渝动疫控发35号 附件3.docx
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渝动疫控发35号附件3
附件3:
动物结核病诊断技术
GB/T18645-2002
Diagnostictechniquesfortuberculosisofanimal
2002-02-19发布 2002-05-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布
1、范围
本标准规定了动物结核病的检测方法和要求。
本标准适用于动物结核病检测。
2、定义、符号和缩略语
本标准采用下列符号和缩略语:
PPD:
提纯蛋白衍生物(purified protein derivative)。
IU:
国际单位(internationalunit)。
3、细菌学检查
3.1 病料的采集和处理
用于细菌学检查的材料采自淋巴结及其他组织。
当活畜有可疑的呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核时,其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便可作为细菌学检查的材料。
对那些结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性,但尸检时无病理学病变的动物,可从下颌、咽后、支气管、肺(特别是肺门及肺门淋巴结)、纵隔及一些肠系膜的淋巴结采集样品送检。
样品应封装在无菌的容器内冷藏运送。
为了提高检出结果,样品可采取消化浓缩法处理,处理方法见附录A(标准的附录)。
3.1.1痰
对牛常可用痰进行细菌学检验。
牛咯痰极少,宜在清晨采集。
用硬橡胶管自口腔伸人至气管内,外端连接注射器吸取痰液。
亦可取牛咳出的疾块进行检验。
痰样品稀薄时,可加人等量的4%~6%硫酸(见附录A中A3)处理,如痰样品粘稠时,则加入5倍量的4%硫酸处理。
充分摇匀后置37℃作用20min,以3000r/min~4000r/min离心,沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。
也可用2倍量15%~20%安替福民(antiformin)溶液(见附录A中A3)处理痰液,将混合物置37℃作用1h~2h后离心。
以灭菌生理盐水冲洗沉淀物几次后,取沉淀物染色镜检、培养和动物试验。
3.1.2乳
怀疑有乳房结核时,可无菌采集乳汁进行检验(一般以挤出之最后乳汁含菌量较多,早晨挤出的乳中含菌量最高)。
将乳汁分置4~6支离心管中,每管10mL,以3000r/min~4000r/min离心20min~30min,吸取上层乳脂和管底的沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。
乳汁10mL加酒精和乙醚各10mL及15%~20%安替福民溶液30mL,摇匀置37℃恒温箱内1h~2h,取出加等量灭菌蒸馏水混匀,离心沉淀后弃去上清,取沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。
3.1.3精液和子宫分泌物
在生殖道结核可疑时,可采集公畜精液、母畜子宫分泌物进行细菌学检查。
处理子宫分泌物,可用15%~20%安替福民溶液,混匀后静置2h~3h,3000r/min~4000r/min离心20min,弃上清,加10mL,蒸馏水于沉淀物中。
即可作动物试验,经1.5~2个月剖检。
3.1.4尿
有肾结核可疑时,可采集尿液,一般采集中段尿液,以早晨第一次尿为宜。
如仅作染色镜检,可将尿液以3000r/min~4000r/min离心20min后,取沉淀物涂片。
如作培养或动物试验,则应将尿液进行消化浓缩处理,再进行检验以免杂菌生长而影响检验结果。
3.1.5粪便
有肠结核可疑时,可采集粪便进行细菌学检查,患肺结核的牛只,有时在粪便中亦可检出结核分枝杆菌。
因牛常将痰液吞咽至消化道中,随粪便排出。
尽量采集混有粘液或脓血的粪便。
取粪便30g,加15%~20%安替福民溶液15mL和蒸馏水55mL,混合,经2h~3h后,3000r/min~4000r/min离心30min,倾去上清液,加10mL蒸馏水于沉淀物中,将此液用纱布过滤后接种于豚鼠皮下,经1.5~2个月后剖检。
或将粪便加2倍量灭菌蒸馏水磨碎,然后加氯化钠至饱和。
当液体中残渣沉淀后(液体完全澄清),浮起的薄膜含有大量的结核分枝杆菌。
取出薄膜,用等量的4%氢氧化钠(见附录A中A2)充分混合,置37℃中3h,然后离心,取沉淀物用8%盐酸中和后,即可作染色镜检、培养和动物试验。
粪便中如有粘液或脓血,可挑取粘液脓血选用任何一种消化液处理后检验。
