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酵母表面表达碱性蛋白酶
编号
本科生毕业设计(论文)
题目:
酿酒酵母碱性蛋白酶表达载体的构建及表达状况的研究
生物工程学院发酵专业
学号020*******
学生姓名李芳
指导教师石贵阳教授
张梁副教授
二〇一一年六月
摘要
随着石化燃料的日益减少,酒精作为一种清洁可再生的新型能源成为当前各国研究的热点。
酿酒酵母酒精发酵是目前工业上最大的、应用最广的生物乙醇生产方式。
因此,有效地降低生产成本是目前研究者研究的热点。
利用基因工程及代谢工程技术对工业酒精酵母进行改造,可提高菌种的发酵性能,降低酒精的生产成本。
目前生产酒精的主要原料,淀粉质原料如玉米,饲用大麦等含有较高浓度的蛋白质(玉米:
10-13%;饲用大麦:
15-18%)。
而酿酒酵母无外分泌蛋白酶,不能利用原料中的可溶性蛋白。
为使酿酒酵母能够利用原料中的可溶性蛋白,提高酒精产率和原料利用率,降低酒精发酵的成本,本实验通过信号肽分泌表达和酿酒酵母表面展示技术并以酿酒酵母自主复制和同源重组两种不同的方式表达来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)的碱性蛋白酶基因,获得表面展示表达重组菌S.C.pMD1(pMD-PGK1-α-factor-AG1)[整合型]、S.C.pYX1(PYX212-KAN-α-factor-AG1)[游离型]、及信号肽分泌表达重组菌S.C.PMD2(PMD-PGK1-α-factor)[整合型]、S.C.PYX2(PYX212-KAN-α-factor)[游离型]。
在重组菌碱性蛋白酶酶活测定的实验中,重组子都表达出一定量的酶活。
但总体而言,游离型表达质粒的酶活表达量要高于整合型表达质粒。
由于时间关系,还没有对信号肽分泌表达和表面展示表达做出相应的酶活测定和分析。
关键字:
碱性蛋白酶;酿酒酵母;酒精发酵;表面呈现表达
ABSTRACT
Asthereservesofpetroleumdecrease,ethanol,whichisrenewable,hasbecomethefocusofmanycountriesasanalternativeliquidfuelstogasoline.Bioethanolproductionbysaccharomycescerevisiaeiscurrentlybyvolume,thesinglelagestfermentationprocessinindustrialbiotechnology.Thereforethedevelopmentofcost-effectivetechnologiesforfuelethanolproductionisapriorityformanyresearchers.Improvementofthefermentationcompetenceofyeaststrainbygeneengineeringandmetabolicengineeringwilldecreasethecostsofethanolproduction.
Althoughthematerialsusedforethanolproductioncontainrelativelyhighproteincontent(corn:
10-13%;feedingbarley:
15-18%),theyeastsusedinfuelethanolmanufactureareunabletometabolizesolubleproteins.Toimprovethesubstrateutilizationandethanolyield,theAprEgene,encodingalkaliproteaseBacillussubtilis168,wasclonedandexpressedinindustrialethanolyeastbymeansofmanyexpressingtechniques.Inthisexperiment,weusedthesignalpeptidesecretionandwineyeastsurfacedisplaytechnologyaswellaswineyeastindependentcopyandhomologousrecombinationofthetwodifferentwaystoexpressetheAprEgene.WeobtainedfourrecombinantstrainsS.C.pMD1(pMD-PGK1-α-factor-AG1),S.C.pYX1(PYX212-
KAN-α-factor-AG1)、S.C.PMD2(PMD-PGK1-α-factor)、S.C.PYX2(PYX212-KAN-α-factor).Intheexperimentoftheactivityofalkalineprotease,therecombinantstrainsexpressacertainamountofenzymaticactivity.AndS.C.pMD1andS.C.pYX1havehigherenzymaticactivitythanS.C.PMD2andS.C.PYX2.Forthetimebeing,notyettoanalysistheactivitythatsignalpeptidesecretionexpressionandsurfacedisplayexpress.
