GenomeLabGeXP多重基因表达系统.docx
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GenomeLabGeXP多重基因表达系统
GenomeLab™GeXP多重基因表达系统
基因测序标准实验操作流程
5、DTCS反应
结果分析
(一)样本要求:
1、新鲜组织或穿刺样本:
至少0.5cm3,要置于-20℃保存。
2、石蜡切片:
厚度5-10µm的切片8-10张。
面积至少1cm2,如果面积小,要增加切片数量。
要置于4℃保存
3、胸腹水:
取5-50ml不等,一般有多少取多少。
可置于4℃保存一天。
样本选择注意事项:
1.优先选择新鲜组织。
2.石蜡切片样本中的核酸会断裂及降解,因此如果采用石蜡切片样本,PCR可能会有未扩增的情况,为正常现象。
3.肿瘤晚期患者,无法进行手术,可采用胸腹水样本。
(二)样本前处理:
1.新鲜组织及穿刺样本:
将组织样本或穿刺样本剪碎,越小越好,放入1.5或2ml的离心管中。
或将研磨机将组织研磨成粉末状。
2.石蜡切片:
用刀片将石蜡切片上的组织刮入1.5ml离心管中,加入1ml二甲苯,震荡、混匀,离心,倒掉,重复2-3次,尽可能去除组织中混有石蜡。
再加入1ml100%的乙醇,震荡、混匀、倒掉,重复2-3次,尽可能去除二甲苯。
3.胸腹水:
去除胸腹水中的大块组织(抽取胸腹水时碰到的器官表皮粘膜等),将胸腹水倒入10ml或50ml的离心管中,1000-2000rmp/min,离心12min,倒掉上清。
加入2-5ml生理盐水,轻微震荡混匀,清洗沉淀,再次离心,倒掉上清。
一、DNA抽提
A:
新鲜组织、穿刺样本、胸腹水(天根生化试剂盒):
1.使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积参照瓶上的标签,在标签上打上“√”
2.在处理好的组织及胸腹水中加入20μlProteinaseK,混匀。
3.放入56℃水浴锅,直至组织溶解。
水浴过程中,每过10-30min,将离心管上下颠倒,观察溶解情况,一般组织需要过夜。
胸腹水2-3h即可。
4.加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10min,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
注意:
加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀,一般70℃放置时会消失,不会影响后续实验。
如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。
5.加人200μl无水乙醇,充分振荡混匀15sec,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。
7.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
8.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
9.重复操作步骤7。
10.将吸附柱CB3放回收集管中,12,000rpm离心2min,倒掉废液。
将吸附柱CB3置于室温放置5-10分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意:
这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
11.将吸附柱CB3转入一个干净的1.5ml离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl去离子水,室温放置3min,12,000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中。
B石蜡切片样本DNA抽提:
(QiagenFFPEDNA提取试剂盒)
1.使用前检查ATL,AL是否有结晶,如有,70℃放置,使其消失。
检查AW1,AW2是否加入相应的无水乙醇,加入体积参照瓶上的标签。
并在标签上打上“√”
2.在处理过的石蜡切片样本中加入180μlATL,使样本悬浮。
加入20μl蛋白酶K,震荡、混匀。
3.56℃水浴一小时,直到样本溶解。
每过10-15min,上下颠倒离心管,观察样本溶解情况。
可根据样本溶解情况,适当增加水浴时间。
4.90℃水浴一小时。
5.简短离心,加入200μlAL,震荡充分混匀。
加入200μl无水乙醇,震荡充分混匀。
6.简短离心,把产物全部加入柱子(柱子放在2ml管子上),8000rpm离心1min。
倒掉离心管中的液体,将柱子重新放回离心管。
7.加入500μlAW1,8000rpm离心1min,倒掉离心管中的液体,将柱子重新放回离心管。
8.加入500μlAW2,8000rpm离心1min,倒掉离心管中的液体,将柱子重新放回离心管。