如系纯粪便,取5g~10g,加生理盐水约3~4倍混合后,用细铜纱网过滤,取滤液置室温中自然沉淀,然后取上层悬液置于另一大离心管或烧杯内,加消化液约3~4倍量,置37℃温箱1h~2h,同上法处理后检验。
3.1.6组织器官
尽量采集有结节病灶的部位。
猪易患颈部淋巴结结核、亦易患肠系膜淋巴结核,且常呈钙化或干烙样病变。
家禽常在肠、脾、肝发生结核病灶,有时亦可见于肺或卵巢。
病变组织需先研磨,制成乳剂,通常取组织乳剂或其他液状病2mL~4mL,加入等量的5%氢氧化钠溶液,充分振摇5min~10min,或摇至发生液化为止,液化后经3000r/min~4000r/min离心15min~30min,沉淀物加1滴酚红作指示剂,以2mol/L盐酸中和至淡红色后,作染色镜检、培养和动物试验。
如病料为脓状或干酪状或钙化的结节病灶组织,可直接作染色镜检,往往可以检出众多的结核分枝杆菌。
但得到阴性结果时,应浓缩处理后检验。
3.2检验方法
3.2.1染色镜检
3.2.1.1涂片
先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白(鸡蛋白20mL,甘油20mL,水杨酸钠0.4g,混匀),然后吸取标本滴加其上,涂布均匀。
如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料,在涂片制成后,可先用二甲苯或乙醚滴加覆盖于涂片之上,经摇动1min~2min脱脂后倾去,再滴加95%酒精以除去二甲苯,待酒精挥发后即可染色。
3.2.1.2染色
染色液配制方法见附录B(标准的附录)。
萋-尼氏抗酸染色:
处理过的被检材料涂片后,经火焰固定,加苯酚复红染色液(见附录B中B1)覆盖,将玻片在火焰上加热至出现蒸汽(不能产生气泡),如此热染5min(如染色液干涸,须加适量补充)。
水洗后滴加3%盐酸酒精(见附录B中B2)脱色30s~60s(至无色素脱下为止)。
水洗后,以骆氏美蓝染色液(见附录B中B3)复染1min。
水洗,吸干,镜检。
抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色,其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成蓝色。
3.2.1.3镜检
结核分枝杆菌在显微镜下呈细长平直或微弯曲的杆菌,长1.5μm~5μm,宽0.2μm~0.5μm,在陈旧培养基上或干酪性淋巴结内的菌体,偶尔可见长达10μm或更长。
3.2.2培养
3.2.2.1培养基配制方法见附录C(标准的附录)
3.2.2.2被检标本经消化浓缩后吸取其沉淀物作为培养材料。
初次分离,可用配氏培养基(见附录C中C1)、L-J培养基(见附录C中C2)或青霉素血液琼脂培养基(见附录C中C3)。
3.2.2.3将经过处理的标本接种到培养基上(同时作2~4份),培养一天后,以熔化的石蜡封口,继续培养。
3.2.2.4牛型结核分枝杆菌比人型结核分枝杆菌生长要缓慢得多。
初次培养牛型结核分枝杆菌时,需36℃~37℃培养5~8周方可出现菌落。
在固定培养基上不产生任何颜色,菌落湿润、略显粗糙并发脆。
加1%的丙酮酸钠能促进生长,但在噻吩-2酸肼(T2H)培养基(见附录C中C4)上不生长。
3.2.2.5禽型结核分枝杆菌生长需要2~3周。
形成湿润、弥漫状,光滑及星光状菌落。
最适生长温度为40℃~42℃。
在T2H培养基上生长。
3.2.2.6人型结核分枝杆菌生长需要36℃~37℃培养3~4周。
该菌落干燥、粗糙,呈白色、黄色或橙色。
牢牢附着于培养基。
在T2H培养基上生长。
3.2.2.7非典型分枝杆菌生长快速,大部分(但不是全部)产生白色或具有橙色或黄色色素,常形成黄色或橙色菌落。
某些种类的色素只有在亮处才显出。
大多数典型种类的生长速度比牛或人型结核分枝杆菌快。
3.2.3动物试验
本试验是确诊结核病的重要依据,如能与涂片镜检和培养同时进行,则结果更为可靠。
3.2.3.1试验动物在试验前,应进行牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。
3.2.3.2豚鼠对牛型和人型结核分枝杆菌高度敏感,对禽型结核分枝杆菌有抵抗力,常只能形成局部病灶。
3.2.3.3家兔对禽型结核分枝杆菌高度敏感。
对牛型结核分枝杆菌敏感。
人型结核分枝杆菌虽可使其肺部形成少量病灶,但可趋于痊愈而不致死。
3.2.3.4处理过的病料约1mL~3mL,皮下或肌肉或腹腔内注射,每份病料至少接种2只同种动物。
接种后30d左右,进行禽型结核分枝杆菌PPD和牛型结核杆菌PPD皮内变态反应试验,如有阳性反应,可剖检其中的半数动物进行病理学观察,细菌培养和涂片镜检。
