红曲霉JR产红曲色素液态发酵培养基配方的筛选资料下载.pdf
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Q933文献标识码:
AOptimizationoftheLiquid-stateFermentationMediumforMonascusPigmentProductionbyMonascuspurpureusJRHUANGLin1,MENGHui-hui1,DINGHai-yang1,SHENGCheng-cheng1,YANGLi-juan1,LIKun-tai1,23(1.CollegeofBiologicalScienceandTechnology,JAU,Nanchang330045,China;
2.NanchangKeyLa2boratoryofAppliedFermentationTechnology,Nanchang330045,China)Abstract:
Theliquid-statefermentationmediaforMonascuspigmentproductionbyMonascuspurpureusJRwereoptimized,andtheresultsshowedthatglucose,peptone,magnesiumsulfate,zincsulfateandmanga2nesesulfatewerethefavorablemediumcomponentsforthebiosynthesisofMonascuspigment.Basedonthisfact,theeffectsoftheabovecomponentsonthebiosynthesisofMonascuspigmentwerefurtherresearchedwiththemethodofrotationalquadraticorthogonalexperimentdesign.Asaresult,thepreferablefermentationmedi2umforMonascuspurpureusJRfermentationwasasfollows(g/L):
glucose33.18,peptone13.36,MgSO40.66,MnSO40.1,ZnSO40.1.ThefinalMonascuspigmentcontentunderthisfermentationmediumreached203.4U/mL,whichwas39.70%higherthanthatobtainedwiththeoriginalmediumrecipe(glucose50g/L,pep2tone10g/L,MgSO41.0g/L,MnSO40.1g/L,ZnSO40.1g/L).Keywords:
MonascuspurpureusJR;
Monascuspigments;
demandsnutrition;
liquid-statefermentation收稿日期:
2009-09-08修回日期:
2009-09-25基金项目:
江西省科技支撑计划项目(2009BGA02100)和江西农业大学博士科研启动基金资助项目(08-2064)作者简介:
黄林(1977-),男,讲师,主要从事微生物学研究,3通讯作者:
李昆太,博士,E-mail:
。
1994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:
/第6期黄林等:
红曲霉JR产红曲色素液态发酵培养基配方的筛选红曲色素是红曲霉(Monascussp.)在生长代谢过程中产生的多种天然色素的混合物。
红曲色素具有较强的耐光性、耐热性,对酸、碱、氧化剂、还原剂均较稳定,且具有色泽鲜红、着色力强、稳定性好、口味自然等优点,自古以来在我国一直用于食品的着色,而且也是我国食品法规规定允许使用的食用色素之一1,2。
近年来,不断的深入研究发现红曲霉可以产生多种功能性活性物质,如降血脂物质莫那可林(monacolin)、降血压物质-氨基丁酸(GABA)及葡萄糖胺(glucosamine),降血氨活性成分(潘红和梦那玉红)、麦角固醇、不饱和脂肪酸等3。
因此,红曲色素的研究开发对食品业以及保健行业具有重要的意义。
微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件4。
其中,培养基配方会对发酵过程产生重要的影响。
因此,必须对菌种的液态发酵培养基配方进行优化筛选,分别筛选到影响发酵水平的关键营养成分和最佳使用浓度,以便最大限度地发挥菌种的生产能力。
基于此,本文进行了红曲霉JR产红曲色素液态发酵培养基配方的筛选,以期为红曲色素产量的提高提供一定的依据。
1材料和方法1.1材料
(1)菌种。
红曲霉(Monascuspurpureus)JR:
由本实验室保存。
(2)培养基。
斜面培养基:
蔗糖20g/L,蛋白胨30g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO40.5g/L,琼脂30g/L,pH5.56.0;
种子培养基:
蔗糖30g/L,蛋白胨30g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO40.5g/L,pH5.56.0;
基本发酵培养基:
葡萄糖50g/L,蛋白胨10g/L,KH2PO41.0g/L,MgSO41.0g/L,Mn2SO40.1g/L,ZnSO40.1g/L,pH5.56.0。
(3)主要仪器。
摇床、可见分光光度计、电子天平等。
1.2方法1.2.1摇瓶培养方法
(1)种子培养。
以带玻璃珠的无菌水洗下斜面上的菌体,制成菌悬液。
取菌悬液1mL接至装量为30mL/250mL三角瓶的种子培养基中,30在摇床上振荡(180r/min)培养2d。
(2)摇瓶发酵。