9.14000rpm,离心3min,倒掉离心管中的液体。
将柱子放到新的离心管上。
10.加入30-50μl的去离子水,对准柱子中心加。
室温放置1min。
11.14000rpm,离心1min,收集离心管管底的液体。
12.测浓度和纯度。
DNA及割胶回收产物浓度测定
1.取1-2µl去离子水,校零。
2.用擦镜纸将去离子水去除,再检测去离子水的浓度,浓度应在+-0.2ng/µl之间。
3.如果超出此范围,重新校零。
4.取1-2µl样本,检测浓度。
DNA及割胶回收产物质量情况:
OD值260/280:
1.7-1.9,合格;1.5-2.0算是正常,只是杂质偏多;超过此范围,质量偏差,后续实验成功率低。
DNA浓度一般要超过10ng/µl。
引物
1、引物命名
请将引物按照:
基因+位点+方向命名。
如EGFR19F,EGFR19R。
2、引物的稀释及保存
每管引物1OD,干粉引物-20℃保存,可保存1-2年。
将干粉引物离心30s,加入去离子水稀释到100µmol/µl,取出10µl,加90µl去离子水,稀释到10µmol/µl。
100µmol/µl的引物-20℃保存,可保存0.5-1年。
10mol/µl的引物4℃保存,作为工作引物,可保存1-3个月。
注意:
带有引物合成公司logo的离心管中的引物,无任何东西的为干粉,有液体的为100µmol/µl的引物,带有自己命名引物的离心管中的引物为10µmol/µl的引物。
3、引物信息
基因引物
退火温度
产物长度
测序方向
加样量
备注
EGFR19
55
242bp
F
10ng
EGFR21
58
442bp
F
15ng
EGFR18
58
406bp
F
10ng
EGFR20
58
265bp
R
10ng
石蜡切片样本不做此位点
Kras1213
50
213bp
F
10ng
Kras61
50
426bp
F
15ng
Ckit9
57
259bp
F
10ng
ckit11
50
337bp
F
10ng
二、PCR
1、PCR反应体系
试剂
体积
备注
引物F(10µmol/µl)
1µl
引物R(10µmol/µl)
1µl
DNA
2µl
当DNA浓度太小时,可适当增加DNA体积,同时减少去离子水体积
去离子水
8.5µl
PCRmastermix
12.5µl
总体积
25µl
2、PCR反应程序
温度
时间
循环数
94℃
3min
94℃
30s
35cycle
X℃
30s
72℃
30s
72℃
5min
4-16℃
Holdon
注意:
尽量避免PCRmastermix反复冻融。
三、电泳
A、琼脂糖胶配置:
1.5%--2%
1.称量1.5g琼脂糖放入250ml的三角瓶中。
2.在100ml的量筒中加入98ml的去离子水,再加2ml50X的TAE,混匀,加入三角瓶中。
3.以上两种物质混匀,放入微波炉中,高火1min。
注意:
在微波过程中要时刻注意三角瓶情况,一旦液体沸腾,便关掉微波炉。
4.液体沸腾后立即取出三角瓶,震荡、混匀,继续放入微波炉,高火1min。
5.重复2-3次。
6.查看琼脂糖是否完全溶解、透明,室温降温。
待三角瓶温度降至60-70℃(手摸上去可以忍受的温度)。
7.加入核酸染料1µ,震荡、混匀直到染料已完全溶解在液体中。
8.插梳子:
根据要配胶的体积将合适的梳子插在配胶槽中。
9.缓慢倒入液体琼脂糖,避免产生气泡。
10.等待琼脂糖降温变成固态。
注意:
为节省时间,琼脂糖胶可以在PCR的时候进行配置。
B、电泳加样:
1.配置500-600ml的TAE缓冲液,倒入电泳槽中,务必使TAE缓冲液没过胶。
2.拔出梳子,将凝固的胶置于电泳槽中,有梳孔的一端靠近黑色电极一端。
3.用枪头,缓慢逼出梳孔的气泡,注意不要戳破梳孔。
4.用枪头吸取25µl的PCR产物缓慢加入梳孔中,注意不要使PCR产物溢出。
一孔PCR产物放入一个梳孔。
5.每一排留一个孔加10µlmarker。
C、电泳
1、电泳条件设置:
100V,30min。
2、在电泳过程中,每隔10min,查看下蓝色条带的位置,避免蓝色条带跑出胶。
3、当蓝色条带跑到整个胶的2/3—3/4的地方时,停止电泳。
四、PCR产物纯化(割胶回收)
A、切胶
1.将整块胶放入凝胶成像系统,开紫外,观察。
2.根据引物信息,查看PCR产物的位置是否正确。
3.事先准备好若干个1.5ml的离心管,在管盖上做好标记。
4.用刀片在紫外目录下,将目的条带切割下来,装入1.5ml的离心管。
注意:
为避免搞混,建议,每切割一块胶,即可放入相对应的PCR管。
B、胶回收纯化(按照天根生化试剂盒说明书操作)
请先检查平衡液BL是否出现浑浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加热几分钟,即可恢复澄清。
1.柱平衡步骤:
向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
