凝胶层析文档格式.docx
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基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。
而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。
洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。
我们设柱床体积为Vt,外水
体积为Vo,内水体积为Vi,基质体积为Vg,则有:
Vt=Vo+Vi+Vg
由于Vg相对很小,可以忽略不计,则有:
Vt=Vo+Vi
设洗脱体积为Ve,Ve一般是介于Vo和Vt之间的。
对于完全排阻的大分子,由于其不进
入凝胶颗粒内部,而只存在于流动相中,故其洗脱体积Ve=Vo;
对于完全渗透的小分子,
由于它可以存在于凝胶柱整个体积内(忽略凝胶本身体积Vg),故其洗脱体积Ve=Vt。
分
子量介于二者之间的分子,它们的洗脱体积也介于二者之间。
有时可能会出现Ve>
Vt,
这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。
凝胶层析中的几种洗脱峰如图3-7所示:
柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处,然后测量水的体积来测定。
外
水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定,一般常用蓝色葡聚糖
-2000作为测定外水体积的物质。
因为它的分子量大(为200万),在各种型号的凝胶中
都被排阻,并且它呈蓝色,易于观察和检测。
2.分配系数
分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。
对于凝胶层析,分配系数实质上表示
某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。
在凝胶层析中,分配系数通常表示为:
Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)
前面介绍了Vt和Vo都是可以测定的,所以测定了某个组分的Ve就可以得到这个组分的分
配系数。
对于一定的层析条件,Vt和Vo都是恒定的,大分子先被洗脱出来,Ve值小,Kav
值也小。
而小分子后被洗脱出来,Ve值大,Kav值也大。
对于完全排阻的大分子,Ve=Vo,
故Kav=0。
而对于完全渗透的大分子,Ve=Vt,故Kav=1。
一般Kav值在0-1之间,
如Kav值大于1,则表示这种物质与凝胶有吸附作用。
对于某一型号的凝胶,在一定的分子量范围内,各个组分的Kav与其分子量的对数成线性
关系:
Kav=-blgMW+c
其中b、c为常数,MW表示物质的分子量。
另外由于Ve和Kav也成线性关系,所以同样
有:
Ve=-b'
lgMW+c'
其中b'
、c'
为常数。
这样我们通过将一些已知分子量的标准物质在同一凝胶柱上以相同条件
进行洗脱,分别测定Ve或Kav,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后在相同的条件
下测定未知物的Ve或Kav,通过标准曲线即可求出其分子量。
这就是凝胶层析测定分子量
的基本原理,这种方法在后面的应用中还将详细介绍。
3.排阻极限
排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。
所有大于排阻极限的分子都
不能进入凝胶颗粒内部,直接从凝胶颗粒外流出,所以它们同时被最先洗脱出来。
排阻极限
代表一种凝胶能有效分离的最大分子量,大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得
到分离。
例如SephadexG-50的排阻极限为30,000,它表示分子量大于30,000的分
子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。
4.分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围,对于分子量在这个范围内的分子,用这种凝胶
可以得到较好的线性分离。
例如SephadexG-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000-
70,000,它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过SephadexG-75得到较好的分
离。
应注意,对于同一型号的凝胶,球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。
5.吸水率和床体积
吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量,但它不包括颗粒间吸附的水份。
所以它不
能表示凝胶装柱后的体积。
而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。
6.凝胶颗粒大小
层析用的凝胶一般都成球形,颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(mm)来表
示。
柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。
颗粒大,流速快,但分离效果差;
颗粒小,
分离效果较好,但流速慢。
一般比较常用的是100-200目。
凝胶的种类和性质
凝胶的种类很多,常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶(dextran)、聚丙烯酰胺凝胶
(polyacrylamide)、琼脂糖凝胶(agarose)以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。
另
外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。
下面将分别介绍。
1.葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是指由天然高分子-葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。
葡聚糖凝胶主要由
PharmaciaBiotech生产。
常见的有两大类,商品名分别为Sephadex和Sephacryl。
葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列,它是葡聚糖与3-氯-1,2环氧丙烷(交联剂)
相互交联而成,交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。
Sephadex的主要型号是G-10~
G-200,后面的数字是凝胶的吸水率(单位是ml/g干胶)乘以10。
如SephadexG-50,
表示吸水率是5ml/g干胶。
Sephadex的亲水性很好,在水中极易膨胀,不同型号的
Sephadex的吸水率不同,它们的孔穴大小和分离范围也不同。
数字越大的,排阻极限越
大,分离范围也越大。
Sephadex中排阻极限最大的G-200为6′105。
Sephadex在水
溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的,可以多次重复使用。
Sephadex稳定工作的pH一般为为2-10。
强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断
裂,所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。
Sephadex在高温下稳定,可以煮沸消
毒,在100°
C下40min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。
Sephadex由于含有
羟基基团,故呈弱酸性,这使得它有可能与分离物中的一些带电基团(尤其是碱性蛋白)发
生吸附作用。
但一般在离子强度大于0.05的条件下,几乎没有吸附作用。
所以在用
Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液,这样就可以避免
Sephadex与蛋白发生吸附,但应注意如果盐浓度过高,会引起凝胶柱床体积发生较大的
变化。
Sephadex有各种颗粒大小(一般有粗、中、细、超细)可以选择,一般粗颗粒流
速快,但分辨率较差;
细颗粒流速慢,但分辨率高。
要根据分离要求来选择颗粒大小。
Sephadex的机械稳定性相对较差,它不耐压,分辨率高的细颗粒要求流速较慢,所以不
能实现快速而高效的分离。
另外,SephadexG-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应,形成LH型烷基化葡聚糖凝
胶,主要型号为SephadexLH-20和LH-60,适用于以有机溶剂为流动相,分离脂溶性
物质,例如胆固醇、脂肪酸激素等。
Sephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺(N,N'
-methylenebisacrylamide)交联而成。
是一种比较新型的葡聚糖凝胶。
Sephacryl的优点就是它的分离范围很大,排阻极限甚至
可以达到108,远远大于Sephadex的范围。
所以它不仅可以用于分离一般蛋白,也可以
用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。
Sephacryl与Sephadex相比另一个
优点就是它的化学和机械稳定性更高:
Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解,可
以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液,耐高温,Sephacryl稳定工作的pH一般为
3~11。
另外Sephacryl的机械性能较好,可以以较高的流速洗脱,比较耐压,分辨率也
较高,所以Sephacryl相比Sephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。
2.聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺(acrylamide)与甲叉双丙烯酰胺交联而成。
改变丙烯酰胺的
浓度,就可以得到不同交联度的产物。
聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-RadLaboratories生产,
商品名为Bio-GelP,主要型号有Bio-GelP-2~Bio-GelP-300等10种,后面的数字
基本代表它们的排阻极限的10-3,所以数字越大,可分离的分子量也就越大。
各种型号的
主要参数如附表所示。
聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。
排阻极限最大的Bio-GelP-300为4′105。
聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、
盐溶液中都比较稳定。
聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好,在pH为1~10之间比较稳
定。
但在较强的碱性条件下或较高的温度下,聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。
聚丙烯酰胺凝胶
非常亲水,基本不带电荷,所以吸附效应较小。
另外,聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和
琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。
聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸
附作用,使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。
3.琼脂糖凝胶
琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖,它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。
琼
脂糖是由D-半乳糖(D-galactose)和3,6-脱水半乳糖(anhydrogalactose)交替构
成的多糖链。
它在100°
C时呈液态,当温度降至45°
C以下时,多糖链以氢键方式相互
连接形成双链单环的琼脂糖,经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶的商品名因生产
厂家不同而异,常见的主要有PharmaciaBiotech生产的Sepharose(2B~4B)和
