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微生物学实验讲稿范文
微生物实验讲稿
实验一显微镜的使用及微生物形态观察
一.实验目的
1.了解普通光学显微镜的构造,学习显微镜的使用方法和保养.(高,低倍镜的使用)
2.观察细菌,霉菌,酵母菌个体形态,学会生物图的绘制.
二实验原理
根据凸透镜成像原理,在物镜一倍焦躁之外二倍焦距之内形成一个倒立放大的实像,成像在目镜一倍焦距之内,形成一个正立放大的虚像,如果利用一组透镜观察物体,能提高上千倍。
特别是油镜的使用,油镜的放大倍数最大(100),故镜头焦距短,直径小,但所需光照强度却最大.从标本片透过的光线是从玻片进入空气,再进入镜头.由于玻璃和空气的介质密度不同,有些光会因折射或反射而不能进入镜头.物象就显现不清.为了不使通过的光线有所损失,在镜头和所观察物体之间加入折射率和玻璃(n=1.52)相仿的香柏油(n=1.515).根据D=λ/2N.A.=λ/2n·sinα/2,可以增加视野的明亮度,提高折射率,增大分辨率。
其中数值孔径:
N.A.=n·sinα/2,n—玻片和物镜之间的折射率.α—光线最大射入角.分辨率(最大可分辨距离)=λ/N.A.,λ—波长,数值孔径是反应显微镜性能的主要参数。
三.实验器材
1.光学显微镜
2.示范片:
曲霉,青霉,酵母菌,细菌
四.实验内容
(一)显微镜的构造和使用方法
1.构造
机械部分:
镜筒(双筒,两筒间距离可调,上装有目镜)
转换器(3孔,装有物镜)
载物台(中央圆孔,弹簧夹,移动器)
调节器(粗调,细调)
镜臂(支撑作用)
镜座(上有光源,亮度可调)
光学部分:
目镜(10×,16×)
物镜(低倍镜10×,高倍镜40×,油镜100×)
聚光器(内有光圈调节)
光源(光量可调)
显微镜放大倍数=目镜放大倍数×物镜放大倍数
物镜上的标识:
1.25(0.65,0.25)100(40,10)1600.17
数值孔径放大倍数镜筒长盖玻片厚度
2.显微镜的使用
低倍镜的使用
(1)双手取出显微镜置于实验台上,接上电源,打开开关,调节合适光量.
(2)转动转换器,将低倍镜移至正下方.调节两目镜镜筒间的距离.
(3)将载玻片放在载物台上夹住,移动观察对象于圆孔正中.
(4)侧视物镜,转动粗调将载物台上移,至载玻片距物镜头约5mm时停止.
(5)双眼向目镜里观察,同时旋转粗调节器使载物台缓慢下移,若标本显出但不清晰,可用细调节器调至清晰.若粗调旋转太快,超过焦点没有看到标本,则必须重复(4),(5)步骤.不能在眼睛观察目镜的同时旋转粗调,以防物镜与载玻片相碰撞,造成损坏.
1-5
高倍镜的使用
在用低倍镜找到观察目标后,若需要进一步放大观察,将其移到视野中央.用转换器将高倍镜移到镜筒下方,将光量调大一点.若标本不清晰,用细调上下转动使之清晰.(此时不再动粗调)
3.显微镜的维护
(1)将载物台降至最低,取下标本片.
(2)将光量调至最小,关上电源.
(3)用镜头纸先檫目镜,物镜,再擦显微镜其它部分.
(4)将显微镜放入镜箱,还原.
4微生物形态的观察
1.用低倍镜和高倍镜观察细菌,曲霉,青霉,酵母菌,放线菌,示范片.
五.实验报告
1画出微生物形态图,并标明显微镜的放大倍数.如10╳10
实验二微生物的染色
一.目的
1.学习微生物的染色技术,掌握微生物的单染色法和革兰氏染色法.
2.复习油镜的操作.
