第12章 高效液相色谱Word格式.docx
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下边解释一般了解即可)
1涡流扩散项:
A=2λdp(λ-不规则因子dp填充物直径)
2传质阻抗项引起板高:
C=Cm+Csm+Cs
由于目前大都使用数学键合相,以Cs可忽略。
,
a、引起部分:
Hs=
—忽略
Cs—常数与颗粒内空隙体积分数及容量因子有关。
dp填料直径Ds—组分在固定相中扩散系数。
固定相的粒度dp对物质抗项也有影响
b、由流动相引起部分:
Hm=
Hsm=
(Hsm—静态流动相物质阻抗项)
Cm—流动相的物质阻抗系数,与填充物质结构有关
∴HPLC的范氏方程:
H=A+cu=2λdp+(
)u
CsCsm
由此方程:
1/dp↓,H↓,n↑
2/Dm↑,流动相粘度减小,H↓,n↑
3/要使λ↓,H↓填充要均匀。
9、柱外展宽:
进样器联结管边等死体积越小越好。
HPLCφ2-6mm10-30cm死全积约1ml
记:
由H=A+cu,在HPLC中可近似认为板高与速成正比(直线关系)μ↑,H↑,n↓,为了兼顾柱效和分析速度,一般采用较低流速,多用1ml/min流量。
二、分离度及影响因素:
又可:
讨论如何由n、α、k来改变R
1、K↑,
↑,R↑,k最适宜范围1<
k<
5
怎样改变k呢?
通过改变流动相极性,来改变组分两相中的量,以在吸附色谱or正相色谱,要k↑,流动相极性↓改变k
∵没讲正,反色谱(红色中)k↓,流动相极性↑
而在反相色谱中恰好相反:
k↑,流动相极性↑,
k↓,流动相极性↓。
2、改变α—变峰向征
α↑,
↑R↑在GC主要通过改变固定相(∵载量一定),而在HPLC中,主要通过改变流动相。
3、改变n、n↑
a、减小题粒直径dp↓C=
b、提高装柱技术(均匀)
c、流动相η↓(∵低粘度流动相可以增大Dm)(Dm组分在流动相速扩散)
d、线速度u↓(减小传质阻抗引起H)
e、增加柱长L(但太长,柱压大,寿命短)
第三节各类HPLC法
近年来新的HPLC法应运而生
我们仅讲其中部分内容:
一、液-固吸附色谱:
LSC
1、机理:
同前章,即组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面的活性中心的能力不同而分离。
通过Ka不同来达到目的的。
在吸附色谱中,常用容量因子k=tR’/tm来讨论问题。
2、影响k的因素:
当柱与柱温(一般是室温)选定时,k与溶质与溶剂的性质有关。
以硅胶吸附剂为例。
①与硅胶亲和力大的溶质k大,tR大
②控制溶剂的极性,可调整tR(常用多元体系流动相)溶剂的极性愈大,洗脱力愈强,k↓.tR↓)
二、液-液分配色谱:
LLC
分离机理同前几章:
与液相色谱同样有正相色谱与反相色谱之分。
(一)正、反色谱
正相
反相
固定相极性
大
小
流动相极性
流动顺序
极性小的组分先流出
极性大的组分先流出
流动相极性↑,
k↓,tR↓
k↑,tR↑
∵反相主要用于分离非极性及中等极性的各类分子型化合物。
正相色谱常用固定相如:
氰基与氨基化学键合相
流动相:
与以硅胶为固定相的吸附色谱选法一致。
反相色谱常用非极性固定相如:
十八烷基键合相(ODS;
orC18表示)
流动相:
甲醇-水or乙腈-水pH2-8(继令相稳定,不变质)
反相色谱是应用最广的色谱法,主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物。
(二)反相离子对色谱:
(RPIC)
把离子对试剂加入极性流动相中,被分析的离子在流动相中与离子对试剂(反离子)生成不带电荷的中性离子时,从而增加在非极性固定相中的溶解度,使分配系数增大,而改变分离效果。
由上分离原理可以看出,反离子对色谱并不难实现,只是在前边所讲的反相色谱的流动相中,加进离子对试剂,调节适当的pH即可进行实验。
1、常用离子对试剂:
分析样品离子对试剂例
碱烷基磺酸钠正C5、C6、C7、C8磺酸钠
酸四丁基季铵盐四丁基胺磷酸盐(TBA)
2、机理:
P316
流动相固定相
B+H+===BH+
+
RSO3Na===RSO-3+Na+
||
[BH+RSO-3]=====[BH+RSO-3]
中性离子对↗
增加了在非极性固定相中溶解度。
3、分配系数:
其流出顺序与反相液相色谱一致。
分离碱(RNH2),流动相pH3~3.5K=
分离酸(RCOOH)pH≈7.5K=
注:
①凡在反相色谱中影响K的因素,此处同样。