另一半继续观察至3个月再剖检观察。
如果为阴性反应,可于40d左右剖检其中的半数,观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检,另一半继续观察至3个月再剖检观察。
3.2.4牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定方法见附录D(指示的附录)。
4、结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
4.1牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
用结核分枝杆菌PPD进行的皮内变态反应试验对检查活畜结核病是很有用的。
该试验用牛型结核分枝杆菌PPD进行。
4.1.1牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
出生后20d的牛即可用本试验进行检疫。
4.1.1.1操作方法
a)注射部位及术前处理:
将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛(或提前一天剃毛),三个月以内的犊牛,也可在肩胛部进行,直径约10cm。
用卡尺测量术部中央皮皱厚度,作好记录。
注意,术部应无明显的病变。
b)注射剂量:
不论大小牛只,一律皮内注射0.1mL(含2000IU)。
即将牛型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升2万IU后,皮内注射0.1mL。
冻干PPD稀释后当天用完。
c)注射方法:
先以75%酒精消毒术部,然后皮内注射定量的牛型结核分枝杆菌PPD,注射后局部应出现小疱,如对注射有疑问时,应另选15cm以外的部位或对侧重作。
d)注射次数和观察反应:
皮内注射后经72h判定,仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应,并以卡尺测量皮皱厚度,作好详细记录。
对疑似反应牛应立即在另一侧以同一批PPD同一剂量进行第二回皮内注射,再经72h观察反应结果。
对阴性牛和疑似反应牛,于注射后96h和120h再分别观察一次,以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应。
4.1.1.2结果判定
a)阳性反应:
局部有明显的炎性反应,皮厚差大于或等于4.0mm。
b)疑似反应:
局部炎性反应不明显,皮厚差大于或等于2.0mm、
小于4.0mm。
c)阴性反应:
无炎性反应。
皮存差在2.0mm以下。
凡判定为疑似反应的牛只,于第一次检疫60d后进行复检,其结
果仍为疑似反应时,经60d再复检,如仍为疑似反应,应判为阳性。
4.1.2其他动物牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
参照牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验进行。
4.2禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验是最广泛使用于家禽的试验。
牛及其他哺乳动物也可用牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD同时在不同的部位进行,以区分特异性和非特异性变态反应。
4.2.1禽的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
4.2.1.1操作方法
用10mm×0.5mm针头肉垂皮内注射0.1mL(0.25万IU)禽型结核分枝杆菌PPD,48h后观察结果。
4.2.1.2结果判定
阳性反应为接种部位肿胀,从5.0mm直陉的小硬结到扩展至其他肉垂与颈部的广泛性水肿。
火鸡肉垂的结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验,没有家禽的试验那样可靠。
其他禽类也可用翼蹼作试验,但结果一般不理想。
水禽可接种脚蹼,但试验不敏感并经常与接种部位的感染相混淆。
4.2.2牛的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
4.2.2.1操作方法
与牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验相同,只是禽型结核分枝杆菌PPD的剂量为每头0.1mL,含0.25万IU。
