新课改专用版高考一轮复习第十二单元第二讲基因工程讲义生物 解析版Word文件下载.docx
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(5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(×
(6)E·
coliDNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端(×
(7)用于载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点(√)
(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中,使之稳定存在并表达(√)
2.载体需具备的条件及其作用(连线)
3.据两种限制酶的作用图示填空
(1)已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG,在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。
(2)写出产生的末端的种类:
①产生的是黏性末端;
②产生的是平末端。
(3)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同,切割位点不同(填“相同”或“不同”),说明限制酶具有专一性。
4.学透教材、理清原因、规范答题用语专练
(1)①是________酶,②是____________酶,二者的作用部位都是______________。
(2)限制酶不切割自身DNA的原因:
____________________________________________________________。
答案:
(1)限制 DNA连接 磷酸二酯键
(2)自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
1.与DNA有关的酶的比较
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
DNA片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶
脱氧核苷酸
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链
RNA聚合酶
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
2.限制酶的特点与使用
(1)限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,并在特定的位点上进行切割;
限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶,以获得相同的黏性末端。
但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”,可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体,使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。
[对点落实]
1.(2018·
浙江4月选考单科卷,节选)回答与基因工程有关的问题:
(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切,在切口处形成________。
选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成________,获得重组质粒。
(2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。
取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成________实验。
在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是______________________________,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。
解析:
(1)构建重组质粒时限制性核酸内切酶EcoRⅠ剪切得到的是粘(黏)性末端,DNA连接酶连接两个DNA片段,两个片段相邻处形成磷酸二酯键。
(2)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。
Ca2+处理方法使细菌处于感受态,以利于重组质粒导入,实现转化。
而细胞要正常表达相关基因,应让其恢复为正常状态,故应在摇床上培养一段时间。
(1)粘(黏)性末端 磷酸二酯键
(2)转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态
2.(2016·
江苏高考,有改动)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点,其中切割位点相同的酶不重复标注。
请回答下列问题:
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用__________________两种限制酶切割,酶切后的载体和目的基因片段,通过________酶作用后获得重组质粒。
为了扩增重组质粒,需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加________,平板上长出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物组成为图2中________________________________________________________________________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接,连接部位的6个碱基对序列为________________________,对于该部位,这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时,应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性,即遵循“目的基因切两侧,标记基因留一个”的基本原则,最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因,以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达,因此据图分析应选择的限制酶为BclⅠ和HindⅢ,切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。
酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒,重组质粒需要导入Ca2+处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加,便于重组质粒进入)。
(2)由上述分析可知,为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌,应先配制含四环素的选择培养基,平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落,进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌,可利用PCR扩增的方式,结合电泳技术来分析处理。
DNA的两条链是反向平行的,在PCR过程中,当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链,因此应选择引物甲和引物丙。
(3)因为BclⅠ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同,所以可以被DNA连接酶连接,连接部位的6个碱基对序列为
,但是连接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的识别序列,连接部位不能被这两种酶切开。