②离子对试剂C链↑,K↑,k↑。
此离子对色谱在药物分析中对有机酸、生物碱及抗生素应用较广。
但有试剂价格贵,且流动相因有一定pH,对泵和流路有腐蚀。
四、离子抑制色谱ISC
在前边所述的反相色谱法中,调节流动相的pH,抑制组分离解,增加它在固定相中的溶解度,以达到分离有机弱酸,弱碱的目的。
1、适用范围:
3.0≤Pka≤7.0的弱酸
7.0≤Pka≤8.0的弱碱
而pKa<
3的酸,pKa>
8的碱应用离子对色谱。
PKa>
8pKb>
pH-pKa
2、抑制剂
弱酸(HAc)、弱碱(NH3·
H2O)或缓冲液
3、k及其影响因素:
(1)凡在反向色谱中的影响因素,此处同样影响。
(2)pH的影响
弱酸:
pH<
pKa时,k↗,tR增大(以分子形式在固定相中多)
pH>
pKa时,k↘,tR(以离子形式为主,流动相中多)
弱碱与上恰相反。
pKbtR↘
pH>
pKbtR↗
总之,pH应在2~8,超出将会腐蚀仪器,流路系统。
4、用途:
(1)有机弱酸或弱碱与两性化合物的分离。
(2)有机弱酸或弱碱与分子型化合物的分离。
注意:
对于pKa<
3的酸、pKa>
8的碱不能用此色谱。
特点
表孔硅胶(YBK)易装柱,柱效不高,柱容量小(η1000~5000)
无定形全多孔硅胶(YWG)柱效高,柱容量大,价廉,但要匀浆η8000-100000)
硅胶球形全多孔硅胶(YQG)具YWG的优,具涡流扩散小,渗透性好
堆积硅珠传质阻抗小,柱容量大(η>
800000)
第四节固定相
一、L~S色谱
1、硅胶:
(1)表孔硅胶:
(薄壳玻球YBK)
特点:
易装柱,但柱效不高,柱容量小(η1000~5000)
(2)无定形全多孔硅胶:
YWG、5~10μm
柱效高,柱容量大,但要匀浆装柱。
价格便宜(η80000~100000)
(3)球形全多孔硅胶:
YQG3~10μm
除具有YWG的优点外,还具涡流扩散项小及渗透性好等特点。
(4)堆积硅珠:
SiO2溶胶+凝胶剂聚结而成。
3~5μm
传质阻抗小,柱容量大(η>
80000)
2、高分子多孔小球:
YSG(柱效低η103)
又称有机胶:
苯乙烯与二乙烯苯交联而成。
用途:
分离芳烃、杂环、甾体、生物碱……
二、L~L色谱固定相:
载体+固定液
(一)机械涂渍(现高效中基本淘汰)
(二)化学键合相:
采用化学反应的方法将固定液结合在担体上。
具有吸附与分配双重作用。
优点:
不流失,稳定(pH2~8液中不变质),热稳定性好,且能用于梯度洗脱。
非极性键合相:
键合相表面为非极性基团:
ODS(十八烷基)
化学键合相中等极性键合相:
醚基键合相(正反应用流动相极性反应)
极性键合相:
键合极性基团(氨基、氯基)
1、非极性键合相:
键合相表面基团为非极性基团。
常用:
ODS键合相(十八烷基键合相)
1载体:
全多孔YWG,YQG、堆积硅球,作为ODS键合相与载体。
国产如:
YWG-C18(5,10μm),YWG-C6(5,10μm)
2表面覆盖度:
参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例为表面覆盖度。
其覆盖度的大小,决定键合相是分配还是吸附占主导作用。
具体比例:
见P319。
3键合基团键长:
↗,载样量↗,k↗
2、中等极性键合相:
——醚基键合相(正、反色谱由流动相极性而定)
3、极性键合相:
键合极性基团(氨基、氰基)
国产品:
YWG-NH2,YWG-CN(5,10μm)
(三)离子交换剂
经典液相色谱的交换树脂,不耐压,不适用,此处用离子键合相。
载体:
薄壳型或全多孔微粒硅胶。
离子交换基团:
-SO3H,-NR3Cl等
-SO3H—强酸型
-NR3Cl—强碱型
在pH0~8的流动相时使用,且要控制一定的离子强度。
当色谱条件一定时,柱交换容量大,保留时间长。
(四)凝胶:
(空间排斥色谱)
具有一定孔径的多孔性凝胶。
第五节流动相
在HPLC中,溶剂不同,与分子间作用力不同,有可能使组分的R不同,改变溶剂的极性,对组分的洗脱能力改变,tR改变,实验时可适当配比,以至得到较适宜的R。
对流动相的要求:
P322
1、不与固定相反应2、对样品的溶解度适当(控制R2~5)
3、与检测器匹配4、粘度小
优化及选择自学(不要求)。
第六节仪器
输液泵→进样器→色谱柱→检测器→记录
一、输液泵:
——往复泵P327
讲述泵输液原理:
——用单头往复泵将涡轮带动涡杆,将宝石柱塞往复推进拉出,推进时两宝石球顶向两边,此时将泵体中流动向输入柱子,拉出时,宝石珠向中间,此时向泵体抽液,如此往复,液体以脉冲形式输入柱子。