即将禽型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含2.5万IU后,皮内注射0.1mL。
4.2.2.2结果判定
a)对牛型结核分枝杆菌PPD的反应为阳性(局部有明显的炎性反应,皮厚差大于或等于4.0mm),并且对牛型结核分枝杆菌PPD的反应大于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应,二者皮差在2.0mm以上,判为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。
对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。
其中即使少数牛的皮差在2.0mm以下,甚至对牛型结核分枝杆菌PPD的反应略小于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应(反应差小于或等于2.0mm),只要对牛型结核分枝杆菌PPD的反应在2.0mm以上,也应判定为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性牛。
b)对禽型结核分枝杆菌PPD的反应大于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应,两者的皮差在2.0mm以上,判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。
对已经定性为副结核分枝杆菌或禽型结核分枝杆菌感染的牛群。
其中即使少数牛的皮差在2.0mm以下,甚至对禽型结核分枝杆菌PPD的反应略小于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应(不超过2.0mm),只要对禽型结核分枝杆菌PPD的反应在2.0mm以上,也应判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性牛。
附录A
标本消化浓缩法
(标准的附录)
痰液或乳汁等样品,由于含菌量较少,如直接涂片镜检往往是阴性结果。
此外,在培养或作动物试验时,常因污染杂菌生长较快,使病原结核分枝杆菌被抑制。
下列几种消化浓缩方法可使检验标本中蛋白质溶解、杀灭污染杂菌,而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡,并得到浓缩。
A1硫酸消化法
用4%~6%硫酸溶液将痰、尿、粪或病灶组织等按1:
5之比例加入混合,然后置37℃作用1h~2h,经3000r/min~4000r/min离心30min,弃上清,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
也可用硫酸消化浓缩后,在沉淀物中加入3%氢氧化钠中和,然后抹片镜检、培养和接种动物。
A2氢氧化钠消化法
取氢氧化钠35g~40g,钾明矾2g,溴麝香草酚蓝20mg(预先用60%酒精配制成0.4%浓度,应用时按比例加入)、蒸馏水1000mL混合,即为氢氧化钠消化液。
将被检的痰、尿、粪便或病灶组织按1:
5的比例加入氢氧化钠消化液中,混匀后,37℃作用2h~3h,然后无菌滴加5%~10%盐酸溶液进行中和,使标本的pH调到6.8左右(此时显淡黄绿色),以3000r/min~4000r/min离心15min~20min,弃上清,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
在病料中加入等量的4%氢氧化钠溶液,充分摇荡5min~10min,然后用3000r/min离心15min~20min,弃上清,加1滴酚红指示剂于沉淀物中,用2mol/L盐酸中和至淡红色,然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
在痰液或小脓块中加入等量的1%氢氧化钠溶液,充分振荡15min,然后用3000r/min离心30min,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
对痰液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法:
取1mol/L(或4%)氢氧化钠水溶液50mL,0.1mol/L柠檬酸钠50mL,N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g混合。
取痰一份,加上述溶液2份,作用24h~48h,以3000r/min离心15min,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