Bio-RadLaboratories生产的Bio-gelA等。
关于各种琼脂糖凝胶的基本参数如附表所示。
琼脂糖凝胶在pH为4-9之间是稳定的,它在室温下很稳定,稳定性要超过一般的葡聚糖
凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。
另外琼脂糖凝胶的机械强度和
孔穴的稳定性都很好,一般好于前两种凝胶,在高盐浓度下,柱床体积一般不会发生明显变
化,使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快。
琼脂糖凝胶的排阻极限很大,分离范围很广,
适合于分离大分子物质,但分辨率较低。
琼脂糖凝胶不耐高温,使用温度以0-30°
C为宜。
Sepharose与2,3二溴丙醇反应,形成SepharoseCL型凝胶(CL-2B~CL-4B),它们
的分离特性基本没有改变,但热稳定性和化学稳定性都有所提高,可以在更广泛的pH范围
内应用,稳定工作的pH范围为3-13。
SepharoseCL型凝胶还特别适合于含有有机溶
剂的分离。
4.聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶
这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。
它们主要由LKB提供,商
品名为Ultragel。
这种凝胶由于含有聚丙烯酰胺,所以有较高分辨率;
而它又含有琼脂糖,
这使得它又有较高的机械稳定性,可以使用较高的洗脱速度。
调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓
度可以使Ultragel有不同的分离范围,
5.多孔硅胶、多孔玻璃珠
多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于无机凝胶。
顾名思义,它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直
径的网孔状结构的球形颗粒。
这类凝胶属于硬质无机凝胶,它们的最大的特点是机械强度很
高、化学稳定性好,使用方便而且寿命长,无机胶一般柱效较低,但用微粒的多孔硅胶制成
的HPLC柱也可以有很高的柱效,可以达到4′104塔板/米。
多孔玻璃珠易破碎,不能填
装紧密,所以柱效相对较低。
多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽,多孔硅胶一般为
102-5′106,多孔玻璃珠一般为3′103-9′106。
它们的最大缺点是吸附效应较强(尤其
是多孔硅胶),可能会吸附比较多的蛋白,但可以通过表面处理和选择洗脱液来降低吸附。
另外它们也不能用于强碱性溶液,一般使用时pH应小于8.5。
另外值得一提的是各类凝胶技术近年来发展得很快,目前已研制出很多性能优越的新型凝
胶。
例如PharmaciaBiotech的Superdex和Superrose,Superdex的分辨率非常高,
化学物理稳定性也很好,可以用于FPLC、HPLC分析;
而Superose的分离范围很广,分
辨率较高,可以一次性的分离分子量差异较大的混合物。
同时它的机械稳定性也很好。
关于
各种凝胶产品的详细情况可以参阅本书附录以及各个公司的产品目录。
凝胶的选择、处理和保存
1.凝胶的选择
通过前面的介绍可以看到凝胶的种类、型号很多。
不同类型的凝胶在性质以及分离范围上都
有较大的差别,所以在进行凝胶层析实验时要根据样品的性质以及分离的要求选择合适的凝
胶,这是影响凝胶层析效果好坏的一个关键因素。
一般来讲,选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个合适的分离范围,根据分离范围来选择
合适型号的凝胶。
一般的凝胶层析实验可以分为两类:
分组分离(groupseparations)和
分级分离(fractionations),分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两组,一组分
子量较大,另一组分子量较小。
例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及
一些注射剂去除大分子热源物质等等。
分级分离则是指将一组分子量比较接近的组分分开。
在分组分离时要选择能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶,这样分离效果好。
一般
常用排阻极限较小的凝胶类型。
分级分离时则要根据样品组分的具体情况来选择凝胶的类
型,凝胶的分离范围一方面应包括所要的各个组分的分子量,另一方面要合适,不能过大。
如果分离范围选择过小,则某些组分不能得到分离;
如分离范围选择过大,则分辨率较低,
分离效果也不好。
选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小。
颗粒小,分辨率高,但相对流速慢,实验时间
长,有时会造成扩散现象严重;
颗粒大,流速快,分辨率较低但条件得当也可以得到满意的
结果。
选择时要依据分离的具体情况而定,例如样品中各个组分差别较大,则可以选用大颗
粒的凝胶,这样可以很快的达到分离的目的;
如果有个别组分差别较小,则要考虑使用小颗
粒凝胶以提高分辨率。
由于凝胶一般都比较稳定,所以它在一般的实验条件下都可以正常的
工作。
如果实验条件比较特殊,如在较强的酸碱中进行或含有有机溶剂等等,则要仔细查看
凝胶的工作参数,选择合适的类型的凝胶。
2.凝胶的处理
凝胶使用前要首先要进行处理。
选择好凝胶的类型后,首先要根据选择的层析柱估算出凝胶
的用量。
由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶,所以要计算干胶用量:
干胶用量(g)=柱床体积(ml)/凝胶的床体积(ml/g)。
由于凝胶处理过程以及实验
过程可能有一定损失,所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加10%-20%。
葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶干胶的处理首先是在水中膨化,不同类型的凝胶所需的膨化时间
不同。
一般吸水率较小的凝胶(即型号较小、排阻极限较小的凝胶)膨化时间较短,在20°
C
条件下需3-4小时;
但吸水率较大的凝胶(即型号较大、排阻极限较大的凝胶)膨化时间
则较长,20°
C条件下需十几个到几十个小时,如SephadexG-100以上的干胶膨化时间
