第14章-急性毒性试验.ppt
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2023/5/23,1,第十四章急性毒性试验Acutetoxicitytest,2023/5/23,2,第一节概念和意义,一、基本概念急性毒性:
指24小时内单次或多次大剂量给予某药物所出现的有害作用,亦即指机体(人或实验动物)一次性大剂量接受某种药物后所产生的快速而剧烈的中毒反应,包括一般行为和外观改变、大体改变以及死亡效应。
急性毒性试验:
以观察急性毒性为目的而设计的一种毒理学试验,急性毒性试验以阐明药物的剂量-毒效关系为出发点,为全面毒性试验打下基础。
2023/5/23,3,第一节概念和意义,急性毒性试验的内容定性毒性反应的类型、出现和消失时间、可能的靶器官和死亡原因等;定量致死量、最大给药量、半数致死量等。
急性毒性试验的目的和意义测定药物的LD50及相关参数,初步估计该药物的毒性大小;观察药物的急性中毒症状,推测药物毒性靶器官为长期毒性试验和特殊毒性试验提供剂量设计参考,一、基本概念,2023/5/23,4,急性毒性试验是临床前新药安全性评价的第一步,与其它毒性试验相比具有简单、经济、易行等特点。
因此新药研究开发时往往通过该项试验,尽可能多的了解一些新药的毒理学特点,为早期判断侯选新药是否具有研究开发价值提供毒性强度资料。
第一节概念和意义,2023/5/23,5,第一节概念和意义,急性毒性试验试验结果体现了药理学与毒理学最基本的要素剂量的增加常伴随着反应程度(或死亡率)的增加,如以药物剂量对死亡率作图,则可以得到剂量-反应(死亡率)关系曲线。
常见的剂量-反应关系曲线有三种形式:
S形曲线抛物线直线,2023/5/23,6,二、LD50测定的意义及统计学原理,LD50的概念能引起一群实验动物50%死亡所需的剂量,或者说是某药物于一次性给予一群动物后预期引起50%死亡的、经统计学演算得出的一个剂量,是一个有置信限估计的中介值,是反映药物毒效应的上限指标。
第一节概念和意义,2023/5/23,7,二、LD50测定的意义及统计学原理,LD50值的作用及意义LD50是药物的重要特征性参数之一,是药物及一切与人类接触物质的安全标尺,用来判断药物对机体的毒性程度。
有助于计算其它与LD50相关的毒性参数。
急性毒性作用带(Zac);治疗指数(LD50/ED50);安全指数(LD5/ED5);可靠安全系数(LD1/ED1);,第一节概念和意义,1.急性毒作用带:
以药物的半数致死量与急性毒性最小有作用剂量(阈剂量)的比值来表示(是药物毒性上限指标与下限指标的比值)。
(1)急性毒作用带,急性毒作用带的大小反应了急性阈剂量与LD50距离的宽窄,其比值越大,说明从急性阈剂量到死亡剂量的距离越宽,药物引起死亡的危险性就越小;比值越小,则引起死亡的危险性就越大。
治疗指数(Therapeuticindex,TI)是指半数致死量与半数有效量之比值。
(2)治疗指数,TI值越大,表示该药物在发挥其治疗作用时所承担的风险(危险性)越小,一般认为TI大于3的药物才可能具有实用意义。
目前用于临床的药物,其TI值大多大于10。
安全指数(Safetyindex,SI)是指基本无害量与基本有效量之比值。
(2)安全指数,SI值可以说明药物的临床安全性,但该值往往难以精确计算出来,测定误差很大。
2023/5/23,11,可靠安全系数(Certainsafetyfactor,CSF)是指肯定无害量与肯定有效量之比值。
(2)可靠安全系数,CSF值可以说明药物的临床安全性,CSF越大,越安全。
2023/5/23,12,二、LD50测定的意义及统计学原理,LD50值的作用及意义LD50是药物的重要特征性参数之一,是药物及一切与人类接触物质的安全标尺,用来判断药物对机体的毒性程度。
有助于计算其它与LD50相关的毒性参数药物急性毒性分级依据,第一节概念和意义,2023/5/23,14,二、LD50测定的意义及统计学原理,LD50值的作用及意义LD50是药物的重要特征性参数之一,是药物及一切与人类接触物质的安全标尺,用来判断药物对机体的毒性程度。
