1、（5）限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶（6）Ecoli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端（7）用于载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点（）（8）载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达（）2载体需具备的条件及其作用（连线）3据两种限制酶的作用图示填空（1）已知限制酶EcoR和Sma识别的碱基序列和酶切位点分别为GAATTC和CCCGGG，在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。（2）写出产生的末端的种类：产生的是黏性末端；产生的是平末端。（3）EcoR限制酶和Sma限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同（填“相同”或“
2、不同”），说明限制酶具有专一性。4学透教材、理清原因、规范答题用语专练（1）是_酶，是_酶，二者的作用部位都是_。（2）限制酶不切割自身DNA的原因：_。答案：（1）限制DNA连接磷酸二酯键（2）自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰1与DNA有关的酶的比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA（水解）酶将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶
3、核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端2限制酶的特点与使用（1）限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。（2）在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。（3）为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。对点落实1（2018
4、浙江4月选考单科卷，节选）回答与基因工程有关的问题：（1）将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR酶切，在切口处形成_。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接，在两个片段相邻处形成_，获得重组质粒。（2）已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成_实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是_，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。解析：（1）构建重组质粒时限制性核酸内切酶EcoR剪切得到的是粘（黏）性末端
5、，DNA连接酶连接两个DNA片段，两个片段相邻处形成磷酸二酯键。（2）目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。Ca2 处理方法使细菌处于感受态，以利于重组质粒导入，实现转化。而细胞要正常表达相关基因，应让其恢复为正常状态，故应在摇床上培养一段时间。（1）粘（黏）性末端磷酸二酯键（2）转化使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态2（2016江苏高考，有改动）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：BamHBclSau3AHind 识别序列及切割位点 （1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切
6、割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌。（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_。（3）若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_（填“都能”“都不能”或“只有一种能”）切开。（4）若用Sau3A切图1质粒最多可能获得_种大小不同的DNA片段。（1）基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留
7、一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为Bcl和Hind，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入Ca2处理后的处于感受态的大肠杆菌（处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入）。（2）由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用PCR扩增的方式，结合电泳技术
8、来分析处理。DNA的两条链是反向平行的，在PCR过程中，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶只能从引物的3端延伸DNA链，因此应选择引物甲和引物丙。（3）因为Bcl和BamH酶切产生的黏性末端相同，所以可以被DNA连接酶连接，连接部位的6个碱基对序列为，但是连接后形成的DNA中不再具有Bcl和BamH的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。（4）由图可知，能被限制酶Bcl和BamH切割的序列也能被Sau3A识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3A的切割位点，若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，则完全酶切（3个切割位点均被切割）会产生3种大小的DNA片段，
9、即为a、b和c；考虑只切1个切割位点，有3种情况，都产生1种大小的DNA片段，即大小均为abc；考虑切2个切割位点，则会产生ab、c、ac、b、bc、a几种不同大小的DNA片段。综上所述，若用Sau3A识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为abc、ab、ac、bc、a、b、c。（1）Bcl和Hind连接感受（2）四环素引物甲和引物丙（3） 都不能（4）7类题通法选择限制酶的技巧（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意
10、连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因。考点二基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1目的基因的获取（1）目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。（2）获取方法2基因表达载体的构建（1）构建基因表达载体的目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目的基因能
11、够表达和发挥作用。（2）基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子及标记基因等。3目的基因导入受体细胞受体细胞类型方法植物细胞农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法动物细胞显微注射技术（注射到受精卵内）微生物细胞感受态细胞法（Ca2处理法）4.目的基因的检测与鉴定检测目的检测方法判断标准目的基因是否插入转基因生物的DNADNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交技术个体水平的检测如抗虫、抗病的接种实验是否表现出相应的特性（1）表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点（2）转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测（3
12、）PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应（4）抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达（） （5）用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列（）（6）PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶（7）外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制（8）目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法（）（9）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体（10）检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原抗体杂交技术（2基因表达载体的组成及各部分的作用（连线）3学透教材、理清原因、规范答题用语专练（1）从图中可以看出，目的基因是
13、_，使用的载体是_，将基因表达载体导入受体细胞的方法是_。（2）请写出两种检测目的基因是否表达的方法：_。（1）Bt毒蛋白基因Ti质粒农杆菌转化法（2）抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫1获取目的基因的方法比较从基因文库中获取人工合成从基因组文库中获取从部分基因文库中获取，如cDNA文库化学合成法逆转录法过程2PCR反应的过程过程说明图解变性温度上升到90 左右，双链DNA解聚为单链复性温度下降到55 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸温度上升到72 左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5端向3端延伸3目的基因检测与鉴定的方法1（2019浙江重点中学联考）下图为获得
