靳三针疗法对窒息脑瘫幼鼠神经干细胞增殖与分化的实验研究.docx
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靳三针疗法对窒息脑瘫幼鼠神经干细胞增殖与分化的实验研究
靳三针疗法对窒息脑瘫幼鼠神经干细胞增殖与分化的实验研究
刘乡,柴铁劬,孙娟,张瑞孟令杰,赵丹,周健洪,陈东风
【摘要】【目的】观看靳三针疗法对脑瘫大鼠神经干细胞(NSCs)增殖与分化的阻碍。
【方式】选用SD新生大鼠,随机分为假手术组、模型组、靳三针疗法医治组(医治组,针刺百会、颞Ⅰ针、曲池、内关、足三里、涌泉),模型组与医治组均采纳结扎单侧颈总动脉法复制脑瘫大鼠模型,其中医治组于手术后24h开始针刺,共14d。
各组于造模后15d处死大鼠制备脑组织提取液。
另取健康SD新生大鼠,取大脑海马部位,分离、扩增NSCs,采纳免疫细胞化学法检测NSCs特点性标记Nestin与Brdu表达,以鉴定培育的细胞及体外分化能力。
培育细胞分为正常对照组,低、高浓度组(别离加入100、300μL/mL的医治组脑组织提取液),培育一、3、5d后,采纳免疫细胞化学法和免疫荧光法检测各组神经元样细胞和星形胶质样细胞的特点性标志物神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观看各组NSCs分化情形。
采纳流式细胞术检测各组NF、GFAP阳性细胞数,观看脑组织提取液增进NF、GFAP表达的时效和量效关系。
【结果】扩增后的细胞球Nestin与Brdu均呈阳性,证明体外培育的细胞为NSCs,并处于割裂增殖旺盛期。
细胞培育一、3、5d后,NF、GFAP染色均呈阳性,且正常对照组阳性细胞少,低、高浓度组明显增多,呈浓度依托性,说明NSCs已分化为神经元细胞和星形胶质细胞。
同一时刻段内低、高浓度组NF、GFAP阳性细胞数均较正常对照组显著增高(P<005或P<001),高浓度组在培育一、3、5d后,NF、GFAP阳性细胞数也显著增高(P<005或P<001),说明医治组脑组织提取液可增进NF、GFAP表达,且呈必然的量效和时效关系。
【结论】靳三针疗法医治脑瘫可能是通过增进NSCs的增殖和定向分化,从而达到修复脑损伤的目的。
【关键词】靳三针疗法/医治应用;脑性瘫痪/针灸疗法;神经干细胞/病理学;细胞培育
脑性瘫痪(cerebralpalsy,CP)是小儿先本性或围产期所发生的脑功能障碍性综合征,以中枢性运动障碍及姿势异样为主,常伴发智力低下、癫痫、语言障碍、视听异样等多重残障,是继脊髓灰质炎被操纵后近代最多见的儿童致残性疾病[1]。
目前国内外多种CP康复手腕虽有必然疗效,但仍无明显冲破。
“靳三针疗法”是闻名针灸学家靳瑞教授经连年临床实践,汲取古代针灸配穴理论而制造的具有独特理、法、方、穴、术的针灸疗法,对CP患儿多种病症改善有良好的临床成效[2-3]。
神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)是脑内具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞团,在脑损伤后能够被激活并增殖、迁移及分化,使损伤造成的形态与功能上的缺失得以部份恢复[4]。
因此,通过某些干与医治方法诱导、增强自体神经干细胞的增殖,调剂其定向分化,以增进自身修复,这已成为医治脑瘫新的研究热点。
本实验采纳“靳三针”针刺后的窒息脑瘫幼鼠模型脑组织提取液进行神经干细胞培育,观看该法对神经干细胞增殖与分化的阻碍,现报导如下。
1材料与方式