Keywords:
Alkaliprotease;Wineyeast;recombinantplasmid;surfacedisplaysystems
第1章绪论
1.1碱性蛋白酶与酒精发酵
碱性蛋白酶(alkalineprotease)是一类在碱性pH范围具有活性和稳定性的酶类,最早发现于猪胰脏中。
它是一类非常重要的工业用酶,在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途[1]。
近年来,随着高浓酿造技术的发展,碱性蛋白酶在发酵工程中的作用以及在酿酒酵母生长和发酵酒精方面越来越受到重视[9]。
淀粉质原料是目前发酵生产酒精的主要原料,含有一定浓度的蛋白质。
在酒精发酵过程中加入的糖化酶虽具有较高的糖化能力,但它不具有蛋白酶活力,而目前用于生产酒精的酿酒酵母又没有外分泌蛋白酶,糖化醪中的可溶性蛋白又无法进入酵母细胞,所以在酒精发酵过程中,酿酒酵母无法充分利用这部分的原料,造成了发酵液中氮源的极大浪费。
在现实的酒精发酵生产中,往往需要添加硫酸铵、尿素等无机氮源。
研究表明,虽然添加无机氮源可以为酵母提供可吸收性氮,加强氨基酸等物质的合成,有效促进酵母的新陈代谢和生长繁殖,提高产酒精速率,但由于无机氮源并不能减少菌体用于合成氨基酸所需要的碳源,也不能降低糖代谢的能耗,因此并不能增加酒精的产量。
相比之下,碱性蛋白酶可以对原料中蛋白质进行有效的降解,提高醪液中氨基酸的含量。
酵母菌则可以直接利用醪液中的氨基酸合成其他必需氨基酸和蛋白质,加快酵母菌的生长繁殖,减少了合成代谢的能耗,提高酒精产率[9]。
1.2酿酒酵母表达系统
酿酒酵母本身含有质粒,其表达载体可以有自主复制型(即游离型)和整合型两种。
自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝,含有自动复制序列(automaticreplicatingsequence,ARS),能够独立于酵母染色体外进行复制,如果没有选择压力,这些质粒往往不稳定。
整合型质粒不含ARS,必需整合到染色体上,随染色体复制而复制。
整合过程是高特异性的,但是拷贝数很低[15]。
酵母的rDNA基因序列是提高外源基因拷贝数的最佳整合位点之一。
早在1989年Lopes等就构建了以rDNA为整合位点的质粒pMIRY2,大大提高了外源基因的稳定性和拷贝数,研究者还对这类质粒的高拷贝数整合的机制进行了研究。
,人们设计了pMIRY2质粒,旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列),因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝[9]。
1.2.1酿酒酵母的游离型表达
游离型表达即常见的质粒表达,如2μ质粒。
此类载体可以自主复制,但需要在选择压力存在下以维持其在酵母细胞中的拷贝数,所以容易丢失,难以实现外源基因的稳定高效表达。
ARS为酵母菌中的自主复制序列,大小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个ARS元件。
由染色体ARS构成的质粒称为Yrp,而由2μ质粒构建的杂合质粒为Yep[9]。
1.2.2酿酒酵母的整合型表达
在以2μ质粒为基础的自主复制质粒在多倍体和二倍体菌株中的稳定性高于单倍体,但他们在非选择条件下被认为是不稳定的[7]。
一般的,可利用无酵母复制起点的但含有与酵母基因组某些序列同源的DNA序列的载体来进行整合。
通过重组,同源序列整入酿酒酵母染色体相应位点。
在转化前,在酵母来源的序列区域将载体线性化可提高整合率。
由于整合会破坏染色体上的位点,基因通常会插入非必要位点如rRNA位点(在基因组上有一百个以上的拷贝)。
但整合到必需位点如LEV2,ILV2或PGK1或ADC1,因为菌株的染色体组的多拷贝是他们的等位基因仍保持完整[15]。
整合是有益的,不仅因为整合DNA的稳定性而且因为通过整合可以获得隐含少量外源DNA的菌株。
通常使用的载体含有在E.coli中扩增所需的细菌序列。
在酵母表达系统中,一般采用YIp型载体进行整合。
这是一种整合型载体。
它不含酵母的DNA复制起始区,因此不能在酵母中自主复制;但它可以与酵母染色体进行同源重组,以低频率整合到酵母细胞染色体上。
整合位点取决于载体中的互补基因序列数。
这种同源重组的过程主要有两种形式:
单交换整合与双交换整合。