二.实验原理
作为染料必须具备两个条件:
一是具有颜色;二是要与被染对象之间有亲和力。
染料的颜色是由基本身的分子结构决定的,产生颜色的叫发色基团,具有成盐性质的叫助色基团。
发色基团往往由硝基(-NO2),偶氮基(-N=N-),乙烯基等形成,而由—OH,-COOH等酸性基团和-NH2,-NHCH3等碱性基团形成的助色基团,它们的存在使染料物质离子化,极性增强,促进染料与组织间发生作用,产生染色效果。
我们把助色基团中具有酸性或碱性基团的染料分别称为酸性或碱性染料。
作为染料,必须有发色基团和助色基团相互配合,缺一不可。
如伊红有一个-COOH助色基团,在水中电离时放出氢离子,本身带负电荷,配制成伊红染料时,与强碱NaOH作用生成-COONa,此时的Na离子反而在溶液中呈碱性,所以不能认为酸性染料在溶液中就是酸性。
所以酸性或者碱性染料的界定并非由染料溶液PH值决定的,而是根据染料物质中助色基团电离后的电荷来决定,一般来说,助色基团带正电荷的染料为碱性染料,助色基团带负电荷的染料为酸性染料。
碱性染料PH一定大于7,酸性染料也不一定小于7.碱性染料有美兰(亚甲蓝)、甲基紫、草酸铵结晶紫、醋酸洋红、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等,在一般的情况下,细菌易被碱性染料染色。
酸性染料有伊红、刚果红、孟加拉红,藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等,可与碱性物质结合成盐。
当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时,氢离子浓度增加,细菌所带的正电荷增加,这时选择酸性染料,易被染色。
1.单染色法:
微生物不但个体微小,且无色半透明.要在显微镜下观察清楚,必须染上颜色.微生物细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质:
在酸性溶液中结合质子带正电;在碱性溶液中给出质子而带负电.等电点一般在pH=2~5.所以,在中性,碱性或弱酸性溶液中,微生物细胞通常带负电荷.碱性染料在电离时,染色部分是带正电荷的,容易与带负电荷的菌体结合使之着色.经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比,在显微镜下很容易观察.
2.革兰氏染色法:
革兰氏染色法将细菌分为G+和G-,这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定.用结晶紫初染后,所有的细菌都染上蓝紫色.碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物,增强了染料与菌体的结合力.用乙醇脱色处理时,两类细菌的脱色效果是不同的.G+细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,且壁厚,类脂含量低,用乙醇脱色时使细胞壁脱水,网状结构孔径缩小,通透性降低,使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内.虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色.G-细菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄,类脂含量高,所以在脱色处理时,类脂被乙醇溶解,细胞壁的通透性增大,使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的颜色.
三.实验器材
1.显微镜,香柏油,接种环,酒精灯等.
2.结晶紫染液,碘液,95%乙醇,复红染液.
3.菌种:
大肠杆菌,枯草芽孢杆菌.
四.实验内容
(一)单染色
1.涂片取一块载玻片,用记号笔划分出两区域并做上记号,在两区域中央各滴半滴无菌水,用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中,和匀后涂成薄膜.
2.干燥室温自然干燥或吹干.
3.固定涂面朝上,通过火焰2~3次.
4.染色在涂片薄膜上滴加结晶紫染液,使之覆盖2分钟.
5.水洗倾倒去染液,斜置载玻片,用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗,直至水呈无色为止.
6.干燥室温自然干燥或用吸水纸吸干.
(二)革兰氏染色
完成单染色的1~6步骤后
7.媒染加媒染剂碘液使之覆盖1分钟,水洗,吸水纸吸干.
8.脱色滴加95%乙醇数滴使之覆盖16秒钟,立即水洗,吸干.
9.复染用沙黄(番红)液复染2分钟,水洗,吸干.
(二)镜检
先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察的样品区域后,用转换器将物镜转到空挡,在样品区域滴加香柏油,再将油镜慢慢转到工作位置浸入油中.若不清晰,慢慢转动微调直至清楚.
油镜用完后,用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液檫拭油镜头.再用干的镜头纸檫干镜头.
五.实验
观察两种细菌的形态和颜色,绘出油镜下细菌形态图,说明革兰氏染色的结果.
六.思考题
通过实验,你认为革兰氏染色成功关键是那一步为了避免假阳性或假阴性出现,在对未知菌种做革兰氏染色鉴定时,你认为应该怎样做
实验三玻璃器皿的清洗包扎灭菌
一,目的要求
1熟悉微生物实验常用的器皿的名称规格
2.掌握器皿的清洗包扎方法.
3.掌握干热灭菌方法和原理.
