正交法优选姜炙关木通的工艺研究Word下载.docx
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YingHaibin
Major:
Biologicaltechnology
Tutor:
ZhaoXue
Abstract
Objective:
Accordingtothetitlearistolochicacidchemicalproperties,referencetotraditionalChinesetraditionalmedicineexperience,Turntheprocessalsomethod.Methods:
Toshutakebiaastheresearchobject,Atitlearistolochicacidasthemainmonitoringindicators,Theorthogonalexperimentandothermethodtoshutthegingerforemanprocessalsooptimized.Theresults:
Shutthebesttechnologyofakebiagingercharconditionisgingerdosage40ml;
Immersiontimefor4hours;
Timefor4minutescraft,andsoakingtimegreatlyinfluencedtheresultsforprocessing.Conclusion:
Optimalgingerakebiaprocessstabilityfeasible.
Keyword:
Caulisaristolochiaemanshuriensis;
Gingersystem;
Process
目录
摘要I
AbstractII
1前言1
2.1仪器2
2.2试剂与材料2
3试验方法3
3.1试验设计3
3.2储备液的配制3
3.3供试品的制备3
3.4样品中马兜铃酸A的含量测定4
3.5紫外分光光度法方法学考察4
3.5.1标准曲线的绘制4
3.5.2稳定性试验、精密度试验4
3.5.3加样回收试验5
4结果与分析6
4.1方法学结果6
4.1.1线性关系考察结果6
4.1.2稳定性实验、精密度试验测定结果6
4.1.3加样回收率的测定结果7
4.2L9(34)正交实验马兜铃酸A含量测定结果7
5结论10
参考文献11
致谢12
1前言
关木通(caulisaristolochiaemanshuriensis)为马兜铃科(Aristolochiaceae)植物东北马兜铃(AristolochiamanshuriensisKom)的去栓皮干燥木质藤茎,秋、冬二季采截,主产于我国东北地区。
关木通横切面上可以看到许多呈放射状排列的导管,从名字和形状上不难看出其主要作用在一个“通”字上,体现具有清心火、利小便、通经下乳等功效[1]。
临床上用于口舌生疮、心烦尿赤、水肿、热淋涩痛、湿热痹痛等症状。
作为一种临床常用药,2000年版的中国药典收载了该品种。
关木通中主要含有马兜铃酸(Aristolochicacid)[2],这是一种对人体具有大毒的成份。
含马兜铃酸类的中药引起马兜铃酸肾毒性问题近年来备受国内外医药界关注,控制它的毒副作用依然是研究的重点。
试验以马兜铃酸A(Aris-A)为指标,以关木通为对象,借鉴传统炮制经验,进而对其炮制方法进行研究,以便能推广该炮制方法应用到实践中。
本文使用可见分光光度法,利用供试品中马兜铃酸A的吸光度确定其浓度。
2仪器、试剂与材料
2.1仪器
722型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、药物粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)、电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、全数字超声波发生器(上海诗丹德生物技术有限公司)、榨汁机、燃气灶、炒锅等。
2.2试剂与材料
马兜铃酸A标准品(上海诗丹德生物技术有限公司)、甲醇(分析纯)。
关木通(购自长春中医药大学附属医院)、生姜(购自吉林大润发超市)。
3试验方法
3.1试验设计
采用正交试验法,将姜汁浓度、浸泡时间、炒制时间设为3个因素不同水平,先对三个因素进行单因素试验,分别固定姜汁浓度、浸泡时间、炒制时间中的其中两个炮制工艺条件来确定另外那个因素的可变范围,选用L9(34)正交表安排试验对关木通进行炮制,以马兜铃酸A含量为指标,见表3-1。
表3-1正交试验因素及水平设计
水平
因素
姜汁用量A(ml)
浸泡时间B(h)
炒制时间C(min)
1
20
4
2
40
8
3
60
12
3.2储备液的配制
先取甲醇纯溶液配制成浓度为70%甲醇。
用电子分析天平精密称取马兜铃酸A对照品粉末2.4mg,置于50mL容量瓶中,70%甲醇定容至刻度线,得浓度为0.048mg/mL的储备液。
3.3供试品的制备
先将关木通原材料用蒸馏水冲洗,去除药材采集时带入的沙土杂质,置于蒸笼里润透后按一定规格切片,再置阴凉地方风干。
生姜称取500g,洗净后放入榨汁机中,榨取姜汁150mL备用。
隔天按照L9(34)正交表(表3-1)安排试验,将根据正交试验安排的9组样品分别置炒锅内用文火[3]炒制后,冷却、干燥,再次称重,即得炮制品。
炮制后的关木通切片经药物粉碎机粉碎2分钟后精密称取0.3g,置于50mL容量瓶中,加入70%甲醇溶液至刻度线进行超声波提取,超声波设置在100W,60Hz下提取40min。
提取液用真空抽滤泵初滤,再次用滤纸过滤,取滤液,定溶即为供试品。
3.4样品中马兜铃酸A的含量测定
经正交法炮制后的9组关木通各取粉末0.3g[4],按上述方法将粗粉制备成供试品溶液,利用可见分光光度计,以70%甲醇为空白对照,在波长317nm处测定各组样品吸光度A值[5,6]。
代入回归方程得到马兜铃酸A浓度值,计算其含量,结果见表4-2,表4-3。
3.5紫外分光光度法方法学考察
3.5.1标准曲线的绘制
