干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响.docx
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干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响
本科学生科技论文(设计)
姓名:
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学号:
%%%%%%
学院:
生命科学学院
专业:
应用生物教育
班级:
11级A班
名称:
云南师范大学教务处编印
干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响
&&&&&&&&
(云南师范大学生命科学学院应用生物教育11A班)
摘要:
通过对小麦幼苗进行3~7d干旱处理(实验组),对照组为正常生长的小麦幼苗,分别测定小麦幼苗叶片的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性糖、过氧化氢、抗氧化酶(POD、PPO)、谷胱甘肽(GSH)/抗坏血酸(ASA)共6个生理生化指标的变化。
另外,增加一个种子发芽率的测定实验,采用吸胀的玉米种子作为实验材料。
实验结果表明:
在干旱胁迫下,除发芽率下降外,小麦幼苗的脯氨酸、MDA、可溶性糖、过氧化氢、抗氧化酶(PPO、POD)、GSH、ASA的含量都较正常生长条件下小麦幼苗的含量高。
关键词:
小麦幼苗;干旱胁迫;生理生化指标。
引言:
粮食短缺与品质改良已成为这个世纪各国亟待和亟需解决的问题。
我国是一个农业大国,同时也是一个人口大国,其形势更加严峻,任务更加坚决。
实现农业可持续发展的重要性显而易见。
在中国农业可持续发展中,提高农业资源转化率是核心问题,而其中的水资源又是关键[1]。
随着全球气候的变化和生态环境的破坏,水资源的短缺愈来愈成为人类很严重的生态问题。
我国的水资源不但总量不足,而且时空分布也不均衡。
再加上近年来的持续干旱和对水资源的过度开发利用,连同愈来愈严重的水体污染,不但使工、农业用水和生活用水矛盾日益突出,甚至已酿成如黄河断流、河川断流、海水入侵、地面沉降等生态灾难,已成为农业可持续发展的最大障碍。
为此,提高作物抗旱性和水分利用效率,选育抗旱高产品种并进行生物技术的开发利用研究,是实施农业可持续发展的关键步骤。
小麦是我国第二大主要作物,其产量与品质直接关系到国计民生。
为了解决小麦的生产产量等安全问题,就必须提高小麦抗逆境胁迫,选育优良品种。
干旱胁迫属于逆境胁迫的一种,对小麦的生长发育有着重要的影响。
干旱胁迫对小麦的生理生化会产生影响,进而影响小麦的生长发育,影响小麦的产量和品质。
本实验在现有的研究基础上,
以小麦幼苗为试验材料,通过人工控制水分模拟干旱胁迫,对小麦在干旱和正常条件下的生理生化指标进行测定和分析,探讨这些因子在干旱胁迫时发生变化的规律,以期为小麦抗旱性育种提供参考。
1材料与方法
1.1材料及处理
小麦及玉米种子购回后,用0.1%HgCl2消毒10min,再用蒸馏水漂洗干净,并用蒸馏水于26℃下吸涨12h。
将小麦种子播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘(24cm×16cm)培养基中生长,选取长势一致的小麦幼苗做3~7天干旱处理(去除较矮或较高的小麦幼苗)。
玉米种子只需做12h的吸胀处理即可(种子发芽率的测定为本实验增加的内容,对测定生理生化指标无影响,本实验采用玉米种子做种子发芽率的测定)。
1.2试验设计
试验设定实验组(干旱处理)和对照组(正常生长),对正常生长和干旱处理3~7d的小麦幼苗分别采样进行各项生理生化指标的测定,并加以对照分析。
吸胀的玉米种子用作种子发芽率的测定,进而观测种子发芽率,对种子萌发进一步研究。
1.3试验方法[2]
1.31种子发芽率的测定
各取50~80粒吸胀的玉米种子(本实验取70粒)→沿胚的中心线切成两半(严格区分两个半粒),进行下列实验:
其中70个半粒进行TTC染色(30℃水浴20min);另70个半粒进行曙红染色(室温染色10min)→洗净后观察,根据两种方法的染色情况,分别计算发芽率。
1.32脯氨酸(pro)含量的测定
Pro的提取:
分别取0.1g实验组和对照组的小麦幼苗→加入3mL3%磺基水杨酸(SSA)和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。
Pro含量的测定:
上清液各2mL→分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min(若没沉淀可略此步骤)→分别测定A520。
将测得的结果用公式生长小麦幼苗叶片的脯氨酸含量。
A520V总⨯V显⨯V用计算出正常和干旱Procontent=ε⨯L⨯W
1.32丙二醛(MDA)含量的测定
MDA提取:
分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL10%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2mL10%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。
MDA含量测定:
分别取上清液各1mL→加入0.6%TBA(用10%TCA配制)3mL→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心5min(视沉淀有无)→分别测定OD450和OD532。
计算:
将测得的结果带入以下方程组中计算
OD450=C1×85.4
OD532=C1×7.4﹢155000×C2
式中,C1为可溶性糖的浓度;C2为MDA的浓度。
1.33H2O2含量的测定
H2O2提取:
分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL0.3%三氯乙酸(TCA)和少许石英砂→充分研磨→用2mLTCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。
测定:
分别取上清液各3.5ml→加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]0.2mL→摇匀→OD410
将测得的OD410值带入下列公式
H2O2content=A410V总⨯V显⨯ε⨯L⨯WV用(mmol.g-1FW)计算出H2O2酶的含量。
1.33抗氧化酶的测定
1、抗氧化酶的提取:
分别取0.1g实验材料→加入少许石英砂和3ml提取液(50mmol/LPBS,pH6.0,内含0.1mmol/LEDTA,1%PVP)→充分研磨→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积→用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。
2、POD测定:
取POD反应混合液(10mmol/L愈创木酚,5mmol/LH2O2,用PBS溶解)2.95ml,加入酶液50ml(空白调零用PBS取代),立即记时,摇匀,读出反应3min时的A470。
3、PPO测定:
取PPO反应混合液(20mmol/L邻苯二酚,用PBS溶解)2.9ml,加入酶液0.1ml(空白调零用PBS取代),立即记时,摇匀,读出反应3min时的A410。
以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位(U),将测得的A470和A410数据带入公式A470V总⨯V显⨯V用(umol.g-1FW)PODactivities=ε⨯W⨯t
A410V总⨯V用(U.g-1FW)PPOactivies=0.01⨯W⨯t
计算出PPO和POD的值
1.34GSH的测定
GSH的提取:
分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸(TCA)和少许石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。