A3安替福民(antiformin)沉淀浓缩法
溶液A:
碳酸钠12g、漂白粉8g、蒸馏水80mL。
溶液B:
氢氧化钠15g、蒸馏水85mL。
应用时A、B两液等量混合,再用蒸馏水稀释成15%~20%后使用,该溶液须存放于棕色瓶内。
将被检样品置于试管中,加入3~4倍量的15%~20%安替福民溶液,充分摇匀后37℃作用1h,加1~2倍量的灭菌蒸馏水,摇匀,3000r/min~4000r/rain离心20min~30min,弃上清沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
附录B
萋一尼氏抗酸染色液配制方法
(标准的附录)
B1苯酚复红染色液
碱性复红饱和酒精溶液(每100mL95%酒精加3g碱性复红)10mL,5%苯酚溶液90mL,二者混合后用滤纸滤过。
B2 3%盐酸酒精脱色液
浓盐酸3mL,95%酒精97mL,混匀。
B3 骆氏美蓝染色液
甲液:
美蓝0.3g,95%酒精30mL。
乙液:
0.01%氢氧化钾溶液100mL。
将甲乙两液相混合。
附录C
培养基配制方法
(标准的附录)
C1配氏(Petragnane)培养基
C1.1成分
新鲜脱脂牛奶450mL,马铃薯淀粉18g,天门冬素(或蛋白胨)2.6g,去皮马铃薯225g,鸡蛋15个(除去3个蛋清),甘油40g,2%孔雀绿水溶液30mL。
C1.2制法
将马铃薯去皮擦成丝,加入马铃薯淀粉、天门冬素(或蛋白胨)、脱脂牛奶置烧杯中水浴煮沸40min~60min,并不时搅拌均匀,使成糊状。
待冷却至50℃时加入打碎的鸡蛋(蛋壳先用75%酒精消毒洗净),混匀后用四层纱布过滤除渣。
最后加入甘油和孔雀绿水溶液搅拌均匀,分装于灭菌的试管中。
将分装培养基的试管置血清凝固器(或流通蒸汽锅)内,间歇灭菌3次,每天一次,第一天65℃灭菌30min,第二、三天75℃~80℃灭菌30min。
C1.3用途
分离培养结核分枝杆菌用。
C2L-J(Lowenstein-Jensen)培养基
C2.1成分
无水磷酸二氢钾(KH2PO4)2.4g,硫酸镁(MgSO4.H2O)0.24g,枸橼酸镁0.6g,DL-天门冬素(DL-Asparagin)3.6g,甘油12g,蒸馏水600mL,马铃薯粉30g,鸡蛋(约30个)1000mL,2%孔雀绿水溶液20mL。
C2.2制法
将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸镁、甘油和蒸馏水混合,加热使溶解。
取马铃薯粉加入上述溶液内,随加随搅拌,水浴煮沸1h。
鸡蛋用75%酒精消毒外壳后,打开,将蛋清和蛋黄充分搅匀,4层纱布过滤。
待上述加马铃薯粉的盐溶液冷却至50℃时,加入鸡蛋液和孔雀绿,并充分搅匀。
分装,80℃灭菌30min后,37℃培养48h,若无杂菌污染即可使用。
C2.3用途
供培养结核分枝杆菌用。
C3青霉素血液琼脂培养基
C3.1成分
琼脂1.5g,中性甘油1mL,蒸馏水74mL,兔全血(或牛全血)25mL,青霉素(2000IU/mL)1.85mL。
C3.2制法
将琼脂、中性甘油及蒸馏水混合,经103.4kPa15min灭菌。
待冷却到50℃时加入兔全血(或牛全血)与青霉素,混合后分装,经37℃培养48h,无杂菌污染即可使用。
C3.3用途
供培养结核分枝杆菌用。
C4噻吩-2酸肼(T2H)培养基
C4.1成分
L-J培养基,T2H。
C4.2制法
取L-J培养基(见C2)100mL,水浴煮沸,加T2H1mg,充分搅匀。
分装,80℃灭菌30min后,37℃培养48h,若无杂菌污染即可使用。
C4.3用途
供结核分枝杆菌生化鉴定用。
附录D
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定
(提示的附录)
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的鉴定,主要依据生化试验和动物试验。
D1生化试验
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的生化试验特性见表D1。
表D1
生化试验类型
烟酸试验
Tween-80水解试验
耐热接触酶试验
硝酸盐还原试验
尿素酶试验
T2H抗性试验
牛型结核分枝杆菌
-
-
-
-
+
-
禽型结核分枝杆菌
-
-
+
-
-
+
人型结核分枝杆菌
+
±
-
+
+
+
D1.1烟酸试验
D1.1.1试验方法
以热蒸馏水浸泡固体培养基上的培养物15min~30min,洗下。
每个培养物分装入2支试管中,每管0.4mL,再加入3%联苯胺乙醇溶液0.2mL。
