生物化学酵母提取Word下载.docx
- 文档编号:6447557
- 上传时间:2023-05-06
- 格式:DOCX
- 页数:10
- 大小:19.25KB
生物化学酵母提取Word下载.docx
《生物化学酵母提取Word下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《生物化学酵母提取Word下载.docx(10页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
八、定性鉴定
九、定量测定
10、物质的利用
核酸的分布
nDNA:
细胞核(95%)
细胞器(5%)
RNA:
细胞质(75%)
细胞核(10%)
细胞器(15%)
nRNA以rRNA的数量最多(80%-85%)
核酸提取的主要步骤
n破碎细胞
n去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子n去除其它不需要的核酸分子
n沉淀核酸,去除盐类,有机溶剂等杂质
核酸分离纯化原则
n保证核酸一级结构的完整性
n排除其它分子的污染
n简化操作,缩短时间,以减少各种有害因素对核酸的破坏n减少化学因素对核酸的降解(pH4-10)
n减少物理因素对核酸的降解(机械剪切力、高温)
n防止核酸的生物降解(DNA酶、RNA酶)
实验原理
n由于RNA的来源和种类很多,因而提取制备方法也各异,一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验室最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在苯酚层中,向水层加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出。
此法能较好地除去DNA和蛋白质,提取的RNA具有生物活性。
n酵母细胞富含核酸,且核酸主要是RNA,含量为干菌体的
2.67%-
10.0%,而DNA含量较少,仅为
0.03%-
0.516%。
为此提取RNA多以酵母为原料。
工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。
这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA,主要用作制备单核苷酸的原料,其工艺比较简单。
n稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解,然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH
2.5利用等电点沉淀。
提取的RNA有不同程度的降解。
n浓盐法是用高浓度盐溶液处理,同时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来。
RNA提取方法与分类
n稀碱法(
0.2%NaOH)
n浓盐法(10%NaCl)
n苯酚法
n氯仿-异戊醇法
n去污剂法
n盐酸胍法
三、试剂和器材
1、试剂
(1)干酵母粉
(2)RNA标准溶液(100微克/毫升)
(8)5%硝酸银溶液
(9)钼酸铵试剂2克钼酸铵溶解在100毫升10%硫酸中。
(10)地衣酚试剂:
100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁,摇匀,贮存备用,使用前加入100毫克地衣酚。
n(11)NaCln(12)95%乙醇n(13)6mol/lHCln(14)高氯酸n(15)氯化锂n(16)硼酸缓冲液(pH-
3.5)n(17)磷酸缓冲液(pH-
7.5)
2、器材
(1)电子天平
(2)电热套
(3)三角烧瓶
(4)烧杯
(5)高速冷冻离心机
(6)滴管
(7)抽滤瓶
(8)离心管
(9)恒温水浴箱
(10)吸量管
(11)紫外分光光度计
(12)表面皿
(13)量筒
(14)容量瓶
(15)擦镜纸
(16)比色皿
(17)玻棒
(18)定量滤纸
(19)试管
(20)布氏漏斗
(21)真空泵
(22)电泳仪n(23)紫外检测仪
(24)可见光分光光度计n(25)托盘天平
(26)电泳槽
(27)
0.5-
5.0精密pH试纸四、实验方法
RNA的提取的操作
3、RNA提取方法(浓盐法)
①取13g活性干酵母,置250ml烧杯中,加入120ml蒸馏水,混匀;
②倒入8gNaCl,电热套加热45分钟(玻棒要不断触底搅拌);
③稍微冷,3500rpm离心8min,将上清倒入50ml烧杯中。
④将烧杯冰浴10min
⑤用HCl小心调节pH,至
2.0~
2.5;
⑥将烧杯冰浴10min;
⑦将烧杯中物质(含沉淀)移入10ml离心管中,3500rpm离心8min,弃上清,
⑧将沉淀转移到
1.5ml小离心管中,95%乙醇
1.5ml洗涤,5000rpm离心4min,倒弃清液。
⑨保存好粗RNA产品。
思考题
RNA含量测定之一:
地衣酚法
RNA的地衣酚法定量测定原理
地衣酚法测定。
反应原理:
当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol)反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色复合物。