酵母整合型载体因其转化子的高度稳定性被广泛应用。
但它也有不足之处,转化率低、整合拷贝数很少,因而酿酒酵母转化子对外源基因的表达量相对较低。
用在酵母染色体上以多拷贝形式存在的DNA片段,如:
rDNA、Ty序列等作为整合介导序列构建载体,就可以大大提高整合的拷贝数和外源基因的表达水平。
这类整合载体被称为YMIp型载体[16]。
为获得有效表达,外源基因必须在酵母调控序列的启动子和终止子控制下,转化的选择性标记为非酵母来源的,也必须如此。
在某些情况下,为获得更有效的表达或其表达需受新的方式调控,可以用另一酵母启动子来代替该同源启动子。
最有效的启动子一部分来自酵母糖酵解途径的酶,如编码磷酸甘油酸激酶的PGK1基因、编码烯醇化酶的ENO1基因和编码醇脱氢酶的ADC1基因等。
这些调控序列使构建能增强和调控同源或医院基因表达新菌株的方法更多样化[16]。
1.2.3酿酒酵母α信号肽分泌
酵母本身分泌的内源蛋白质较少,利用信号肽序列引导外源蛋白质的分泌可简便纯化步骤。
但是信号肽对外源蛋白的分泌也会产生影响。
信号肽是存在于分泌蛋白质N末端的特异氨基酸序列,引导新生肽穿越原核生物的质膜和真核生物的内质网膜,并使其转移到细胞的靶部位。
完成该过程信号肽就被信号肽酶降解,因此成熟蛋白质的N端并无信号肽序列。
信号肽由10~40个氨基酸残基组成,分为3个区段。
N端为带正电荷的氨基酸,如赖氨酸和精氨酸,称为碱性氨基末端;中间段为由≥20个氨基酸(以中性氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸为主)组成的疏水核心区,形成L螺旋结构;C端又称为加工区,由极性、小分子氨基酸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成,为信号肽酶(signalpepfidase)的裂解部位。
一般认为疏水区长度越长、疏水性越强的蛋白质其分泌效率越高,因此疏水区的长度和疏水性对蛋白分泌十分重要。
在新生肽链中,除N端有信号肽外,C端一些肽段也对肽链穿越粗面内质网膜有作用,可以终止肽链穿越,因此该部分肽段被称为终止转运序列,在某种意义上也是一种信号肽。
如果该肽段完全或部分缺失将严重削弱酶在内质网膜上的集合装配,影响酶的正常功能[14]。
酵母信号肽有a因子信号肽(matingfactoml,MFal),酸性磷酸脂酶(phosphatasel,PH01),蔗糖酶(sucrase2,SUC2)和Killer毒素等中的内源性信号肽,其中以a因子信号肽应用最广。
a因子信号肽来源于啤酒酵母,其结构中起主要作用的是前导肽和间隔肽;前导肽由83个氨基酸残基组成,间隔肽为Lys-Ars(Glu-Ala)1-2或Lys-ArgGlu-AlaAsp-Ala氨基酸序列。
前导肽和间隔肽对蛋白的正确切割和分泌至关重要,有时由于上述两种基因产物的切割活力不同,会在外源蛋白的N端产生不同的切割位点,使一些蛋白在分泌中会在N端带有(Glu-Ala)1-2融合序列,即产生所谓的酵母信号肽切割不完全现象。
其中最常用的a因子信号肽有Ppic9k,Ppiczα,pGAPZα系列。
本实验用的a因子信号肽为Ppic9k。
a因子信号肽,它可以引导小分子质量蛋白的分泌,但是对一些分子质量较大的外源蛋白作用不明显。
且如果对信号肽本身进行适当改造,也将会显著提高外源蛋白的表达量[14]。
1.2.4酿酒酵母表面呈现技术
酿酒酵母细胞壁厚约200nm,主要由外层的甘露糖蛋白和内层的葡聚糖骨架组成,两者通过共价健相连。
目前已报道的酿酒酵母表面展示系统有2类,分别以α或a-凝集素为融合骨架。
它们都是通过α或a-凝集素基因与目的蛋白共同连接在表达载体上,转入细胞从而实现外源基因的锚定表达[5]。
α-凝集素由AGα1基因编码的650个氨基酸组成;a-凝集素由AGA1基因编码的核心亚基和AGA2基因编码的结合亚基以二硫键连接组成。
α-凝集素和a-凝集素均以O-糖基化的形式存在,其核心亚基包括分泌信号区、活性区、富含Ser/Thr的支撑区和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白附着信号区[5]。
内层的葡聚糖是维持细胞壁强度的主要物质。
外层甘露糖蛋白有两种类型,一种足通过共价健与酵母细胞松散相连并能被SDS提取出来的低分子量蛋白;另一种是必须被葡聚糖酶解细胞壁的β-1,3-和β-l,6-葡聚糖层后才能被SDS抽提的高分子量蛋白,包括凝集素、絮凝素等。