有助于计算其它与LD50相关的毒性参数药物急性毒性分级依据为毒效应的靶器官确定和机制分析提供线索,第一节概念和意义,2023/5/23,15,二、LD50测定的意义及统计学原理,LD50值的作用及意义LD50是药物的重要特征性参数,是药物及一切与人类接触物质的安全标尺,用来判断药物对机体的毒性程度有助于计算其它与LD50相关的毒性参数药物急性毒性分级依据为毒效应的靶器官确定和机制分析提供线索作为药物生产过程中的质量监控检测措施,第一节概念和意义,2023/5/23,16,二、LD50测定的意义及统计学原理,对LD50及相关参数的评价LD50绝非判断药物急性毒性作用的惟一指标,仅是一个为描述某一药物在某个特殊的群体中以致死反应为指标而设计的一个统计学术语,是许多反映药物急性毒性的参数之一。
急性毒性作用具有比LD50更为深刻的内涵,剂量-效应(死亡)曲线的斜率在评价药物的急性毒性中比LD50更有价值甚至更为关键。
第一节概念和意义,2023/5/23,17,反应是指药物与机体接触后引起的生物学改变。
量反应属于计量资料,有强度和性质的差别,可以某种测量数值表示,如药物引起血中谷丙转氨酶的升高,这类效应称为量反应。
质反应属于计数资料,没有强度的差别,不能以具体的数值表示,而只能以“阴性或阳性”、“有或无”来表示,如死亡或存活、患病或未患病等。
质反应与量反应?
2023/5/23,18,致死性反应是一个质反应过程,累积反应的几率与剂量呈双曲线函数(S形曲线)关系。
对数剂量-反应曲线的斜率揭示了剂量变化与致死反应之间的关系,这种关系在安全性评价中有时比LD50更为重要,因为它可提供更为深入的内在毒性特征,有时还能引出毒性作用机制的线索。
累积反应的几率与剂量的对数及群体标准差呈线性关系。
例如,一个很陡的斜率(斜率大,线A)表明毒性反应性质较严重,毒性作用出现得迅速或吸收速率较大;反之较平坦的量效曲线(斜率小,线B)则反应了安全范围较大。
图14-1不同药物毒效应量-效关系比较,2023/5/23,20,图14-1不同药物毒效应量-效关系比较,依据斜率,常可将反应外推至低剂量范围,求算出LD1、LD10,甚至推测出不能观察到的效应水平。
2023/5/23,21,图14-1不同药物毒效应量-效关系比较,斜率的大小在比较同系列化合物时显得更为重要,两个药物可能有一个完全相同或相近的LD50值,但斜率却可以不同,因此,在相同的剂量范围内,表现出不同的毒理学特征具平行量-效曲线的两药尽管LD50不同,但却可能表现出相近的毒性作用机制、药动学特征和相似的预后无论是LD50还是斜率都不能绝对地揭示出某一特殊的毒性作用机制,2023/5/23,22,二、LD50测定的意义及统计学原理,对LD50及相关参数的评价TI值仅适用于比较治疗效应和致死效应的量-效曲线相互平行的药物,对于二种效应的量-效曲线斜率不同的药物,还应适当参考ED95与LD5及ED99与LD1之间的距离。
安全指数(SI)可靠安全系数(CSF),第一节概念和意义,2023/5/23,23,CSF与TI并不平行,在评价A、B两药时,从治疗指数来看A药(4)优于B药(2.6)。
但从可靠安全系数来看B药CSF(1.33)大于A药(0.7)。
图14-2致死量、有效量与药物安全性评价的关系,2023/5/23,24,二、LD50测定的意义及统计学原理,对LD50及相关参数的评价LD50的测定存在明显的不足动物消耗量大,获得的信息有限影响LD50值的因素较多,比如试验动物的种类、品系、年龄、性别、健康状况等,因而不同实验室之间所得的数值也很难相似从安全性评价角度来讲,需要的不是精确的LD50值,而是更多的毒性信息,第一节概念和意义,2023/5/23,25,(三)LD50值计算的统计学原理,致死性反应是一种质反应过程,其量-效关系应符合以下规律,1.剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系,在一个群体中特别敏感的动物总是比较少的,特别不敏感的动物也较少,而多数动物处于中等敏感状态,即符合“两头少,中间多”的规律。
