1、八、定性鉴定九、定量测定10、物质的利用核酸的分布nDNA：细胞核（95%）细胞器（5%）RNA：细胞质（75%）细胞核（10%）细胞器（15%）nRNA以rRNA的数量最多（80-85%）核酸提取的主要步骤n破碎细胞n去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子n去除其它不需要的核酸分子n沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质核酸分离纯化原则n保证核酸一级结构的完整性n排除其它分子的污染n简化操作，缩短时间，以减少各种有害因素对核酸的破坏n减少化学因素对核酸的降解（pH4-10）n减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、高温）n防止核酸的生物降解（DNA酶、RNA酶）实验原理n由于RNA的来源
2、和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。n酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。
3、n稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。n浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。RNA提取方法与分类n稀碱法（0.2%NaOH）n浓盐法（10%NaCl）n苯酚法n氯仿-异戊醇法n去污剂法n盐酸胍法三、试剂和器材1、试剂（1）干酵母粉（2）RNA标准溶液（100微克/毫升）（8）5%硝酸银溶液（9）钼酸铵试剂2克钼酸铵溶解在100毫升10%硫酸中。（10）地衣酚试剂：100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁，摇匀，贮存备用，使用前加
4、入100毫克地衣酚。n（11）NaCln（12）95%乙醇n（13）6mol/lHCln（14）高氯酸n（15）氯化锂n（16）硼酸缓冲液（pH-3.5）n（17）磷酸缓冲液（pH-7.5）2、器材（1）电子天平（2）电热套（3）三角烧瓶（4）烧杯（5）高速冷冻离心机（6）滴管（7）抽滤瓶（8）离心管（9）恒温水浴箱（10）吸量管（11）紫外分光光度计（12）表面皿（13）量筒（14）容量瓶（15）擦镜纸（16）比色皿（17）玻棒（18）定量滤纸（19）试管（20）布氏漏斗（21）真空泵（22）电泳仪n（23）紫外检测仪（24）可见光分光光度计n（25）托盘天平（26）电泳槽（27）0.5-5
5、.0精密pH试纸四、实验方法RNA的提取的操作3、RNA提取方法（浓盐法）取13g活性干酵母,置250ml烧杯中，加入120ml蒸馏水，混匀；倒入8gNaCl，电热套加热45分钟（玻棒要不断触底搅拌）；稍微冷，3500rpm离心8min，将上清倒入50ml烧杯中。将烧杯冰浴10min用HCl小心调节pH，至2.02.5；将烧杯冰浴10min；将烧杯中物质（含沉淀）移入10ml离心管中，3500rpm离心8min，弃上清，将沉淀转移到1.5ml小离心管中，95%乙醇1.5ml洗涤,5000rpm离心4min,倒弃清液。保存好粗RNA产品。思考题RNA含量测定之一：地衣酚法RNA的地衣酚法定量测定
6、原理地衣酚法测定。反应原理：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚orcinol）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20-250g/ml范围内，光密度与RNA浓度成正比。n（1）标准曲线的制作取6支试管，7按下表编号及加入试剂，加毕混匀，置沸水浴中加热45min，取出冷却，于670nm波长处测定光密度值。（3）RNA含量的计算n根据测得的O.D值，从标准曲线上查出相对应的RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量：nRNA%=RNA鉴定之一：组成基团的鉴定n实验步骤:n取
7、适量0.05g提取的RNA，加10%硫酸液3ml，放在沸水浴中加热5分钟，制成RNA水解，做以下鉴定n（1）嘌呤碱基的检查取水解液0.5ml，加氨水0.5ml及5%硝酸银溶液0.3ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。（2）磷酸的检查0.5ml，加2滴浓硝酸酸化，再加入0.5ml钼酸铵试剂，放在沸水浴中加热10分钟，冷却静置后观察是否有黄色磷钼酸铵沉淀产生。（3）核糖的检查0.5ml，加地衣酚试剂0.5ml，放在沸水浴中加热5分钟，观察溶液颜色变化。操作方法用分析天平准确称取待测的样品RNA0.150g，加入少量的蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。用5%-
8、6%的氨水调至pH值为7.0，定容到10ml（RNA的鉴定三和四皆用该溶液,不过要稀释200倍）。取两支离心管，向第一支管中加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水。第二支管中加入2 ml样品溶液和2 ml沉淀剂。混匀。在冰浴中放置30分钟，然后离心10分钟，3000转/分钟。从各管中取出0.25 ml上清液，用蒸馏水定容到25 ml。于260nm处测定其光吸收值（OD1、OD2）将样品放于紫外分光光度计上测定260nm,计算核酸浓度。OD1OD2RNA%=0.022100样品浓度式中：OD260为260nm波长处光密度读数；L为比色杯的厚度；0.022为每毫升溶液内含1微克RNA的光密度。RNA的鉴
9、定三：提取的RNA吸收光谱测定核酸在240290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不同的核酸有不同的吸收特征。所以可以用紫外分光光度计加以定性和定量。操作:取RNA的定量分析之二所配溶液0.5ml,稀释200倍,取3ml测定不同波长（230、240、250260、270、280、290、300、310nm）下的OD值,以不同波长为横坐标,OD值为纵坐标绘制RNA吸收光谱曲线。RNA的鉴定四：提取的RNA纯度的判断纯DNA的OD260/OD280应大于1.8，而纯RNA的OD260/OD280应达到2.0。如果样品中含又杂蛋白、苯酚，则OD260/OD280的比值会明显
10、降低。所以我们通过测定OD260/OD280的比值来检测RNA的纯度。0.5ml,稀释200倍,取3ml于比色皿中分别在260nm、280nm处测定其光吸收值（OD1、OD2）根据测得的OD值判断提取的RNA的纯度。RNA的鉴定之二：醋酸纤维素薄膜电泳分离鉴定1、RNA的碱水解：称取0.15xxRNA，溶于4mL0.3mol/L氢氧化钾溶液中，使RNA的浓度达到20-30mg/ml。沸水浴30min或者在37水解18个小时。将水解液转移到椎形瓶中。冰浴中用高氯酸溶液将水解液滴定到pH3.5。2000r/min离心10min，上清液即是样品液。、准备与点样（1）将薄膜切成2.0cm8cm的小片。
11、在薄膜无光泽面（正面）的一端约3.0cm处用硬铅笔划一点样线。（2）将薄膜xx面向下，置pH3.5,0.02mol/L的柠檬酸缓冲液中浸湿。3电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面（即点样面）向下，点样端置于负极，槽架上以双层滤纸作桥垫，滤纸的一端与支架的前沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中。用缓冲液将滤纸全部浸润并驱除气泡。膜条与滤纸需贴紧，待平衡5min后通电，电压为160500V，电流为0.4mA/cm，通电25-35分钟左右关闭电源。4记录结果通电完毕后用镊子将薄膜取出，于紫外灯下观察，用铅笔将吸收紫外光的暗斑圈出。（3）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。（4）点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。（5）电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。（6）操作过程为防止指纹污染，应戴手套。