(4)由图可知,能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别并切割,因此图中质粒上存在3个Sau3AⅠ的切割位点,若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c,则完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段,即为a、b和c;
考虑只切1个切割位点,有3种情况,都产生1种大小的DNA片段,即大小均为a+b+c;
考虑切2个切割位点,则会产生a+b、c、a+c、b、b+c、a几种不同大小的DNA片段。
综上所述,若用Sau3AⅠ识别并切割图中质粒,最多可获得7种大小的DNA片段,即为a+b+c、a+b、a+c、b+c、a、b、c。
(1)BclⅠ和HindⅢ 连接 感受
(2)四环素 引物甲和引物丙 (3)
都不能 (4)7
[类题通法]
选择限制酶的技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。
考点二 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
―→
1.目的基因的获取
(1)目的基因:
主要是指编码蛋白质的基因,也可以是具有调控作用的因子。
(2)获取方法
2.基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成:
目的基因、启动子、终止子及标记基因等。
3.目的基因导入受体细胞
受体细胞类型
方法
植物细胞
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
动物细胞
显微注射技术(注射到受精卵内)
微生物细胞
感受态细胞法(Ca2+处理法)
4.目的基因的检测与鉴定
检测目的
检测方法
判断标准
目的基因是否插入转基因生物的DNA
DNA分子杂交技术
是否出现杂交带
目的基因是否转录出了mRNA
分子杂交技术
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交技术
个体水平的检测
如抗虫、抗病的接种实验
是否表现出相应的特性
(1)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点(×
(2)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测(×
(3)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(×
(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达(√)
(5)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(√)
(6)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶(×
(7)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制(×
(8)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法(√)
(9)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(×
(10)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原-抗体杂交技术(×
2.基因表达载体的组成及各部分的作用(连线)
3.学透教材、理清原因、规范答题用语专练
(1)从图中可以看出,目的基因是________________,使用的载体是________,将基因表达载体导入受体细胞的方法是________________。
(2)请写出两种检测目的基因是否表达的方法:
________________________________________。
(1)Bt毒蛋白基因 Ti质粒 农杆菌转化法
(2)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫
1.获取目的基因的方法比较
从基因文库中获取
人工合成
从基因组文
库中获取
从部分基因文
库中获取,如
cDNA文库
化学
合成法
逆转
录法
过
程
2.PCR反应的过程
过程
说明
图解
变性
温度上升到90℃左右,双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到55℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度上升到72℃左右,Taq酶从引物起始合成互补链,可使新链由5′端向3′端延伸
3.目的基因检测与鉴定的方法
1.(2019·
浙江重点中学联考)下图为获得抗除草剂转基因玉米的技术路线,请回答:
(1)构建表达载体选择限制酶时,要求Ti质粒内每种限制酶只有一个切割位点,同时要求酶切后,G基因形成的两个粘(黏)性末端序列不相同,这个过程需用________种限制酶,目的是__________________。
除草剂抗性基因G和Ti质粒载体连接时,DNA连接酶催化形成的化学键是__________________。
(2)农杆菌转化愈伤组织时,TDNA携带________插入受体细胞的核DNA。
若核DNA中仅插入一个G基因,自交后代含G基因的植株中,纯合子占________。
(3)获得抗除草剂转基因玉米涉及多次筛选,其中筛选含重组质粒的农杆菌应使用含________的选择培养基,使用含________的选择培养基筛选出转化的愈伤组织,再诱导愈伤组织再生出抗除草剂转基因玉米。
(1)由于题干要求酶切后G基因形成的两个粘(黏)性末端序列不相同,因此需要用2种不同的限制酶进行酶切。
由于粘(黏)性末端不同,因此可以防止酶切产物自身环化。
DNA连接酶可催化DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(2)TDNA可携带目的基因插入到受体细胞的核DNA中。
倘若仅插入一个G基因,培育成的植株相当于单杂合子,自交后代含G基因的植株中,纯合子占1/3。
(3)由于抗生素对某些微生物具有抑制作用,因此筛选含重组质粒的农杆菌应使用含抗生素的选择培养基。
而对植物细胞的筛选应使用含除草剂的培养基,以筛选出能表达抗除草剂基因的玉米细胞。
(1)2(不同) 防止酶切产物自身环化(意思正确即可) 磷酸二酯键
(2)目的基因(抗除草剂基因G) 1/3 (3)抗生素 除草剂
2.(2018·
江苏高考,有改动)为生产具有特定性能的α淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了α淀粉酶基因(1656个碱基对),利用基因工程大量制备α淀粉酶,实验流程见下图。
(1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前,需先获得细菌的________________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的________端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中________的设定与引物有关,________的设定与扩增片段的长度有关。
(填序号)
①变性温度 ②退火(复性)温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火(复性)时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α淀粉酶的mRNA的部分碱基序列:
图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如下:
缓冲液
50mmol/LNa2HPO4KH2PO4
50mmol/LTrisHCl
50mmol/L
GlyNaOH
pH
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
酶相对活性(%)
25.4
40.2
49.8
63.2
70.1
95.5
99.5
85.3
68.1
63.7
41.5
20.8
根据上述实验结果,初步判断该α淀粉酶活性最高的条件为________________________________________________________________________。