测定:
上清液各1mL(空白用5%三氯乙酸代替)→分别加入2mL0.1MPBS(pH=7.7)→1mL2mMDTNB→25℃5min→测定A412
将测得的A412值带入公式GSHcontent=A412V总⨯V显⨯ε⨯L⨯WV用(umol.g-1FW)将GSH的值计算出来
1.35ASA的测定
ASA的提取:
分别取0.2g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸(TCA)和少许石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。
测定:
上清液各0.8mL(空白用5%TCA代替)→分别加入0.8mL0.15MNaH2PO4(pH=7.4)和蒸馏水→摇匀→分别加入0.8mL5%TCA、44%磷酸和4%联吡啶→摇匀→加入3%FeCl30.8mL→37℃15min→测定A525
将测得的A525值带入公式
ASAcontent=A525⨯V显⨯V总(umol.g-1FW)将ASA的值计算出来ε⨯L⨯WV用
2.结果与分析
2.1玉米种子的发芽率
从下表可以看出两种方法所测得的玉米种子发芽率结果不同,TTC染色法测得的发芽率为90.00%,而曙红染色法测得的发芽率为88.57%。
产生此现象可能是由于在做试验时人为地区分被染色的与未被染色的玉米时存在误差造成的。
结果表明,玉米的发芽率相当高。
表1不同染色法下玉米种子的发芽率
2.2脯氨酸(pro)含量的测定
脯氨酸是主要的渗透调节物质。
许多研究表明,当遭遇外界水分胁迫时,植物体内积累大量游离脯氨酸,有助于植物细胞或组织的持水能力[3]。
下表为实验所测得的数据。
表2小麦幼苗脯氨酸(pro)含量的测定表
到的结果一致[4]。
图1
2.3丙二醛(MDA)含量的测定
可溶性糖及MDA的浓度:
干早胁迫下植物的自由基伤害学说己被支持,自由基进行细胞膜脂过氧化伤害的最终产物之一是丙二醛(MDA),至今,MDA的含量仍作为反映细胞膜脂过氧化伤害水平的重要指标[5]。
胚芽鞘(叶片)内的可溶性糖含量也是干旱胁迫下生理生化的重要指标。
下表为实验所测得的数据。
表3小麦幼苗可溶性糖浓度及MDA浓度的测定表
如图2所示,干旱胁迫下生长的小麦胚芽鞘(叶片)内的可溶性糖浓度远远高于正常生长的小麦。
如图3所示,干旱胁迫下生长的小麦胚芽鞘(叶片)内的MDA浓度高于正常生长的小麦MDA浓度。
说明正常情况下小麦胚芽鞘(叶片)内可溶性糖可MDA含量较低,当在干旱胁迫时小麦胚芽鞘(叶片)内的含量可以增加数十倍。
图2图3
2.4H2O2含量的测定
植物组织体内积累的H2O2是由一些氧化酶(主要是超氧化物歧化酶SOD,其它如肌酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、乙二醇氧化酶)催化超氧阴离子发生氧化还原反应而形成。
下表为实验所测得的数据。
表4小麦幼苗H2O2的测定表
响。
图42.5抗氧化酶的测定
2.51POD含量
抗氧化酶广泛存在于植物体中在存在条件下,过氧化物酶使愈创木酚氧化,生产茶褐色物质。
PPO属于抗氧化酶的一种,实验所测的数据见下表。
表5小麦幼苗POD的测定表
如图5所示,测定到A470的值计算得到的POD含量,实验组远远高于对照组。
说明小麦幼苗在干旱胁迫下具有一定的抗氧化能力。
2.52PPO含量
植物的抗氧化系统由抗氧化酶与抗氧化剂组成,PPO也是抗氧化酶的一种。
实验所测的数据见下表。
表6小麦幼苗POD的测定表
如图6所示,实验组的PPO含量高于对照组。
说明干旱胁迫使植株体内的抗氧化酶含量增加了,增强植株对干旱胁迫的适应性。
图5图62.6GSH含量
GSH存在于植物体几乎每一个细胞中。
谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能,并具有抗氧化作用。
GSH是研究植株抗氧化性的重要指标,在干旱胁迫中也极其重要。
本实验所测结果如下表。
表7小麦幼苗GSH含量测电表
如图7所示,实验组的GSH含量远远高于正常生长的小麦幼苗的GSH含量。
说明,在干旱胁迫下,植株为适应干旱环境,而使GSA含量陡增。
