构建点突变质粒步骤.docx
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构建点突变质粒步骤
构建点突变质粒步骤
基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR
产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则:
(1)通常引物长度为25~45bp,我们建议引物长度为30~35bp。
一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12bp。
若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补的引物。
(2)如果设定的引物长度为30bp,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78C(GC含量应大于40%)。
(3)如果Tm值低于78C,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78C(GC含量应大于40%)。
(4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
(5)最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式:
Tm=0.41X(%of
GC)-675/L+81.5
注:
L:
引物碱基数;%ofGC:
引物GC含量。
四、引物设计实例
以GCGtACG为例:
5'-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3'
(1)首先设计30bp长的上下游引物,并将A(T)设计在引物的中央位置。
Primer#1:
5'-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3'
Primer#2:
5'-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGA
AGG-3'
(2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5
(Tm=0.41X40-675/30+81.5)。
通过计算可以看出其Tm低于78C,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度。
(3)重新调整引物长度。
Primer#1:
5'-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACT
TATTGCGG-3'
Primer#2:
5;-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACT
GAAGGAGG-3
在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm为80.952
(Tm=0.41X47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了。
五、突变所用聚合酶及Buffer
引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GCbuffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变。
除了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵。
可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTMHSDNApolymerase。
六、如何去掉PCR产物
最简单的方法就是用Dpnl酶,Dpnl能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的,所以Dpnl酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
Dpnl处理的时间最好长一点,最少一个小
时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败。
七、如何拿到质粒
直接把通过Dpnl处理的PCR产物拿去做
转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果。
八、图示
FCRampIHM
引禺口1.Inducingmutation・PCI?
foocl-lon
Mutated
N-otMutated
SI9P2.Selection
・UsingMukizytri
Nottransfcrnwd
Trafisformsd
St»p3,Tr 九、定点突变操作步骤 [A]诱导突变基因(PCR反应)以待突变的质粒为模板,用设计的引物及Muta-direct? 酶进行PCR扩增反应,诱导目的基因突变。 1.设计点突变引物。 [注]参考引物设计指导 2.准备模板质粒DNA [注]用dam+型菌株(例如DHa菌株)作为宿主菌。 在end+型菌株中常有克隆数低的现象,但是对突变效率没有影响。 提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。 3.[选项]对照反应体系(50卩反应体系) 10^ReactionBuffer 5 pUC18controlplasmid(10ng/ltotal20ng) 2yl Controlprimermix(20pmol/y) 2yl dNTPmixture(each 2.5mM) 2yl dH2O 38y ■■ Muta-direct? Enzyme 1yl 4.样品反应体系(50卩反应体系) 10^ReactionBuffer 5yl Sampleplasmid 2y (10ng/卩,total 20ng) Sampleprimer(F)(10pmol/y) 1yl Sampleprimer(R)(10pmol/y) 1yl dNTPmixture(each2.5mM) 2yl dH2O 38y ■- Muta-direct? Enzyme 1yl 5.PCR反应条件 [注]按如下参数设置PCR扩增条件 Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95C 30sec 15cycle 95C 30sec 55C 1min 72C 1minper 6.PCR扩增反应完成后冰育5分钟,然后置于室温(避免反复冻融)。 [注]按下列提供的PCR条件进行扩增,控制PCR循环数。 注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。 Mutation Cycles 1~2Nucleotide 15cycles 3Nucleotides 18cycles [B]突变质粒选择 PCR反应结束后使用Mutazyme? 酶消化甲基 化质粒从而选择突变质粒DNA。 1.准备PCR反应产物 2.加入1(11(1OU/卩)1Mutazyme? 酶37C温育1小时。 [注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme? 酶可能发生与样品反应不完全的现象。 因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。 如果突变率低,可以适当延长反应时间或增加Mutazyme? 酶用量。 [C]转化 反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口,当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株,例如DHa。 1.将101样品加到501感受态细胞里,然后放置在冰上30分钟。 2.接下来可以参照一般的转化步骤进行。 序列分析 通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。 为了证实这一结果,我们建议对白色单菌落进行测序分析。
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