精密称取马兜铃酸A对照品粉末,用70%甲醇稀释成8个含马兜铃酸A不同浓度的供试品溶液,浓度分别为0.006mg/mL,0.012mg/mL,0.018mg/mL,0.024mg/mL,0.030mg/mL,0.036mg/mL,0.042mg/mL,0.048mg/mL。
以70%甲醇为空白对照,在317nm处测定各浓度时马兜铃酸A溶液的吸光度值,分别测定三次,取平均值[7]。
以马兜铃酸A浓度为横坐标,以吸光度平均值为纵坐标,进行线性回归,得出回归方程,结果见图3-1,表4-1。
图3-1马兜铃酸A标准品标准曲线
3.5.2稳定性试验、精密度试验
稳定性试验:
取正交法试验中马兜铃酸A含量最少的一组(即A2B3C1),以70%甲醇为空白对照,在0h,2h,4h,6h,16h,24h测定317nm处的吸光度值[8]并算出标准偏差(RSD),结果见表4-2。
精密度试验:
取正交法试验中马兜铃酸A含量最多的一组(即A1B2C2),精密吸取6等份,短时间內连续测量,测得马兜铃酸A吸光度值,算出其标准偏差[9],结果见表4-2。
3.5.3加样回收试验
精密称取同一炮制工艺的姜炙关木通粉末6份,各0.3g,同3.3法制备供试品溶液,并加入0.3mg对照品,根据得到的吸光度值推出供试品中马兜铃酸A的含量[10],计算加样回收率,结果见表4-3。
4结果与分析
4.1方法学结果
4.1.1线性关系考察结果
表4-1线性关系考察结果
对照品浓度(C)mg/mL
吸光度平均值(A)
0.006
0.319
0.012
0.656
0.018
0.981
0.024
1.312
5
0.030
1.648
6
0.036
1.957
7
0.042
2.303
0.048
2.609
由测定结果得到回归方程为A=54.621X-0.0016,R2=0.9999,如图4-1;
马兜铃酸A含量在0.006mg/mL~0.048mg/mL范围内与其吸光度呈良好线形关系。
4.1.2稳定性实验、精密度试验测定结果
分别通过对A2B3C1的稳定性考察、和A1B2C2的精密度考察,得到各方法学考察的马兜铃酸A的含量及其各组含量的平均值与标准偏差。
表4-2稳定性、精密度试验测定结果
试验编号
稳定性实验
精密度试验
含量%
0.2831
0.8193
0.2789
0.8232
0.2861
0.8175
0.2784
0.8174
0.2842
0.8223
0.2794
平均值
0.2817
0.8195
RSD
0.3212
0.2607
RSD=标准差/平均数
结果表明:
1号试验组A2B3C1在0h,2h,4h,6h,16h,24h内测定吸光度值,其标准偏差(R)=0.3212<2,表明试验的稳定性良好;
A1B2C2分别测定6次,标准偏差=0.2607<2,表明试验的精密度良好。
4.1.3加样回收率的测定结果
表4-3加样回收率的测定结果
称样量
样品含量
加对照品量
测得量
加样回收率
(g)
(mg)
0.3003
0.2827
0.30
0.5779
0.9840
0.3001
0.2782
0.5689
0.9690
0.3004
0.2852
0.5814
0.9873
0.2839
0.5757
0.9727
0.3002
0.2825
0.5789
0.9880
平均值%
0.9802
RSD%
0.8960
平均加样回收率为0.9802,RSD=0.8960<5%,符合《中国药典》规定。
4.2L9(34)正交实验马兜铃酸A含量测定结果
表4-4正交实验马兜铃酸A含量测定结果
试验号
A
B
C
马兜铃酸A含量%
0.8459
0.9376
0.7282
0.8303
0.7299
0.2928
0.8128
0.6671
9
0.6319
K1
0.8372
0.8297
0.6019
K2
0.6177
0.7782
0.7999
K3
0.7039
0.5510
0.7570
极差(R)
0.2195
0.2787
0.1980
表4-5结果的方差分析(a=0.10)
偏差平方和
自由度
F比
F临界值
显著性
0.073
1.054
3.110
*
0.132
1.906
**
0.065
0.939
误差
0.270
--
偏方平方和=单次测量值与测定平均值之差的平方的总和
方差=偏方平方和/自由度
由表4-4,表4-5数据结果中可以看出,在不同的因素作用下炮制的关木通中马兜铃酸A的含量测定结果值在0.2928%~0.9376%范围内;
其中以姜炙法A1B2C2(姜汁用量:
20mL、浸泡时间:
2h、炒制时间:
8min)中马兜铃A含量最高,A2B3C1(姜汁的用量40mL;
浸泡时间:
4h;
炒制时间:
4min)中含量最低。
以马兜铃酸A为考察指标,进行F检验得到:
浸泡时间对总酸含量有显著的影响,姜汁的用量及浓度炒制时间对总酸含量影响较小。
直观分析对马兜铃酸总酸含量的影响因素的顺序为B>A>C。
姜炙关木通炮制的最佳条件是A2B3C1(姜汁的用量40mL;
4min)。
5结论
对关木通先进行单因素试验,结果显示姜汁用量在没过关木通后影响变小,马兜铃酸A含量与浸泡时间成负相关,炒制时间因控制在15min内,时间过长会使关木通碳化,所以通过正交方法对关木通姜炙进行了L9(34)的正交设计,姜汁用量设定为20mL、40mL、60mL,浸泡时间设定成1h、2h、4h,炒制时间设定成4min、8min、12min三个水平。
并采用可见分光广度法对其马兜铃总酸A含量进行了测定。
根据数据分析得到姜炙关木通炮制的最佳条件是A2B3C1(即:
姜汁的用量40mL;
姜炙法炮制关木通得到的含量结果稳定。
优选的工艺稳定可行。
关木通姜炙工艺受姜汁浸泡时间影响较大,建议根据生产时延长浸泡时间。
参考文献
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中国中医药出版社,2003:
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[10]孙启明.再谈关木通[J].医古文知识.2003,(3):
32.
致谢
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