11要紧试剂及仪器DHanks液、LDMEM、1mol/L胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)由GIBCOL公司提供,链霉亲和素生物素复合物(SABC)、二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒由武汉博士德公司提供,神经丝蛋白(neurofilament,NF)、神经胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)、NestinandBrdu试剂盒由基因公司提供。
高速冷冻离心机(美国),Olympus显微镜(日本),BDFACSCalibur全自动流式细胞仪(美国),超净工作台(苏州净化设备公司),电热恒温培育箱(上海跃进医疗器械一厂)。
12实验动物及造模[5]清洁级健康SD新生大鼠18只,由广州中医药大学实验动物中心提供(粤检证字2003A010号)。
SD大鼠被随机分为假手术组、模型组、靳三针疗法医治组(简称医治组),每组各6只。
麻醉状态下结扎大鼠(模型组、医治组)左侧颈总动脉,2h后吸入体积分数8%氧和92%氮的混合气体2h(1L/min),继续保温1h后做行为测定,翻身不能、平稳异样、左旋者视为造模成功,以母鼠哺育。
假手术组仅分离颈总动脉而不结扎,亦不作低氧处置。
13各组处置方式模型组手术后不做任何处置。
医治组于手术后24h开始针刺。
穴位:
百会、颞Ⅰ针、曲池、内关、足三里、涌泉。
定位方式:
参照《大鼠穴位图谱研制》[6],结合人与动物骨度类比,顶骨正中定为百会穴;脑损伤侧外耳道口直上08cm处模拟颞三针之颞Ⅰ针;桡骨近端关节外侧前方的凹陷中取曲池穴;前肢内侧,离腕关节约3mm左右,尺桡骨缝间取内关穴;足三里穴(即后三里)在膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm处;后肢掌心前正中取涌泉穴。
针刺方式:
头部穴位平刺,进针后觉针下沉紧即可,百会、颞Ⅰ针接电针仪,持续波,频率5~10Hz,以穴周组织轻微抖动为度,约3~5V,持续5min。
曲池、后三里穴用02寸毫针,针1分深左右,亦施电针,参数同上。
内关、涌泉速刺微出血,不留针。
手术后前7d仅针四肢部穴位,第8天开始加针头部穴位。
天天针刺1次,共14d。
14脑组织提取液的制备[5]各组于造模后15d处死,取脑损伤区大脑皮质,按每150mg脑组织湿质量加1mL冷冻Tyrode平稳溶液的比例制备匀浆,匀浆液于4℃冰箱内留宿,第二天冷冻离心15000r/min共30min,取上清液过滤除菌,各相同组别之上清液混合,静置备用。
15神经干细胞分离、扩增与鉴定另取1只健康SD新生大鼠,在无菌条件下掏出其大脑,放入DHanks液中分离出海马,将之剪碎置于离心管中,以1000r/min离心5min,吸去上清液,再加入1mol/L胰蛋白酶消化10min,用含体积分数10%胎牛血清的培育基终止消化。
随后离心5min,吸去上清液,加入DMEM/F12的无血清培育基,用吸管吹打成单细胞悬液,过滤,细胞计数。
以1×105/mL的细胞密度移入培育瓶中培育,每隔3d半量置换培育基。
培育7d后,机械分离神经球进行传代,并用Brdu检测神经球内细胞的增殖能力,在培育液中加入05mol/LBrdu处置24h,然后进行免疫细胞化学染色,以Nestin作为NSCs的特点性标记物对培育的NSCs进行鉴定,检测NSCs的分化能力。
16NSCs的分组培育搜集培育的第2代神经球,以2×105/cm2的细胞密度接种于预先用100mg/L多聚赖氨酸处置过的24孔培育板各孔中的盖玻片上和6孔培育板中。
每块培育板分为正常对照组,低浓度组和高浓度组,每组6孔。
正常对照组培育液用DMEM/F12,加体积分数10%胎牛血清配制。
低浓度组、高浓度组是在正常对照组培育液的基础上加入医治组的脑组织提取液,浓度为100μL/mL和300μL/mL。
将培育板置饱和湿度、体积分数5%CO2培育箱37℃培育。
每隔3d半量置换培育液,培育一、3、5d。
24孔培育板细胞做免疫细胞化学染色和免疫荧光检测,6孔培育板细胞做流式细胞仪测定。