反应产物在670nm处有最大吸收。
RNA浓度在20-250μg/ml范围内,光密度与RNA浓度成正比。
n
(1)标准曲线的制作
取6支试管,7按下表编号及加入试剂,加毕混匀,置沸水浴中加热45min,取出冷却,于670nm波长处测定光密度值。
(3)RNA含量的计算
n根据测得的O.D值,从标准曲线上查出相对应的RNA含量,按下式计算出制品中RNA的百分含量:
nRNA%=
RNA鉴定之一:
组成基团的鉴定
n实验步骤:
n取适量
0.05g提取的RNA,加10%硫酸液3ml,放在沸水浴中加热5分钟,制成RNA水解,做以下鉴定n
(1)嘌呤碱基的检查
取水解液
0.5ml,加氨水
0.5ml及5%硝酸银溶液
0.3ml,观察是否产生絮状嘌呤银化合物(有时絮状物出现较慢,可放置十几分钟)。
(2)磷酸的检查
0.5ml,加2滴浓硝酸酸化,再加入
0.5ml钼酸铵试剂,放在沸水浴中加热10分钟,冷却静置后观察是否有黄色磷钼酸铵沉淀产生。
(3)核糖的检查
0.5ml,加地衣酚试剂
0.5ml,放在沸水浴中加热5分钟,观察溶液颜色变化。
操作方法
用分析天平准确称取待测的样品RN
A0.150g,加入少量的蒸馏水调成糊状,再加入少量的水稀释。
用5%---6%的氨水调至pH值为
7.0,定容到10ml(RNA的鉴定三和四皆用该溶液,不过要稀释200倍)。
取两支离心管,向第一支管中加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水。
第二支管中加入2ml样品溶液和2ml沉淀剂。
混匀。
在冰浴中放置30分钟,然后离心10分钟,3000转/分钟。
从各管中取出
0.25ml上清液,用蒸馏水定容到25ml。
于260nm处测定其光吸收值(O
D1、OD2)
将样品放于紫外分光光度计上测定260nm,
计算核酸浓度。
OD1—OD2
RNA%=
0.022×
100
样品浓度
式中:
OD
260为260nm波长处光密度读数;
L为比色杯的厚度;
0.022为每毫升溶液内含
1微克RNA的光密度。
RNA的鉴定三:
提取的RNA吸收光谱测定
核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰,最大吸收值在260nm附近。
不同的核酸有不同的吸收特征。
所以可以用紫外分光光度计加以定性和定量。
操作:
取RNA的定量分析之二所配溶液
0.5ml,稀释200倍,取3ml测定不同波长(
230、240、
250260、270、
280、290、
300、310nm)下的OD值,以不同波长为横坐标,OD值为纵坐标绘制RNA吸收光谱曲线。
RNA的鉴定四:
提取的RNA纯度的判断
纯DNA的OD260/OD280应大于
1.8,而纯RNA的OD260/OD280应达到
2.0。
如果样品中含又杂蛋白、苯酚,则OD260/OD280的比值会明显降低。
所以我们通过测定OD260/OD280的比值来检测RNA的纯度。
0.5ml,稀释200倍,取3ml于比色皿中分别在260nm、280nm处测定其光吸收值(O
D1、OD2)根据测得的OD值判断提取的RNA的纯度。
RNA的鉴定之二:
醋酸纤维素薄膜电泳分离鉴定
1、RNA的碱水解:
称取
0.15xxRNA,溶于4mL
0.3mol/L氢氧化钾溶液中,使RNA的浓度达到20-30mg/ml。
沸水浴30min或者在37℃水解18个小时。
将水解液转移到椎形瓶中。
冰浴中用高氯酸溶液将水解液滴定到pH
3.5。
2000r/min离心10min,上清液即是样品液。
2、准备与点样
(1)将薄膜切成
2.0cm×
8cm的小片。
在薄膜无光泽面(正面)的一端约
3.0cm处用硬铅笔划一点样线。
(2)将薄膜xx面向下,置pH
3.5,
0.02mol/L的柠檬酸缓冲液中浸湿。
3.电泳
将点样后的膜条置于电泳槽架上,放置时,无光泽面(即点样面)向下,点样端置于负极,槽架上以双层滤纸作桥垫,滤纸的一端与支架的前沿对齐,另一端浸入电极槽的缓冲液中。
用缓冲液将滤纸全部浸润并驱除气泡。
膜条与滤纸需贴紧,待平衡5min后通电,电压为160~500V,电流为
0.4mA/cm,通电25-35分钟左右关闭电源。
4.记录结果
通电完毕后用镊子将薄膜取出,于紫外灯下观察,用铅笔将吸收紫外光的暗斑圈出。
(3)点样时,应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免引起样品扩散。
但不宜太干,否则样品不易进入膜内,造成点样起始点参差不起,影响分离效果。
(4)点样时,动作要轻、稳,用力不能太大,以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
(5)电泳时应选择合适的电流强度,一般电流强度为
0.4mA/cm。
电流强度高,则热效应高;
电流过低,则样品泳动速度慢且易扩散。
(6)操作过程为防止指纹污染,应戴手套。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 生物化学 酵母 提取