二,基本原理
为了保证实验顺利进行,要求把实验用器皿清洗干净,保持灭菌后的无菌状态,需要对器皿进行妥善包括。
灭菌是指杀死或者消灭一定环境中的所有微生物,灭菌方法一般为物理和化学方法,本实验主要介绍物理方法即加热灭菌。
包括干热和湿热。
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的.细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越小,凝固缓慢.因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高(160—170℃),时间长(1—2小时).但干热灭菌温度不能超过170℃,否则,包器皿的纸或棉塞就会烤焦,甚至引起燃烧.如果对器皿进行烘干一般120℃半小时即可。
冷却到60度打开取出。
三,器材
培养皿,试管,吸管,电烘箱,,培养皿(10套一包),等.
四,操作步骤
清洗方法
1,任何洗涤方法,都不应对器皿有所损伤,不能用化学药剂,不能用比玻璃硬度更大的的物品来擦拭。
2一般新的玻璃器皿用2%的盐酸浸泡数小时,用水冲洗干净。
难洗的和易洗不能放一起,不要接触一些强酸强碱等,一般器皿能用洗衣粉肥皂清洗
包扎:
包扎三根吸管,10个培养皿,三根装有9毫升水的试管,1瓶装有50毫升的烧瓶
干热灭菌
1.装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品(培养皿,试管,吸管等)放入电烘箱内,物品不要摆得太挤,以免妨碍热空气流通.同时,灭菌物品也不要与电烘箱内壁的铁板接触,以防包装纸烤焦起火.
2.升温
关好电烘箱门,插上电源插头,拨动开关,旋动恒温调节器至红灯亮,让温度逐渐上升.如果红灯熄灭,绿灯亮,表示箱内已停止加温,此时如果还未达到所需的160—170℃温度,则需转动调节器使红灯再亮,如此反复调节,直至达到所需温度.
3.恒温
当温度升到160—170℃时,借恒温调节器的自动控制,保持此温度2小时.
4.降温
切断电源,自然降温.
5.开箱取物
待电烘箱内温度降到70℃以下后,打开箱门,取出灭菌物品.注意电烘箱内温度未降到70℃以前,切勿自行打开箱门,以免玻璃器皿炸裂.五,实验报告
五实验报告
1玻璃器皿清洗注意事项
2干热灭菌原理条件
思考题
(1)干热灭菌完毕后,在什么情况下才能开箱取物为什么
(2)为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高,时间长
(3)高压蒸汽灭菌开始之前,为什么要将锅内冷空气排尽灭菌完毕后,为什么要待压力降到0时才能打开排气阀,开盖取物
(4)在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,怎样杜绝一切不安全的因素
实验四培养基的制备与灭菌
一、目的要求
1明确培养基配制原理
2掌握培养基配制方法步骤以及湿热灭菌原理方法。
二、基本原理
培养基是供微生物生长、繁殖和代谢的营养基质。
培养基中一般含有微生物必须的碳源、氮源、能源、无机盐及水分等。
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。
由于微生物种类及代谢类型的多样性.因而用于培养微生物的培养基的种类也很多,它们的配方及配制方法虽各有差异。
但一般培养基的配制程序却大致相同.例如器皿的准备,培养基的配制与分装,棉塞的制作,培养基的灭菌,斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。
培养基配制完成进行分装后需进行高压蒸汽灭菌,高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽.待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌器内的压力,从而使沸点增高,得到高于100℃的温度.导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的.在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,其原因有三:
一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低(表Ⅵ-2),二是湿热的穿透力比干热大;三是湿热的蒸汽有潜热存在,每1克水在100℃时,由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量.这种潜热,能迅速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力.
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度.灭菌锅内留有不同分量空气时,压力与温度的关系见表Ⅵ-4.
压力数
MpaKg/cm2Ib/in2
全部空气排出时的温度/℃
2/3空气排出时的温度/℃
1/2空气排出时的温度/℃
1/3空气排出时的温度/℃
空气全不排出时的温度/℃
0.030.355
108.8
100
94
90
72
0.070.7010
115.6
109
105
100
90
0.1010.515
121.3
115
112
109
100
0.141.4020
126.2
121
118
115
109
0.171.7525
130.0
126
124
121
115
0.212.1030
134.6
130
128
126
121
一般培养基用1.05kg/cm2,121.3℃15—30分钟可达到彻底灭菌的目的.灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变.例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2),112.6℃灭菌15分钟,但为了保证效果,可将其他成分先行121.3℃,20分钟灭菌,然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液.又如盛于试管内的培养基以1.05kg/cm2,121.3℃灭菌20分钟即可,而盛于大瓶内的培养基最好以1.05kg/cm2灭菌30分钟.实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式,卧式和手提式等几种.本实验介绍手提式和立式高压蒸汽灭菌锅的使用方法.