17检测指标神经干细胞分化检测:
在别离培育一、3、5d后,掏出24孔培育板各孔中的盖玻片,用40g/L多聚甲醛固定30min,001mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后,检测NF、GFAP表达。
171免疫细胞化学染色细胞爬片以新鲜配置的体积分数3%H2O2室温浸泡5~10min,以灭活内源性过氧化物酶。
滴加正常山羊血清30min,别离滴加鼠抗NF、GFAP、NestinandBrdu一抗(1∶2000),恒温下(37℃)孵育2h,PBS洗,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG室温下30min,滴加试剂SABC,室温30min,DAB显色,室温下20min,脱水、透明,中性树胶封片。
染色对照:
同一组片中,别离用正常山羊血清和PBS代替NF、GFAP、NestinandBrdu一抗作孵育,其余步骤同上。
172免疫荧光反映细胞爬片用40g/L多聚甲醛固定15min,再经体积分数为3%的过氧化氢—甲醇溶液中室温浸泡10min,正常山羊血清封锁20min,别离加入NF、GFAP一抗在4℃留宿。
与生物素化的二抗37℃下孵育20~30min,再与链霉亲和素生物素复合物—异硫氰酸荧光素(SABCFITC)在37℃下孵育20min,碘化丙啶(propidiumiodide,PI)复染。
173流式细胞仪定量分析NF和GFAP阳性细胞数以胰酶消化离心搜集细胞,用PBS洗1次,体积分数70%乙醇固定20min,离心去乙醇,PBS洗1次,1mLPBS悬浮细胞别离加NF和GFAP抗体(1∶200稀释),在4℃冰箱内孵育留宿,离心去上清,PBS洗1次,加SABCFITC室温下孵育1h,离心去上清,PBS洗1次,取1mLPBS悬浮细胞,采纳流式细胞仪测定NF和GFAP阳性细胞数。
18统计学方式在10×20荧光显微镜下,对免疫细胞化学染色的阳性细胞进行计数。
每组有6个培育神经干细胞的盖玻片,每一个盖玻片上随机选5个计数单位面积,计算细胞总数和阳性细胞数及阳性细胞的百分率。
采纳SPSS100统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)、中位数(M)表示,组间比较采纳方差分析(非正态或方差不齐采纳秩和查验),查验水平α=005。
2结果
21体外培育神经干细胞结果在培育最初3d中,可见少量细胞贴壁生长,培育基中悬浮大量未贴壁的单细胞和小细胞团。
小细胞团慢慢增大,第6天即形成含有数10个细胞的圆形细胞球,部份贴壁,部份仍处于悬浮状态。
贴壁生长的细胞球有少量细胞向外周迁移,伸出突起彼此交织成网状,形似细胞球周边长出的细长突起,放射状向周围伸展呈神经球样生长的原代培育NSCs形态,见图1(彩图见第315页)。
随着培育时刻延长,细胞球继续增大,细胞迁移慢慢增多。
对不同时刻培育取得的神经球进行免疫细胞化学鉴定,克隆内的细胞及周边细胞均呈Nestin阳性,见图2-a(彩图见第315页),证明神经球细胞属于胚胎初期原始细胞,因为Nestin的表达起始于神经板形成时期的细胞,发育到神经元迁移及分化后慢慢消失。
Brdu是细胞增殖时期的特点性标记,孵育后的神经球经免疫细胞化学鉴定大多数细胞呈Brdu阳性,见图2-b(彩图见第315页),说明这些细胞处于割裂增殖旺盛期,显示了自我更新能力,进一步证明本方式体外培育的细胞为神经干细胞。
22各组免疫细胞化学染色结果在细胞培育一、3、5d后,神经干细胞可分化为GFAP染色阳性的星形胶质样细胞,见图3(彩图见第315页),和NF染色阳性的神经元样细胞,见图4(彩图见第316页)。
NF阳性神经元样细胞的胞体呈圆形或锥体形,突起有较多分支;GFAP阳性星形胶质样细胞的胞体扁平,突起有较少分支,且突起长而直。