后者的结构中大多都含有GPI锚定区域。
GPI锚定区域与细胞蛋白的C-端共价相连,为蛋白与细胞膜提供稳定的连接[6]。
在凝集素的定位过程中,合成的前体蛋白首先通过其疏水的羧基端序列吸附到内质网膜上,随后疏水的羧基端被糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定序列所替换,该锚定蛋白被运输到质膜并与质膜相连。
最后,在特异性磷脂酰肌醇磷脂酶的作用下,锚定蛋白被释放并运送至细胞壁最外层,与葡聚糖连接而完成附着[6]。
1.3本课题的研究目的与意义
酒精是目前世界上产量最大的发酵产品之一,酒精产量的提高,能有效的帮助社会改善能源的利用率以及空气中环境污染的严重。
然而目前用于酒精生产的酿酒酵母无外分泌蛋白酶,传统的糖化酶虽然具有高糖化力的特性,但该酶不具有蛋白酶活力,无法有效利用原料中的蛋白质,提供氮源,这就造成了原料的极大浪费,降低了原料的利用率。
就成本而言,酒精发酵过程中就必须添加一定的酵母可利用的无机氮源,增加了成本的浪费。
在同步糖化发酵过程中,由于蛋白酶对原料颗粒具有溶解作用,可以促进淀粉酶的糖化作用。
碱性蛋白酶对蛋白质的降解会增加醪液中的游离氨基酸,酵母菌可以直接利用这些氨基酸合成菌体,从而促进酵母菌生长繁殖,提高酒精发酵速率和原料的出酒率。
因此,使酵母具有分解外源蛋白质的能力是最为经济和简便的提高原料利用率的方式。
利用基因工程及代谢工程技术对酿酒酵母进行改造,可提高菌种的发酵性能,降低酒精的生产成本。
1.4本课题的研究内容
本课题以枯草芽孢杆菌中的碱性蛋白酶的基因作为目的基因,以PCR的方式获取碱性蛋白酶基因序列,以pPIC9K质粒作为α信号肽的供载体,将碱性蛋白酶基因和α信号肽以及展示蛋白基因转入大肠杆菌感受态中,再将大肠杆菌重组质粒通过电转和醋酸锂转化的方法将大肠杆菌重组质粒转入酿酒酵母细胞中。
最终使转化酿酒酵母以α信号肽和细胞表面呈现的方式分泌出蛋白酶并呈现酶活。
第2章材料与方法
2.1材料
2.1.1菌株与质粒
工业酒精酵母(S.cerevisiaeCICIMY0086),E.coliJM109{recA1supE44endA1hsdR17gyrA96relA1thi(Lac-proAB)F'[traD36proAB+lacIqlacZM15},枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168,经过师兄、师姐们的改良),质粒pPIC9K、PYX212保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心(http:
//cicim-
2.1.2工具酶和试剂
氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)
上海生工生物工程公司
TaqDNA聚合酶、Rnase、限制性内切酶、T4DNA连接酶
Fermentas公司
G418
Sigma公司
质粒提取试剂盒
美国Axygen公司
PCR产物纯化试剂盒
美国Axygen公司
Pfu,EX-Taq高保真DNA聚合酶
宝生物工程有限公司
YeastExtract、Tryptone
OXOID公司
其他试剂药品
国产或进口分析纯
2.1.3引物
Primernames
Sequence(5’-3’)Restrictionsitsareitalic/underlined
Restrictionsites
BSapr1
TAGGAATTCAGGAGAGGGTAAAGAATGAGAAGC
EcoRI
BSapr2
AATGTCGACCAGGTATGGAGGAACCTGCTT
SalI
AG1
ACGCGTCGACGCTAGCGCCAAAAGCTC
SalI
AG2
CGCGTCGACTTAGAATAGCAGGTACGACAAAA
SalI
AG3
CGCGATATCTTAGAATAGCAGGTACGACAAAA
EcoRV
α-factor1
CGCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG
BamHI
α-factor2
CCGGAATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG
EcoRI
α-factor3
TAGGGAATTCTACGTAAGCTTCA(自身带的两个酶切位点)
HindIII
Kan1
GGGGTACCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCCCAGTAGTAGGTTGAGG
Kan2
GGGGTACCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATT--TGAAGTCGGACAGTGAGT
2.1.4酿酒酵母染色体提取试剂
山梨醇(1mol/L)-0.1mol/LEDTA(PH7.5)缓冲液、蜗牛酶(30mg/mL)、50mmol/LTris-HCL(PH7.4)-20mol/LNa2EDTA溶液、10%SDS(十二烷基磺酸钠)、5mol/L醋酸钾、无水异丙醇、TE缓冲液(PH7.4)、Rnase
2.1.5枯草芽孢杆菌染色体提取试剂
溶菌酶(10mg/mL)、蛋白酶(20mg/mL)、20%SDS、酚和氯仿、醋酸钾
2.1.6pPIC9K、PYX212-Kan质粒提取试剂
溶液I:
ddH2O,Rnase;
溶液II:
1%SDS,0.2mol/LNaOH;
溶液III:
乙酸11.5mL,5mol/L醋酸钾60mL,ddH2O28.5mL;
RNA酶溶液:
称取5mg的RNA酶,于1mL无菌水中充分溶解,90ºC水浴10min,缓慢冷却,于-20ºC保藏。
2.1.7测定碱性蛋白酶活试剂
(1)作用底物:
1%酪蛋白溶液,称取1g酪蛋白溶于100mLpH3.0的硼酸-氢氧化钠缓冲液中,用前配制;
(2)0.4mol/L的三氯乙酸溶液;
(3)0.4mol/L的碳酸钠溶液;
(4)福林试剂:
与2L磨口回流装置内,加入100g钨酸钠,25g钼酸钠,700mL去离子水,50mL85%磷酸,100mL浓盐酸,文火回流10h后,加入150g硫酸锂,50mL去离子水,混匀后加入几滴液溴,煮沸15min,冷却后,定容至1,000mL,最后用细口漏斗4~5号过滤,置于棕色瓶中保存。
使用时加2倍去离子水稀释,即为福林工作液;
(5)pH11硼砂溶液-氢氧化钠缓冲溶液:
甲液(0.05mol/L硼砂溶液):
取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19g,用蒸馏水溶解并定容至1,000mL 。
乙液:
0.2mol/L氢氧化钠溶液。
将乙液加一倍水后与等量的甲液混合;
(6)100μg/mL酪氨酸溶液:
精确称取0.1g在105ºC烘箱中烘至恒重的酪氨酸,加入适量的0.1mol/L盐酸溶液,使之溶解,加去离子水定容至1,000mL,即配成100μg/mL酪氨酸溶液,-4ºC保存。
2.1.8培养基和培养条件
重组质粒构建过程中均采用LB液体培养基(Tryptone10g/L,YeastExtract5g/L,NaCl10g/L),LB固体培养基需另加1.5%的琼脂粉。
培养温度37ºC;
氨苄青霉素、卡那霉素在培养基中的工作浓度分别为100μg/mL、30μg/mL;
酵母培养采用YEPD培养基(Tryptone20g/L,YeastExtract10g/L,葡萄糖20g/L)。
必要时加入G418用于转化子的筛选,终浓度为350μg/mL。
培养温度为30ºC;
枯草芽孢杆菌培养用LB培养基,在37ºC下培养。
2.1.9醋酸锂转化法试剂
TE(pH8.0)、1.0mol/L醋酸锂溶液、0.1mol/L醋酸锂溶液(1体积10×TE,1体积10×1.0mol/L醋酸锂溶液、8体积无菌超纯水)
2.1.10主要仪器和设备
电热恒温水浴锅
上海医用恒温设备厂
迴转式恒温调速摇瓶柜
上海欣蕊自动化设备有限公司
隔水式电热恒温培养箱
上海跃进医疗器械厂
生化培养箱
上海博迅实业有限公司医疗设备厂,型号BSP-100
FreeZone4.5L冷冻干燥机
美国Labconco公司
UV2100紫外可见分光光度计
美国UNICO公司
超净工作台
苏净集团安泰公司
荧光显微镜
日本Nikoneclipse50i
pH计
德国WTW公司,型号pH537
超声波细胞破碎仪
美国Sonics公司,型号VC750
电子分析天平
瑞士梅特勒-托利多公司产品,型号AL104
PCR仪
BIO-RAD公司产品
琼脂糖凝胶水平电泳系统
北京六一厂产品
凝胶成像系统
美国AlphaInnotech公司产品
电击转化系统
BTXHARVARDAPPARATUS,型号ECM399
台式高速离心机
美国Sigma公司产品
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