如以剂量为横坐标,死亡率为纵坐标,则可绘出一个偏态曲线。
小剂量下毒效应差别较明显,在大剂量一端,毒效应差别随剂量的增加而减小,形成拖尾现象。
剂量-死亡率的偏态分布曲线,第一节概念和意义,2023/5/23,26,(三)LD50值计算的统计学原理,致死性反应是一种质反应过程,其量-效关系应符合以下规律,1.剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系,将横坐标改为对数剂量,亦即将横坐标改为等比数列,则就由偏态曲线转化为对称的常态曲线。
第一节概念和意义,2023/5/23,27,(三)LD50值计算的统计学原理,致死性反应是一种质反应过程,其量一效关系应符合以下规律:
1.剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系2.剂量对数值与累积死亡率之间呈S形曲线关系,由常态分布曲线累积而来,当剂量被转换为对数值(X)后,反应几率(P)与X遵循常态分布。
该S形曲线是向心对称的,对称中心的纵坐标为50%死亡率,横坐标为1ogLD50。
曲线两端平坦,中间较斜。
当剂量有变化时LD50附近的死亡率变化很大,两端(LD5或LD95附近)则变化很小。
以LD50来表示致死性毒效应比LD5、LD95更为灵敏精确;LD50的误差远小于LD5或LD95;曲线中段死亡率在50%附近的点比5%或95%附近的点更为重要,更能代表大多数动物的反应水平,提示我们在设计剂量分组时必须格外重视引起50%死亡效应的剂量组及其邻近的剂量组。
由常态分布曲线累积而来,当剂量被转换为对数值(X)后,反应几率(P)与X遵循常态分布。
该S形曲线是向心对称的,对称中心的纵坐标为50%死亡率,横坐标为1ogLD50。
曲线两端平坦,中间较斜。
当剂量有变化时LD50附近的死亡率变化很大,两端(LD5或LD95附近)则变化很小。
Bliss根据常态累积曲线的特点列出了死亡率各点的“权重系数”作为权衡各点重要性的定量数值。
由常态分布曲线累积而来,当剂量被转换为对数值(X)后,反应几率(P)与X遵循常态分布。
该S形曲线是向心对称的,对称中心的纵坐标为50%死亡率,横坐标为1ogLD50。
曲线两端平坦,中间较斜。
当剂量有变化时LD50附近的死亡率变化很大,两端(LD5或LD95附近)则变化很小。
Bliss根据常态累积曲线的特点列出了死亡率各点的“权重系数”作为权衡各点重要性的定量数值。
从S形曲线来看,两端只能趋近而不能达到0%或100%,实际工作中因组内动物数(n)有限,当遇到0/10或10/10的死亡率时一般均采用以下近似计算方法:
由常态分布曲线累积而来,当剂量被转换为对数值(X)后,反应几率(P)与X遵循常态分布。
该S形曲线是向心对称的,对称中心的纵坐标为50%死亡率,横坐标为1ogLD50。
曲线两端平坦,中间较斜。
当剂量有变化时LD50附近的死亡率变化很大,两端(LD5或LD95附近)则变化很小。
Bliss根据常态累积曲线的特点列出了死亡率各点的“权重系数”作为权衡各点重要性的定量数值。
从S形曲线来看,两端只能趋近而不能达到0%或100%,实际工作中因组内动物数(n)有限,当遇到0/10或10/10的死亡率时一般均采用以下近似计算方法:
A.将n/n计算为(n-0.25)/nB.0/n的计算为0.25/n,2023/5/23,33,(三)LD50值计算的统计学原理,致死性反应是一种质反应过程,其量一效关系应符合以下规律:
1.剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系,2.剂量对数值与累积死亡率之间呈S形曲线关系,3.剂量对数值与几率单位之间呈直线关系,为通过数学的方法更加准确地计算LD50等重要的毒理学参数并得出曲线的斜率,有必要将S形曲线转换为直线。