都要在72小时以上。
如果加热煮沸,则膨化时间会大大缩短,一般在1-5小时即可完成,
而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。
但应注意尽量避免在酸或碱中加热,以免凝胶被破
坏。
琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态,所以不需膨化处理。
另外多孔玻璃珠和多
孔硅胶也不需膨化处理。
膨化处理后,要对凝胶进行纯化和排除气泡。
纯化可以反复漂洗,倾泻去除表面的杂质和不
均一的细小凝胶颗粒。
也可以一定的酸或碱浸泡一段时间,再用水洗至中性。
排除凝胶中的
气泡是很重要的,否则会影响分离效果,可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡。
3.凝胶的保存
凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质,然后加入适当的抗菌剂,通常加入0.02%的
叠氮化钠,4°
C下保存。
如果要较长时间的保存,则要将凝胶洗涤后脱水、干燥,可以将
凝胶过滤抽干后浸泡在50%的乙醇中脱水,抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水,至
95%乙醇脱水后将凝胶抽干。
置于60°
C烘箱中烘干,即可装瓶保存。
注意膨化的凝胶不
能直接高温烘干,否则可能会破坏凝胶的结构。
凝胶层析的基本操作
凝胶层析的基本操作步骤与前面介绍的柱层析的操作过程基本相似,这里就不再重复了。
下
面主要介绍凝胶层析操作中应注意的一些具体问题。
1.层析柱的选择
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。
一般来讲,主要是层
析柱的长度对分辨率影响较大,长的层析柱分辨率要比短的高;
但层析柱长度不能过长,否
则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。
一般柱长度不超过100cm,为得到
高分辨率,可以将柱子串联使用。
层析柱的直径和长度比一般在1:
25-1:
100之间。
用于
分组分离的凝胶柱,如脱盐柱由于对分辨率要求较低,所以一般比较短。
2.凝胶柱的鉴定
凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果,关于填装的方法前面已有介绍,这里主要介绍对填
装好的凝胶柱的鉴定。
凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
另外通常可以采
用一种有色的物质,如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱,观察有色区带在柱中的洗脱行
为以检测凝胶柱的均匀程度。
如果色带狭窄、平整、均匀下降,则表明柱中的凝胶填装情况
较好,可以使用;
如果色带弥散、歪曲,则需重新装柱。
另外值得一提的是,有时为了防止
新凝胶柱对样品的吸附,可以用一些物质预先过柱,以消除吸附。
3.洗脱液的选择
由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用,它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选
择性的改变来进行分离,在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用,一般不依赖于流动相
性质和组成的改变来提高分辨率,改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等
相互作用,所以和其它层析方法相比,凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。
由于凝胶层析的
分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广,所以洗脱液的选择主要取决于待分离样
品,一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。
为了防止
凝胶可能有吸附作用,一般洗脱液都含有一定浓度的盐。
4.加样量
关于加样前面已经有所介绍,要尽量快速、均匀。
另外加样量对实验结果也可能造成较大的
影响,加样过多,会造成洗脱峰的重叠,影响分离效果;
加样过少,提纯后各组分量少、浓
度较低,实验效率低。
加样量的多少要根据具体的实验要求而定:
凝胶柱较大,当然加样量
就可以较大;
样品中各组分分子量差异较大,加样量也可以较大;
一般分级分离时加样体积
约为凝胶柱床体积的1%-5%左右,而分组分离时加样体积可以较大,一般约为凝胶柱床
体积的10%-25%。
如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析,根据洗脱峰的
情况来选择合适的加样量。
设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2,那么加样
量不能超过(Ve1-Ve2)。
实际由于样品扩散,所以加样量应小于这个值。
从洗脱峰上看,
如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开,为了提高效率,可以适当增加加样量;
如果各个组
分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开,则不能再加大加样量,甚至要减小加样量。
另外
加样前要注意,样品中的不溶物必须在上样前去掉,以免污染凝胶柱。
样品的粘度不能过大,
否则会影响分离效果。
5.洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果,一般洗脱速度要恒定而且合适。
保持洗脱速度恒定
通常有两种方法,一种是使用恒流泵,另一种是恒压重力洗脱。
洗脱速度取决于很多因素,
包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等,一般来讲,洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平
衡,分离效果好。
但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽,反
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- 凝胶 层析