2.7ASA含量
抗坏血酸是植物细胞重要的抗氧化剂,通过清除体内的自由基和活性氧(H2O2)等,使机体免受氧化损伤。
在干旱环境中,ASA含量会有一定的变化。
实验所测数据如下表所示。
表8小麦幼苗ASA含量测电表
如图8所示,实验组的ASA含量远远高于正常生长的小麦幼苗的ASA含量。
说明,在干旱胁迫下植株为了使机体免受氧化损伤,而使植物体中的ASA含量增加,增强抗氧化能力。
图7图83结论与讨论
细胞膜是细胞与环境物质进行交换的主要通道,对维持细胞的微环境和正常代谢起重要的作用。
植物在遭受到干旱胁迫时,细胞中生物活性氧的积累是造成细胞伤害乃至死亡的主要原因,而细胞中清除活性氧的保护酶系统的存在和活性增强,是细胞免于伤害或抗性增强的主要原因之一。
细胞内的保护酶系统主要有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等。
酶活性越高,消除自由基的能力
也越强,植物的抗逆性也越强[6]。
本次试验研究发现,通过干旱处理后,植株体内脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性糖、过氧化氢、抗氧化酶(POD、PPO)、谷胱甘肽(GSH)/抗坏血酸(ASA)等的含量较正常生长的都高。
脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质。
当受到干旱胁迫时,植物体内常积累大量脯氨酸,使植物保持一定的含水量和膨压,以维持细胞正常的功能[7]。
大量研究表明,干旱胁迫下植物组织内脯氨酸含量有普遍增高的现象[8],有些研究表明脯氨酸累积的高低可以作为植物抗逆性筛选的指标[9]。
本实验所得的实验组的Pro含量比正常生长的要高,由此表明,逆境下,特别是干旱胁迫下,脯氨酸含量的积累可能是植物受伤害的结果,是为了对干旱胁迫的适应。
叶片中的丙二醛(MDA)含量是表征细胞膜脂质过氧化程度的有效标志,丙二醛含量增加说明膜脂质过氧化作用增强。
但是如果产生较多的膜脂过氧化产物MDA,并引起膜脂分子结构的改变,影响膜的组成、结构和流动性,破坏膜的完整性与稳定性,最终会导致细胞死亡[10]。
另外,胁迫强度增加则可溶性糖积累,可溶性糖具备了渗透调节物质所需的所有条件,即溶解性高、分子量小、在生理环境下不带电荷、生成必须是迅速的、对代谢活动和酶活性影响小。
实验组的MDA含量高于对照组,说明植物体通过增加MDA的含量来增强抗氧化作用。
实验中干旱组的可溶性糖含量比正常生长的高,说明植株通过可溶性糖的含量来渗透调节适应干旱。
植物的抗氧化系统由抗氧化酶与抗氧化剂组成。
干旱胁迫下,植物保护酶体系的主要酶类过氧化物酶(POD、PPO)活性表现出上升的变化趋势。
耐旱植物在适度的干旱条件下酶活性通常增高,清除酶活性氧的能力增强。
干旱敏感型植物受旱时,活性通常降低。
另外,GSH及ASA也是植株抗氧化系统的一部分,植株在干旱(逆境)胁迫下,通过增加其含量,从而使抗氧化能力增加。
试验结果表明,小麦幼苗在干旱胁迫下,POD、PPO、GSH、ASA的含量,实验组都比对照组的高,而且还高出许多倍,继而增加抗氧化能力。
综合上述干旱胁迫下小麦幼苗的各种生理生化指标得出,在干旱胁迫下,小麦幼苗为适应干旱环境,从而增加体内的Pro、丙二醛(MDA)、可溶性糖、过氧化氢、抗氧化酶(POD、PPO)等的含量,继而增强其抗干旱能力。
从小麦对干旱响应的生理生化反应顺序与时程来看,存在一个适应,容纳、伤害、修复、补偿和死亡的自我调节过程,所以这里应该存在一个抗旱性阀值问题。
无疑,小麦抗旱性与核酸、蛋白质代谢的相关性研究对于揭示这些机制并从基因表达调控水平上认识其本质和定向生物技术育种都有着重要意义[11]。
对小麦干旱胁迫的生理生化指标的研究,为小麦在进化方面提供了有意义的适应信息,同时也为小麦抗旱性的生物技术育种提供了参考。
小麦的抗旱研究,为解决粮食品质改良、粮食短缺等问题带来了福音,为我国农业可持续发展奠定了基础。
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