当把纵坐标的标识单位反应率改为反应频率时,对称S形曲线转换为正态分布曲线。
在该分布曲线下,如把使一半受试个体出现反应的剂量作为中位数剂量,并以此为标准划分若干个标准差,则在其两侧1个、2个或3个标准差范围内分别包括了受试总体的68.3%、95.5%和99.7%。
将各标准差的数值均加上5即为概率单位。
概率单位与反应率之间的对应关系反应率(%)概率单位0.122.3315.9450.0584.1697.7799.98,2023/5/23,35,非对称S形曲线转换为直线,需要分两步进行:
1.把横坐标的剂量单位换算为相应的对数;2.把纵坐标的反应率改为概率单位(几率单位),即可得到一条直线。
2023/5/23,36,三、非致死性毒性反应及其转归,非致死性(毒性)反应有些实验动物虽可幸免于致死性毒效应,但由于药物可对机体的生理、生化、免疫、神经或其它系统产生损害,使正常生理功能发生严重紊乱,因而出现上述系统不可逆的损伤。
非致死性有害反应与致死性反应仅仅是程度上的差异,都是用药过程中不希望出现的。
非致死性反应的转归问题主要涉及到反应是否可逆。
可逆反应是指当药物在体内消除后,反应也亦随之消失,不残留任何效应。
反应是否可逆主要取决于:
毒性作用涉及的器官与系统药物的内在毒性用药时间的长短在确定的时间范围内,药物在体内的量实验动物的年龄(月龄)和健康状况,再生能力强的组织和器官(如肝脏)的损伤通常较再生能力弱的组织和器官(如神经组织)的损伤易于逆转,肝肾功能不全或尚未发育完善(如幼年动物)的个体易形成不可逆性损伤。
在药物安全性评价中,了解毒性作用是否可逆是非常重要的,如在实验动物中观察到不可逆反应,则应注意这一不可逆反应外推至人时是否存在。
2023/5/23,39,第二节,试验设计原则及方法,2023/5/23,40,一、一般程序和基本要求,一般程序将药物通过经口途径(灌胃)或其他预期临床用药途径给予数组实验动物,必要时可增加一个溶媒对照组,在特定时间间隔内观察实验动物的行为表现、中毒症状及死亡情况。
实验条件及方法必须规范化,试验设计原则及方法,2023/5/23,41,一、一般程序和基本要求,基本要求两种实验动物小动物LD50、最大耐受量试验大动物单次给药的近似致死量和最大耐受量两种给药途径其中一种必须与临床用药途径相同试验周期7-14天LD50计算方法bliss法,试验设计原则及方法,表14-3各国对急性毒性试验的基本要求,试验设计原则及方法,2023/5/23,43,二、实验动物,动物选择的主要原则:
尽量选择急性毒性反应与人近似的动物;易于饲养管理、试验操作方便的动物;繁殖生育力较强,数量较大能够保障供应;价格较低,易于获得的动物,试验设计原则及方法,2023/5/23,44,二、实验动物,在基础性研究工作中按科研课题的具体要求选择,在法规性毒理学评价工作中,必须按照其规范要求进行。
无论使用何种动物都必须注明动物的来源、品系、年龄、体重、性别、饲养条件以及动物生产合格证书。
如系无特殊病原体动物也应在报告中注明。
试验设计原则及方法,2023/5/23,45,二、实验动物,种类小鼠、大鼠、犬、猴、家兔(经口给药不用)下列情况考虑选用非啮齿类动物大、小鼠LD50差别明显药物的生物转化形式和速率在啮齿类与非啮齿类之间存在明显差异为了得到明确的毒效表现,初步了解药物的特性后,在条件许可的情况下可考虑选用其他敏感动物,试验设计原则及方法,2023/5/23,46,二、实验动物,种类健康状况体重与年龄,试验设计原则及方法,同一批实验中,动物的年龄、体重应尽可能一致急性毒性试验原则上选用年轻成年动物,啮齿类动物的年龄一般为79周龄,非啮齿类动物起始为68月龄。
同一批试验中,动物的初始体重变异要求不超过平均体重的20%。
表14-4常用实验动物的生活年限及体重选择,2023/5/23,48,二、实验动物,种类健康状况体重与年龄性别,试验设计原则及方法,急性毒性试验中应考虑雌雄动物数目相等但在试验中如发现某性别动物的死亡率明显高于另一性别时,则最好对该性别的LD50另外计算,或考虑选用敏感性别的动物重新进行急性毒性试验。