(二)高压蒸汽灭菌
1.首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜.
2.放回灭菌桶,并装入待灭菌物品.注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果.三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞.
3.加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内.再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气.
4.用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气.待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升.当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间.本实验用1.05kg/cm2,121.3℃,20分钟灭菌.
5.灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至0时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品.如果压力未降到0时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染.
6.将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时,经检查若无杂菌生长,即可待用.
三、实验材料
药品:
待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。
仪器及玻璃器皿:
天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
其他物品:
药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。
四、操作步骤
(一)玻璃器皿的洗涤和包装
(二)液体及固体培养基的配制过程
1.液体培养基配制
称量:
一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品,先按培养基配方计算出各成分的用量.然后进行准确称量。
溶解:
将称好的药品置于一烧杯中,先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水),用玻璃棒搅动,加热溶解。
定容:
待全部药品溶解后,倒入一量筒中,加水至所需体积。
如某种药品用量太少时,可预先配成较浓溶液,然后按比例吸取一定体积溶液,加入至培养基中。
调pH:
一般用pH试纸测定培养基的pH。
用剪刀剪出一小段pH试纸,然后用镊子夹取此段pH试纸,在培养基中蘸一下,观看其pH范围,如培养基偏酸或偏碱时,可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液进行调节。
调节pH时,应逐滴加入NaOH或HCI溶液,防止局部过酸或过碱,破坏培养基中成分。
边加边搅拌,并不时用pH试纸测试,直至达到所需pH为止。
过滤:
用滤纸或多层纱布过滤培养基。
一般无特殊要求时,此步可省去。
2.固体培养基的配制
配制固体培养基时,应将已配好的液体培养基加热煮沸,再将称好的琼脂(1.5~2%)加
入,并用玻棒不断搅拌,以免糊底烧焦。
继续加热至琼脂全部融化,最后补足因蒸发而失去水分。
(三)培养基的分装
根据不同需要,可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内,分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口,造成污染。
如操作不小心,培养基沾污管口或瓶口时,可用镊子夹一小块脱脂棉,擦去管口或瓶口的培养基,并将脱脂棉弃去。
1.试管的分装
取一个玻璃漏斗,装在铁架上,漏斗下连一根橡皮管,橡皮管下端再与另一玻璃管相接,橡皮管的中部加一弹簧夹。
分装时,用左手拿住空试管中部,并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内,以右手拇指及食指开放弹簧夹,中指及无名指夹佐玻璃管嘴,使培养基直接流入试管内。
装入试管培养基的量视试管大小及需要而定,若所用试管大小为15×150mm时,液体培养基可分装至试管高度1/4左有为宜;如分装固体或半固体培养基时,在琼脂完全融化后,应趁热分装于试管中。
用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/5(约3—4mI),半固体培养基分装量为管高的1/3为宜。
2.三角瓶的分装
用于振荡培养微生物时,可在250m1三角瓶中加入50m1的液体培养基;若用于制作
平板培养基用时,可在250m1三角瓶中加入150ml培养基,然后再加入3g琼脂粉(按计算),灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。
(四)棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎
为了培养好气性微生物,需提供优良通气条件,同时为防止杂菌污染,则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。
通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。
1.试管棉塞的制作
制棉塞时,应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块,铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上,用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞.然后直接压入试管或三角瓶口。
也可借用玻璃棒塞入,也可用折叠卷塞法制作棉塞。
制作的棉塞应紧贴管壁,不留缝隙,以防外界微生物沿缝隙侵入,棉塞不宜过紧或过松,塞好后以手提棉塞,试管不下落为准。
棉塞的2/3在试管内,1/3在试管外。
