胞中,与目的
gan,2002,50
(2):
1192126.
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基因的mRNA互补结合,通过各种机制使其降解或抑制其
编码蛋白的翻译,从而抑制其表达。
无论是对动、植物细胞还是病毒,反义技术都具有关闭基因或阻止病毒感染的功能。
Elbashir等(2001)发现将人工合成的21个核苷酸长的双链siRNA导人哺乳动物细胞,可以避开干扰素途径而特异性地抑制目的基因的表达[49]。
Li等(2004)在研究肝炎病毒(HCV)基因机制及反义RNA对该病毒基因体内表达的抑制作用中发现,HCV5’不译区对该病毒的表达起到重要的作用,而当其与反义RNA结合后
[50]
HCV的基因表达受到了有效的抑制。
目前我们尚未见到有关成功应用反义技术来防治水产病害的报道,但其作为一种新型的生物治疗技术,为疾病的防治提供了新的思路。
除以上介绍的几种技术之外,用的分子生物学机制的研究中,,示技术,广阔的应用前景。
病毒病的防治在国外受到了相当的重视。
与其相比,我国在这方面的研究还比较薄弱。
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3 结语
分子生物学技术在水产养殖和疾病防治上的应用,为
水产业的发展带来了革命性的变化。
快速准确的病原体检测手段,高效免疫疫苗的制备都在很大程度上缓解了病害所带来的严重损失。
然而目前的分子实验主要是应用于基础性的研究,分子生物学技术要真正的应用于生产,还有待于优化检测条件,简化仪器设备以及降低昂贵的实验成本。
近几年来,我国在水产动物病害防治上取
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