2023/5/23,49,二、实验动物,种类健康状况体重与年龄性别动物分组方法,试验设计原则及方法,动物应随机分配至各剂量组。
随机分组可使动物形成一个均匀的整体,并可减少因个体差异而造成的误差。
体重或健康状况不符合要求的动物应在随机分组前剔除。
2023/5/23,50,二、实验动物,种类健康状况体重与年龄性别动物分组方法动物给药前禁食处理,试验设计原则及方法,经口途径染毒,在试验前应作禁食处理。
大鼠主要在夜间进食,要求染毒前应隔夜禁食。
小鼠由于其消化吸收和代谢速度较快,可隔夜禁食也可禁食4小时以上。
大动物常前一天正常给食,染毒前不喂食即可。
禁食期间均正常给水。
染毒2小时后提供饲料。
经口多次染毒,可不禁食。
2023/5/23,51,三、剂量水平的选择,剂量水平的选择以测定LD50及剂量-反应曲线的斜率为目的(10%-50%-90%);4上以上剂量,至少有3个落在10%-90%之间;做预试验来摸索剂量通过文献检索,为已知化学类别的药物确定预期毒性中值对全新结构的药物或中草药复方,可先通过小批量动物摸索,找出Dmin和Dmax,2023/5/23,52,为已知化学类别的药物确定预期毒性中值,剂量水平的选择,对于己了解化学结构的药物,在确定其所属化学类别及其所含的特殊基团的基础上,查阅有关文献,找出与药物结构近似或有共性基团的药物的毒性资料;其次最好能了解药物的理化性质,最后综合考虑这两方面的资料,选择与药物的化学结构和理化性质最为接近的己知药物的LD50作为药物的预期毒性中值。
2023/5/23,53,为已知化学类别的药物确定预期毒性中值,剂量水平的选择,确定预期毒性中值(LD50)后,以此值为中间剂量,再以该中间剂量值为基准,按一定的组间距上下各推二个剂量,作为预试验的剂量分组。
预试时,组间距可稍大些,i值可取0.6,相邻剂量比为1:
4。
如果估计药物的致死剂量范围较窄,组间距可适当缩小,i值取0.2,相邻剂量比为1:
1.6。
组间距i值,剂量的对数值等差分布,剂量等比分布,通过预试找出药物使10%-90%实验动物死亡剂量的大致范围,再据此确定正式试验的具体分组方案,此时可按下式求算组间距(i值)。
或,剂量水平的选择,2023/5/23,55,对全新结构的药物或中草药复方,剂量水平的选择,先通过小批量动物的摸索,找出0%及100%估计致死量(即Dmin和Dmax),再求出i值。
(1)用10倍稀释的药物浓度系列,用少量动物(每组2-3只),找出大致死亡范围。
剂量水平的选择,剂量死亡数/动物数5mg/kg0/250mg/kg1/2500mg/kg2/25000mg/kg2/2上述结果提示,大致死亡范围为50mg/kg-500mg/kg。
(1)先用10倍稀释的药物浓度系列,用少量动物(每组2-3只),找出大致死亡范围。
剂量水平的选择,
(1)先用10倍稀释的药物浓度系列,用少量动物(每组2-3只),找出大致死亡范围。
(2)再用1、2、4、8等2倍稀释的药物浓度每组4只动物实验,找出Dmin和Dmax。
剂量死亡数/动物数50mg/kg0/4100mg/kg2/4200mg/kg2/4400mg/kg4/4800mg/kg4/4,剂量水平的选择,
(2)再用1、2、4、8等2倍稀释的药物浓度每组4只动物实验,找出Dmin和Dmax。
当出现4/4死亡时如其前一组为3/4死亡,则取4/4组的剂量为Dmax,如前一组为2/4或1/4死亡(如本例为2/4),考虑到4/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率低于70%,为慎重起见,可将4/4组的剂量乘以2作为Dmax;当出现0/4死亡时,如其后一组的死亡率为1/4,则取0/4组的剂量为Dmin,如后一组死亡率大于1/4,考虑到0/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率高于70%,则将0/4组的剂量除以2,作为Dmin。