目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。
将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆,外面包上一层牛皮纸。
用记号笔注明培养基名称及配制日期,灭菌待用。
2.三角瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一层纱布,再塞在瓶口上。
有时为了进行液体振荡培养加大通气量,则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上,目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。
在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上,再包上一层牛皮纸并用线绳捆好,灭菌待用。
(五)培养基的灭菌
培养基经分装包扎后,应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。
(六)斜面和平板的制作
1.斜面的制作
将已灭菌装有琼脂培养基的试管,趁热置于木棒或玻棒上,使成适当斜度,凝固后即成斜面。
斜面长度不超过试管长度l/2为宜。
如制作半团体或固体深层培养基时,灭菌后则应垂直放置至凝固。
2.平板的制作
将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后,待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。
温度过高时,皿盖上的冷凝水太多;温度低于50℃,培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应在火旁进行,左手拿培养皿,右手拿三角瓶的底部或试管,左手同时用小指和手掌将棉塞打开,灼烧瓶口,用左手大拇指将培养皿盖打开一缝,至瓶口正好伸入,倾入10~15mL培养基,迅速盖好皿盖,置于桌上,轻轻旋转平皿,使培养基均匀分布于整个平皿中,冷凝后即成平板。
(七)培养基的灭菌检查
灭菌后的培养基,一般需进行无菌检查。
最好取出1~2管(瓶),置于37℃温箱中培养1~2天,确定无菌后方可使用。
(八)无菌水的制备
在每个250mL的三角瓶内装100mL的蒸馏水并塞上棉塞或硅胶塞。
在每支试管内装4.5mL蒸馏水,塞上棉塞或硅胶塞。
再在棉塞上包上一张牛皮纸,高压蒸汽灭菌。
0.1MPa灭菌20~30min。
五、实验内容
根据要求清洗各种玻璃器皿,并进行包扎。
根据要求配制各种培养基。
用电热鼓风干燥箱对玻璃器皿进行干热灭菌。
用高压蒸汽灭菌锅对所配各培养基灭菌。
六、实验报告
简述移液管和培养皿的包扎注意事项。
简述配制培养基的基本步骤及注意事项。
为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花,再用报纸包起来,经高压蒸汽灭菌后才能使用?
为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞(硅胶塞)才能使用?
配制培养基时为什么要调节pH?
高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短?
附录灭菌技术
一、目的要求
了解消毒和灭菌的原理,并掌握各种灭菌方法的操作步骤。
二、实验材料
仪器或其他用具:
上述包扎的培养皿、试管、移液管等,电热鼓风干燥箱,高压蒸汽灭菌锅,微孔滤膜过滤器,0.22μm滤膜,注射器,镊子,玻璃涂棒。
培养基:
上述配制的培养基及生理盐水
三、基本原理
在微生物实验中,需要进行纯培养,不能有任何杂菌污染,因此必须对所用器材、培养基和工作场所进行灭菌和消毒。
灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物,包括微生物的营养体、芽孢和孢子。
实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。
这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性,从而达到灭菌的目的。
四、操作步骤
(一)干热灭菌法
干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气(160℃~170℃)进行灭菌,它是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。
此法适用于玻璃器皿如移液管、试管和培养皿的灭菌。
培养基、橡胶制品、塑料制品不能采用干热灭菌。
细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越小,凝固越慢。
因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高(160℃~170℃),时间长(1~2h)。
但干热灭菌温度不能超过180℃,否则,包器皿的纸或棉塞就会烧焦,甚至引起燃烧。
干热灭菌使用的是电热干燥箱(干燥箱)。
具体操作步骤如下:
装入待灭菌物品:
将包好的待灭菌物品放入电热干燥箱内,关好箱门。
堆积时要留有空隙,物品不要摆放得太挤,以免妨碍空气流通,灭菌物品不要接触电热干燥箱内壁的铁板、温度探头,以防包装纸烤焦起火。
升温:
接通电源,打开开关,适当打开电热干燥箱顶部的排气孔,旋动恒温调节器,使温度逐步上升。
当温度升至100℃时,关闭排气孔。
在升温过程中,如果红灯熄灭,绿灯亮,表示电热干燥箱内停止加温,此时如果还未达到所需的160℃~170℃,则需要转动温度调节器使红灯亮,如此反复调节,直至达到所需的温度。
恒温:
当温度升到160℃~170℃时,借助恒温调节器的自动控制,保持此温度2h。
干热灭菌过程中,严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。
降温:
切断电源,自然降温。
开箱取物:
待电热干燥箱内温度降到60℃以下后,才能打开箱门,取出灭菌物品。
同时,应将温度调节旋钮调到零点,并打开排气孔。
电热干燥箱内温度未降到60℃以前,切勿自行打开箱门,以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
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