23各组免疫荧光检测结果正常对照组的NF、GFAP阳性细胞少,低、高浓度组NF、GFAP阳性细胞均明显增多,且呈浓度依托性。
3组NF、GFAP阳性细胞的胞核均呈红色荧光,胞体呈绿色,数量呈剂量依托性增多,见图五、图6(彩图见第316页)。
24流式细胞检测结果表1结果显示:
在同一时刻段内低浓度组、高浓度组NF阳性神经元样细胞和GFAP阳性星状胶质样细胞的百分率均较正常对照组显著增高(P<005或P<001),并呈浓度依托性。
为了观看脑组织提取液对NSCs分化进程中NF、GFAP阻碍的时效性,用300μL/mL即高浓度脑组织提取液别离作用0、一、3、5d,表2结果显示:
作用1d后,NF、GFAP阳性反映细胞开始显著增多,随着作历时刻增加,NF表达增强。
作用5d后,NF、GFAP阳性反映细胞达峰值,与不同培育时刻点比较,NF、GFAP阳性细胞的百分率随培育时刻的延长而显著增加(P<005或P<001)。
表1各组对NSCs的NF、GFAP表达的阻碍表2高浓度脑组织提取液于不同时刻对NSCs的NF、GFAP表达的阻碍
3讨论
自1992年起,Reynolds[7-8]等学者第一利用Neuroshere法成功地从成年鼠纹状体分离取得神经干细胞(NSCs),并发觉其在必然条件下可分化为神经系统的3种要紧细胞(神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞),具有自我复制能力和多向分化潜能。
以后,中枢神经发育和再生研究的核心集中在NSCs上并取得了长足的进展。
在胚胎脑的普遍区域和成年脑的一些特定区域内均有NSCs的存在。
发育期的脑较之成年脑含有更为丰硕的NSCs,随年龄增加,NSCs数量慢慢减少。
而NSCs正常情形下处于休眠状态,大体没有割裂和分化现象。
在损伤和局部环境转变时会被诱导割裂、分化、增生,如脑缺血、各类生长因子等都可成为诱发因素[9]。
说明可通过改变微环境来阻碍干细胞的存活、迁移和分化,以取得所需要的特殊表型的神经元或胶质细胞。
脑瘫脑损伤后,NSCs有必然的自我修复潜能。
中枢神经系统的移植实验也说明,某些部位的神经细胞或割裂后的神经元能够部份重建神经环路和功能[10-13]。
但这种自我诱导的强度、持续时刻是极为有限的,远远不能知足脑组织修复的需要。
因此,NSCs作为新生神经细胞的来源,能够通过NSCs的体外移植或体内NSCs的激活,使其分化为神经元和胶质细胞,与已经存在的细胞结构整合到一路,从而给中枢神经系统损伤的医治带来了希望。
靳三针疗法是临床医治脑瘫的有效手腕,以疏通气血、益精填髓、醒脑开窍为医治原那么。
前期研究已证明[14],靳三针医治可增强脑缺血幼鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化酶(GSHPx)的活性,清除过氧化脂质(LPO),减轻自由基的损害,靳三针对脑瘫脑损伤后脑组织局部微环境中的多种因素有良性调剂作用。
本实验结果证明,经靳三针医治后提取的脑瘫大鼠脑组织提取液能增进NSCs向神经细胞和胶质细胞分化,显著提高NF、GFAP表达的阳性率,“靳三针疗法”医治脑瘫可能是通过增进神经干细胞的增殖与定向分化,从而达到修复脑损伤的目的。
还有研究以为[15]脑损伤并非直接致使NSCs的活化增殖,而可能是由于脑细胞或浸润的炎细胞释放了某些因子,后者增进基因活化从而触发了残余的原始神经细胞Nestin蛋白从头表达。
据此,咱们推测,靳三针医治脑性瘫痪的有效性更深层次的缘故可能是通过针刺的良性诱导,增进了一系列细胞因子的产生与释放,从而改善了NSCs所赖以生存的脑内微环境,并进一步增进NSCs增殖与定向分化,最终达到修复脑瘫脑损伤的目的。
因此,启动并增强NSCs的自我修复能力可能是靳三针医治脑性瘫痪的要紧机制。
其确切机制有待进一步研究证明。
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