14、抗除草剂转基因玉米的技术路线，请回答：（1）构建表达载体选择限制酶时，要求Ti质粒内每种限制酶只有一个切割位点，同时要求酶切后，G基因形成的两个粘（黏）性末端序列不相同，这个过程需用_种限制酶，目的是_。除草剂抗性基因G和Ti质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_。（2）农杆菌转化愈伤组织时，TDNA携带_插入受体细胞的核DNA。若核DNA中仅插入一个G基因，自交后代含G基因的植株中，纯合子占_。（3）获得抗除草剂转基因玉米涉及多次筛选，其中筛选含重组质粒的农杆菌应使用含_的选择培养基，使用含_的选择培养基筛选出转化的愈伤组织，再诱导愈伤组织再生出抗除草剂转基因玉米。（1）由于题干要
15、求酶切后G基因形成的两个粘（黏）性末端序列不相同，因此需要用2种不同的限制酶进行酶切。由于粘（黏）性末端不同，因此可以防止酶切产物自身环化。DNA连接酶可催化DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）TDNA可携带目的基因插入到受体细胞的核DNA中。倘若仅插入一个G基因，培育成的植株相当于单杂合子，自交后代含G基因的植株中，纯合子占1/3。（3）由于抗生素对某些微生物具有抑制作用，因此筛选含重组质粒的农杆菌应使用含抗生素的选择培养基。而对植物细胞的筛选应使用含除草剂的培养基，以筛选出能表达抗除草剂基因的玉米细胞。（1）2（不同）防止酶切产物自身环化（意思正确即可）磷酸二酯键（2）目的基因（抗除草剂基
16、因G）1/3（3）抗生素除草剂2（2018江苏高考，有改动）为生产具有特定性能的淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了淀粉酶基因（1 656个碱基对），利用基因工程大量制备淀粉酶，实验流程见下图。（1）利用PCR技术扩增淀粉酶基因前，需先获得细菌的_。（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_。（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_的设定与引物有关，_的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）变性温度退火（复性）温度延伸温度变性时间退火（复性）时间延伸时间（4）下图表示筛
17、选获得的工程菌中编码淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：图中虚线框内mRNA片段包含_个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有_种。（5）获得工程菌表达的淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：缓冲液50 mmol/L Na2HPO4KH2PO450 mmol/L TrisHCl50 mmol/L GlyNaOHpH6.06.57.07.58.08.59.09.510.010.5酶相对活性（%）25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8根据上述实验结果，初步判断该淀粉酶活性
18、最高的条件为_。（1）利用PCR技术扩增淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。（2）利用PCR技术扩增DNA时，只能从3端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。（3）PCR技术包括变性、退火（复性）和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火（复性）时引物结合到互补的DNA单链上，退火（复性）温度由引物复性温度决定，其温度设定与引
19、物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，34 kb的延伸时间为34 min。（4）图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第1个密码子肯定不是终止密码子（3种终止密码子为UAA、UAG、UGA），故虚线框后第1个密码子实际最多可能性有16313（种）。（5）分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8
20、.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl。（1）基因组DNA（2）5使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连（3）（4）813（5）pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl考点三基因工程的应用与蛋白质工程一、基因工程的应用1植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质；利用植物生产药物等。2动物基因工程：用于提高动物生长速度；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。3基因工程药物利用转基因的“工程菌”来生产的药物。细胞因子、抗体、疫苗、激素等。4基因治疗（1）概念：把正常基因导入病人体内，使
21、该基因的表达产物发挥功能， 从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。（2）类型：体外基因治疗和体内基因治疗。二、蛋白质工程（1）操作手段：基因修饰或基因合成。（2）结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。（3）设计流程（1）将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株（）（2）利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中（3）由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用（4）蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质（）（5）蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质（）（6）蛋白质工
22、程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构（2填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义A转录，B.翻译，C.分子设计，D.氨基酸序列，E.预期功能。1体外基因治疗与体内基因治疗的区别比较体外基因治疗体内基因治疗不同点途径从患者体内获得某种细胞体外完成基因转移筛选、细胞扩增输入体内直接向患者体内组织细胞中转移基因操作复杂，但效果可靠方法较简单，但效果难以控制相同点都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临床试验阶段2基因治疗与基因诊断的比较原理操作过程进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗（疾病）临床试验基因诊断碱基互补配
23、对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用3.蛋白质工程与基因工程的关系项目区别与联系蛋白质工程基因工程区别预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造 对点落实大庆质检）镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红
24、蛋白分子肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题：（1）异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的_序列发生改变。（2）将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作_（填“属于”或“不属于”）蛋白质工程，理由是该操作_。（3）用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的_，以其作为模板，在_酶的作用下反（逆）转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和_酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。（4）检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取_，用相应的抗体进行_杂交，若出现杂交带，则表
25、明该受体菌已合成血红蛋白。（1）编码血红蛋白的基因中碱基对的替换导致编码的氨基酸种类改变。（2）蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，实现对现有蛋白质的改造或制造新蛋白质，由于该操作中没有对蛋白质或基因进行改造，因此不属于蛋白质工程。（3）因血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，反（逆）转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶。（4）目的基因是否表达可以通过从受体菌中提取蛋白质，进行抗原抗体杂交实验加以判断。（1）碱基对（或脱氧核苷酸）（2）不属于没有对现有的蛋白质进行改造（或没有对基因进行修饰）（3）mRNA（或RNA）逆转录DNA连接（4）蛋白质抗原抗体2（2015全国卷）已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成