然后向其中一管加入10%溴化氰溶液(此液剧毒,应在通风橱内操作)0.2mL。
D1.1.2结果判定
凡含10%溴化氰溶液的试管出现桃红色沉淀,另一管只产生无色沉淀者判为阳性;两支试管都为产生无色沉淀者判为阴性。
D1.2吐温-80(Tween-80)水解试验
D1.2.1试验方法
向100mL磷酸缓冲液(1/15mol/L,pH7.O)中加入0.5mLTween-80、2mL0.2%中性红溶液。
经112kPa灭菌20min,分装于试管中,每管2mL。
在4℃~10℃可保存2周。
取上述试管,加入10mg/mL的菌液0.5mL。
37℃培养,3d~5d观察结果。
D1.2.2结果判定
试管内由原来的琥珀色变为桃红色或红色者判为阳性。
无颜色变化为阴性。
D1.3耐热接触酶试验
D1.3.1试验方法
用生理盐水配制出5mg/mL~10mg/mL的菌液,分装试管,每管0.5mL,以68℃水浴20min,冷却后加入0.5mL过氧化氢(H2O2)和Tween-80混合液(10%Tween-80加等量30%H2O2)。
观察结果。
D1.3.2结果判断
肉眼观察,如有多量小气泡自管底升起,即为阳性。
否则为阴性。
D1.4硝酸盐还原试验
D1.4.1试验方法
在100mLpH7.0的磷酸盐缓冲液中,加入硝酸钠(NaN03·H20)85mg,经112kPa灭菌20min后分装,每管2mL。
向上述溶液中加入10mg/mL的菌液,经37℃水浴2h后,加入1滴2倍稀释的盐酸,2滴0.2%氨苯磺胺,2滴0.1%N-甲基盐酸二氨基乙烯。
在4℃~10℃存放2周后判断结果。
D1.4.2结果判定
呈粉红色至紫红色者为阳性。
无色或淡粉色为阴性。
D1.5尿素酶试验
D1.5.1试验方法
将被检材料接种尿素培养基。
37℃培养。
D1.5.2结果判定
在尿素培养基上长出结核分枝杆菌菌苔(或菌落),并且使培养基变成红色,即为阳性。
培养基不变色为阴性。
D1.6T2H抗性试验
D1.6.1试验方法
将被检材料接种T2H培养基和L-J培养基。
37℃培养。
D1.6.2结果判定
在上述两种培养基上长出结核分枝杆菌菌苔(或菌落)即为阳性。
若在L-J培养基上生长,而在T2H培养基上不生长,则为阴性。
D2动物试验
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的动物试验特性见表D2。
表D2
试验动物
豚鼠
兔
鸡
牛型结核分枝杆菌
易感
易感
不易感
禽型结核分枝杆菌
不易感
易感
易感
人型结核分枝杆菌
易感
不易感
不易感
D2.1试验方法
试验动物在试验前,应进行结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。
豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测;鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测;兔用牛型和禽型结核分枝杆菌PPD检测。
将处理过的病料约1mL~3mL,选用皮下、肌肉或腹腔内途径注射试验动物,每份病料至少接种2只同种试验动物。
接种后30d左右,对豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测;对鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测;对兔用牛型结核和禽型结核分枝杆菌PPD检测。
如有阳性反应,可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。
另一半继续观察至3个月再剖检观察。
如果为阴性反应,可于40d左右剖检其中的半数,观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检,另一半继续观察至3个月再剖检观察。
D2.2结果判定
D2.2.1牛型结核分枝杆菌感染
鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测阴性,无任何病变,细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。
同时从豚鼠和兔检测到结核分枝杆菌,或豚鼠和兔的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。
D2.2.2禽型结核分枝杆菌感染
豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测
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