2.向胶块中加入200-1000μlPN溶液(如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100μl,则加入100μlPN溶液),50℃水浴放置,其间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。
如果还有未溶的胶块,可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液,直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大,可事先将胶块切成碎块)。
3.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中),室温放置2min,12,000rpm离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CA2放入收集管中。
注意:
吸附柱容积为800μl,若样品体积大于800μl可分批加入。
4.向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CA2放入收集管中静置2min。
5.重复操作步骤4。
6.将吸附柱CA2放回收集管中,12,000rpm离心2min,尽量除尽漂洗液。
7.将吸附柱CA2置于室温放置3-5min,彻底地晾干,以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
注意:
漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
8.将吸附柱CA2放到一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加30-40μl去离子水,室温放置2min。
12,000rpm离心2min收集DNA溶液。
9.测定浓度及纯度。
五、DTCS反应
1.DTCS反应体系
试剂
体积
备注
DTCSMix(startkit)
2μl
F/R(10uM)
0.5μl
单向引物
PCR纯化产物
Xμl
根据引物信息加
去离子水
4.5-X
Total
7μl
2.DTCS反应程序
温度
时间
循环
96℃
2min
96℃
20s
30cycles
50℃
30s
60℃
2min
4-16℃
Holdon
注意:
避免DTCSmix反复冻融,可分装保存。
六、DTCS产物纯化:
1.终止反应:
按照NaAC:
Na2EDTA:
Glycogen=2:
2:
1准备测序反应终止液(即用即配,低温放置),取出DTCS反应产物,简短离心,向DTCS反应产物中加入2.5ul终止液;
2.每个反应管中加入30ul的95%-100%冰乙醇,轻混匀,换1.5ml的离心管,离心4℃,14000rmp15分,小心吸去上清;(此步换看到管底有少量乳白色沉淀)
3.加入70%-75%冰乙醇100ul洗脱残留的盐,4℃,12000rmp离心10分钟,轻轻的倒掉上清;
4.加入70%-75%冰乙醇100ul洗脱残留的盐,4℃,12000rmp离心10分钟,轻轻的倒掉上清;
5.简短离心10秒,用小枪头小心吸去残留液体,室温避光干燥5-10分钟;
6.加入甲酰胺(SLS)30ul,反复吹打DNA沉淀,室温静置5分钟,简短离心。
7.将样本转移至测序板中,加半滴石蜡油封盖,注意样本与石蜡油均不能有气泡,否则影响测序结果。
注意:
事先将离心机预冷到指定温度。
NaAC(醋酸钠)配制条件:
3M,pH5.2
Na2EDTA配制条件:
100mM,pH8.0
Glycogen(糖原)配制条件:
20mg/mL
七、GeXP上机测序
1.开测序仪电脑,开GeXP机器电源,双击GeXPsystem,进入GeXP程序;
2.上样:
单击RUN→Replenish→ReplaceWettingTray→取出水槽→去离子水清洗水槽三次→加入适量去离子水→擦干水槽外表面→装入水槽,转动固定器锁定水槽→取出样品板→小心将样品转移至GeXP样品板(不要出现气泡),加一滴石蜡油覆盖样品→取出缓冲液板,在对应孔中加入3/4体积的测序缓冲液→将样品板、缓冲液板放回原位→缓冲液板盖上防止蒸发盖→点击Done完成;
3.输入样品信息:
单击setup→选择样品板→在相应的孔内输入样品编号→选择样品所在的列→Method→下拉菜单选择LFR-1→单击其中一个样品孔→点击“Method”查看以下几个参数:
inject中“Voltdage”为2.0KV,“Duration”为15sec;Separate中“Voltdage”为4.8KV,“Duration”为60min,若需改动参数,可单击“Edit”进行修改→点击保存图标;
4.运行测序:
点击RUN→Start→确认样本板,缓冲液板和水槽→点击确认,开始运行样本;
5.试验结束,关闭机器电源,关闭RUN窗口。
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