剂量水平的选择,剂量死亡数/动物数50mg/kg0/4*100mg/kg2/4200mg/kg2/4400mg/kg4/4*800mg/kg4/4,Dmax:
出现4/4死亡时,前一组为2/4,考虑到4/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率低于70%,可将4/4组的剂量乘以2。
Dmax=40070%2=560(mg/kg)Dmin:
出现0/4死亡时,后一组死亡率大于1/4,则考虑到0/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率高于70%,将0/4组的剂量除以2。
Dmin=5070%235(mg/kg),剂量水平的选择,剂量死亡数/动物数50mg/kg0/4*100mg/kg2/4200mg/kg2/4400mg/kg4/4*800mg/kg4/4,陈奇:
中药药理研究方法学第2版Dmax:
当出现4/4死亡时,如前一组死亡率为2/4时Dmax=4/4死亡剂量1.4()=4001.4=560(mg/kg)Dmin:
当出现0/4死亡时,如后一组死亡率大于1/4Dmin=0/4死亡剂量1.4()=501.435(mg/kg),本法用较少的动物和药物,寻找出正式实验时最高死亡率不低于70%,最低死亡率不高于30%的剂量范围。
在确定了Dmax和Dmin以后,可求得组间距(i值):
以Dmin的对数为起点,向上推出n组动物的各组剂量的对数值,求出反对数即可求得各组的剂量。
剂量水平的选择,
(1)先用10倍稀释的药物浓度系列,用少量动物(每组2-3只),找出大致死亡范围。
(2)再用1、2、4、8等2倍稀释的药物浓度每组4只动物实验,找出Dmin和Dmax。
2023/5/23,62,四、剂量组数及动物数,LD50测定中剂量组数的设计,除符合统计学要求外,还应根据预试验所提供的药物的毒性情况而定。
一般而言,在实际工作中设45个剂量组,剂距以0.650.85为宜。
小鼠每组10只(雌雄各半),大鼠不应少于68只。
2023/5/23,63,五、剂型与给药,应写明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。
供试药品应能溶于或混悬于适当的溶媒,如果溶媒的毒性情况是未知的,则应设立一个溶媒对照组,溶媒对照组的给药容量应与最高剂量组相等。
对所用的溶媒及助溶剂的种类、规格、批号及来源等都必须有详细的记录,以备分析和审核。
2023/5/23,64,五、剂型与给药,给药途径要用两种,其中应包括推荐临床研究的给药途径。
溶于水的药物应当测定静脉给药途径的急性毒性,口服药物应灌胃给药。
药物可以等体积(各剂量组的药物浓度不同,而给药体积相同)或等浓度(药物浓度相同,而各剂量组的给药体积不同)给药,但必须注意上述两种方式给药所观察到的毒性效应可能是不尽相同的。
2023/5/23,65,五、剂型与给药,给药的体积,啮齿类动物口服给药的最大的体积,对非水溶液而言以不超过10ml/kg为宜,水溶液或混悬液一般不超过20ml/kg。
如果剂量较大而不便于一次给药,可以分成相等的容量,每隔68小时给药,但必须在第一次给药后的24小时内完成。
口服给药应禁食;静注给药应注意药液的pH值、温度、渗透压、注射速度等可能影响毒效应的各种因素。
表14-6急性毒性试验常用动物单次给药的常用容量和最大容量,2023/5/23,67,六、试验时限与量限,急性毒性试验的观察时间取决于症状出现的时间、毒性强弱、致死速度、恢复速率以及药物本身的代谢特征等。
我国新药审批办法规定:
急性毒性试验必须观察714天,但一般不必超过2周(14天)。
在表示药物的LD50时最好同时注明观察时间,这样在毒性比较时,才会有共同的基础。
从量上
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- 14 急性 毒性 试验