(1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前,需先获得细菌的基因组DNA作为模板,并依据α淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。
(2)利用PCR技术扩增DNA时,只能从3′端延伸DNA子链,为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5′端加上限制性酶切位点,并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,这样既能防止目的基因、载体的自身连接,又能确保目的基因与表达载体的定向连接。
(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步,变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链,且时间很短;
退火(复性)时引物结合到互补的DNA单链上,退火(复性)温度由引物复性温度决定,其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关;
延伸时间与产物片段的长度有关,产物在1kb以内的延伸时间为1min左右,3~4kb的延伸时间为3~4min。
(4)图中虚线框内共含有24个碱基,mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸,故共包含8个密码子。
虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U,第2和第3个碱基各有4种可能性,因此共有16种可能性。
题干表明控制α淀粉酶的基因有1656个碱基对,说明图中虚线框后的第1个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA),故虚线框后第1个密码子实际最多可能性有16-3=13(种)。
(5)分析表格中的数据,酶相对活性最高为99.5%,对应的条件是pH为8.5,缓冲液为50mmol/LTrisHCl。
(1)基因组DNA
(2)5′ 使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连 (3)② ⑥ (4)8 13 (5)pH为8.5,缓冲液为50mmol/LTrisHCl
考点三 基因工程的应用与蛋白质工程
一、基因工程的应用
1.植物基因工程:
培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物;
利用转基因改良植物的品质;
利用植物生产药物等。
2.动物基因工程:
用于提高动物生长速度;
用于改善畜产品品质;
用转基因动物生产药物;
用转基因动物作器官移植的供体等。
3.基因工程药物
利用转基因的“工程菌”来生产的药物。
细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
4.基因治疗
(1)概念:
把正常基因导入病人体内,使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的,这是治疗遗传病的最有效的手段。
(2)类型:
体外基因治疗和体内基因治疗。
二、蛋白质工程
(1)操作手段:
基因修饰或基因合成。
(2)结果:
对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
(3)设计流程
(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株(√)
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品,如人的血清白蛋白,这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(×
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(×
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质(√)
(5)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质(√)
(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作,定向改变分子的结构(×
2.填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义
A.转录,B.翻译,C.分子设计,D.氨基酸序列,E.预期功能。
1.体外基因治疗与体内基因治疗的区别
比较
体外基因治疗
体内基因治疗
不同点
途径
从患者体内获得某种细胞→体外完成基因转移→筛选、细胞扩增→输入体内
直接向患者体内组织细胞中转移基因
操作复杂,但效果可靠
方法较简单,但效果难以控制
相同点
都是将外源基因导入靶细胞,以纠正缺陷基因,目前两种方法都处于临床试验阶段
2.基因治疗与基因诊断的比较
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中,以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床试验
基因诊断
碱基互
补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合,分析杂交带情况
临床应用
3.蛋白质工程与基因工程的关系
项目
区别与联系
蛋白质工程
基因工程
区别
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
[对点落实]
大庆质检)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病,患者的血红蛋白分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替,导致功能异常。
回答下列问题:
(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的________________序列发生改变。
(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中,可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。
此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程,理由是该操作________________________________。
(3)用基因工程方法制备血红蛋白时,可先提取早期红细胞中的________,以其作为模板,在________酶的作用下反(逆)转录合成cDNA。
cDNA与载体需在限制酶和________酶的作用下,构建基因表达载体,导入受体菌后进行表达。
(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白,可从受体菌中提取____________,用相应的抗体进行________________杂交,若出现杂交带,则表明该受体菌已合成血红蛋白。
(1)编码血红蛋白的基因中碱基对的替换导致编码的氨基酸种类改变。
(2)蛋白质工程通过基因修饰或基因合成,实现对现有蛋白质的改造或制造新蛋白质,由于该操作中没有对蛋白质或基因进行改造,因此不属于蛋白质工程。
(3)因血红蛋白基因只在早期红细胞中表达,所以可从其中提取mRNA,以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下,反(逆)转录合成cDNA。
构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶。
(4)目的基因是否表达可以通过从受体菌中提取蛋白质,进行抗原-抗体杂交实验加以判断。
(1)碱基对(或脱氧核苷酸)
(2)不属于 没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰) (3)mRNA(或RNA) 逆转录 DNA连接 (4)蛋白质 抗原—抗体
2.(2015·
全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转运蛋白,由305个氨基酸组成
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