仪器改进:
双头往复泵P327图22-11
一个泵体抽液时,另一泵体向柱输液,另一泵体转到拉液时,一个泵体向柱输液,如此往复,脉冲相互抵消,得到较稳定的流速。
无脉动、流速恒定。
二、色谱柱与进样器:
1、进样器:
早期用隔膜进样阀,带压进样,操作困难,进样器易反弹出而损坏。
现用六通阀进样器,进样时先与柱流路断开(旋转)将样注入,然后旋至通路,将样带入柱子。
优势:
进样量准确,重现性好,可带压进样。
2、色谱柱:
由柱管和固定相组成。
柱管:
不锈钢管φ2-5mmL10~30cm常量柱
φ1~1.5mmL10~20cm常微量柱
装柱是一项技巧性很强的技术,它直接影响柱效。
当填料>
20μm,较易装,干法,轻叩。
粒度<
20μm,匀浆装柱。
(先将填料用等密度的有机溶剂匀浆,再高压装柱。
无论装柱还是买柱,要进行柱效检查。
测度条件根据柱类型不同而选用不同的检测。
P328。
测出各组分的W
,tR,求出n和R≥1.5
UV——70%
三、检测器荧光多用——15%
示差分析
电化学
蒸发光散射检测器
(一)紫外检测器:
优:
灵敏度高,精密度、线性范围好,可用于梯度洗脱。
缺:
①样品组分应吸收紫外光②要考虑溶剂的极限波长
1、固定波长型:
光源:
254nm低压汞灯,此类检测器光源强度大,灵敏度高,检测限可达1×
10-9g/ml,是一种简便实用的检测器。
2、可变波长检测器
可选择λmax(类似于可见—紫外分光光度计),将波长调在ε最大的λmax处进行检测,以增加灵敏度。
(有些配置较好的还可同时扫出紫外光谱),现多数HPLC配这种检测器。
3、光电二极管陈列检测器:
通过吸收池的光经光栅分光200-699nm,分光的光进入由500个单元组成的光电二极管陈列上。
可同时测每隔1nm的光线,因此UV(200~380nm)及VIS(381~699nm)的谱线瞬间(约60msec)就可测出。
信号经处理后记录仪打出三维空间图,或是平均吸光度色谱图。
可鉴别重叠峰,确认峰纯度,比较各峰化学结构,并可从几个通道同时进行峰面积计算,提供最佳定量标准。
(二)其它检测器
1、荧光检测器:
样品应有荧光,灵敏度比紫外更高。
检测限1×
10-10g/ml
2、示差检测器:
利用组分与流动相的折射率之差,类似气相热导、利用组分与载气热导率不同,进行检测。
对多数物质检测限较低。
环境、温度对其均有影响。
3、电化学检测器:
利用组分氧化还原反应,产生电流或电压变化进行检测。
对还原性物质检测限1×
10-12g/ml。
不能测不能氧化还原的物质。
第七节定性、定量分析
一、定性分析:
1、tR:
γ12——相对保留值=
2、化学鉴定:
对HPLC流出组分收集,用专属性化学反应对收集的分离物质组分进行定性。
3、联机技术:
HPLC—MS、HPLC—FTIR
质谱富利叶转换红外光谱
二、定量分析:
与气相色谱同。
1、外标法:
以试样的标准品作对照物质,相对比较求含量。
(1)工作曲线法:
(2)外标一点法:
(与气相同)
mi=
2、内标法:
内标选择同气相。
在待标准溶液系列中,同体积加入相同量的内标物、进样,分别测出标准物与内标物的A或h,以Ai/As~(Ci)s作图。
(2)内标一点法:
在药物分析中,校正因子常常不知,则先配已知浓度标准品,加入一定内标,再将内标按同量加入同体积样品中,分别进样。
(Ci%)样品=
3、校正因子法:
一步:
精称被测组分的标准品mig,加一定精称L内标Msg配液进样。
由二者峰面积比求出f;
再用待测组分的峰面积与样正因子计算含量。
令fs=1.
第二步:
称一定量样品,加入与测校正因子时相同量的内标物,配液、进样,测出Ai/As。
C2%=
式中m——称样量
用校正因子法时,实验条件必须稳定、波长应重现性好。
作业:
P3361、(定性重复性即RSD)
7、(含内标(s)0.035g/100ml)
小结
1、了解HPLC三个突破。
2、掌握范氏方程与气相中的区别。
3、掌握分离度影响因素。
4、掌握各色谱的原理(l~s,l-l—正,反……),流出顺序
5、固定液与流动相的选择
6、仪器:
重点:
泵、六通阀、检测器
7、定性、定量计算:
8、
色谱(气、液、)两个理论n’,nH’,H
H不同形式
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- 第12章 高效液相色谱 12 高效 色谱