按10%接种量将培养好的种子液接至装量为30mL/250mL三角瓶的发酵培养基中,28振荡(180r/min)培养120h。
1.2.2试验设计
(1)不同碳源、氮源和无机盐的筛选,采用单因素试验。
(2)葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁和硫酸锌+硫酸锰较佳组合浓度的筛选,采用二次正交旋转组合设计,供试因素和水平值的设计见表1。
表1二次正交旋转组合设计因素水平及编码值Tab.1Levelsandcodedvaluesoffactorsofrotationalquadraticorthogonalexperimentdesign因素水平值-1.6818-10+1+1.6818X1(葡萄糖)/gL-133.1840.0050.0060.0066.82X2(蛋白胨)/gL-16.648.0010.0012.0013.36X3(硫酸镁)/gL-10.660.801.001.201.34X4(硫酸锌+硫酸锰)/gL-10.07+0.070.08+0.080.10+0.100.12+0.120.13+0.131.2.3红曲色素的提取及其色阶测定5取发酵液5mL,加入=75%乙醇45mL,静置浸4h,浸提完毕后用滤纸过滤。
吸取0.5mL滤液,加入9.5mL=75%乙醇稀释20倍,以=75%乙醇作空白对照,在波长510nm处测定OD值。
将OD值乘以稀释倍数200,即为红色素色价,色价单位为U/mL。
2结果与讨论2.1红曲霉JR对碳源的需求特性研究碳源是发酵培养基中最重要的组分之一,是微生物代谢的能量来源。
为了确立红曲霉JR发酵产红曲色素的最佳碳源,分别选取50g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和大米粉作为发酵培养基中的碳源,其余成分采用基本发酵培养基配方。
红曲霉JR分别以上述4种物质为碳源进行摇瓶培养后,测定结果和经53111994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:
/江西农业大学学报第31卷方差分析的多重比较结果如表2所示。
表2不同碳源对红曲霉JR产红曲色素的影响Tab.2EffectsofvariouscarbonsourcesonMonascuspigmentcontentproducedbyMonascuspurpureusJR碳源种类红曲色素色阶/UmL-1n1n2n3MSD差异显著性(1%)葡萄糖120.4124.6129.0124.674.30A大米粉58.061.265.661.603.82B麦芽糖49.650.253.251.001.93C蔗糖19.020.022.820.601.97D由表2所示的红曲色素色阶及其差异显著性比较可以看出,葡萄糖作为发酵培养基中的碳源时,最终所得的红曲色素色阶为(124.674.30)U/mL,显著高于蔗糖、麦芽糖和大米粉为碳源下的(20.601.97)、(51.001.93)和(61.603.82)U/mL。
因此,宜选用葡萄糖作为红曲霉JR发酵培养基中的碳源。
2.2红曲霉JR对氮源的需求特性研究氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素,因此是菌体生长以及代谢产物形成所必需的。
为探索出红曲霉JR发酵培养基中的最佳氮源,分别选用10g/L的蛋白胨、玉米浆、酵母膏、黄豆饼粉、硫酸铵和硝酸钠进行摇瓶发酵,其余成分采用基本发酵培养基配方。
最终测定结果和经方差分析的多重比较结果如表3所示。
表3不同氮源对红曲霉JR产红曲色素的影响Tab.3EffectsofvariousnitrogensourcesonMonascuspigmentcontentproducedbyMonascuspurpureusJR氮源种类红曲色素色阶/UmL-1n1n2n3MSD差异显著性(1%)蛋白胨120.4124.6129.0124.674.30A硝酸钠18.820.621.420.271.33B玉米浆12.612.813.813.070.64C硫酸铵10.411.212.611.401.11CD酵母膏6.66.87.46.930.42D黄豆饼粉7.87.88.48.000.35D由表3可以看出,选用蛋白胨作为氮源,其对应的红曲色素色阶显著高于其它氮源下所得的红曲色素色阶。
因此,在所考察的这6种氮源中,蛋白胨最适于红曲霉JR发酵产红曲色素。
2.3红曲霉JR对无机盐的需求特性研究无机盐类是微生物必不可少的一类物质,它们为微生物的正常代谢提供多种重要的生理功能。
硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸锰等无机盐类对红曲霉JR发酵产红曲色素的测定结果和经方差分析的多重比较结果见表4。
表4无机盐类对红曲霉JR产红曲色素的影响Tab.4EffectsofvariousinorganicsaltsonMonascuspigmentcontentproducedbyMonascuspurpureusJR试验号无机盐添加质量浓度/gL-1硫酸镁磷酸二氢钾硫酸锌硫酸锰红曲色素色阶/UmL-1n1n2n3MSD差异显著性(1%)1000.10.161.264.669.465.074.12A21.000055.255.858.456.471.70B3000042.845.647.045.132.14C401.00033.235.837.035.331.94D由表4所示的结果可以看出,当发酵培养基中添加1.0g/L磷酸二氢钾时,其最终所得的红曲色素63111994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:
红曲霉JR产红曲色素液态发酵培养基配方的筛选色阶为(35.331.94)U/mL,还显著低于不添加任何无机盐类方案下的(45.132.14)U/mL。
由此可见,磷酸二氢钾对红曲霉JR合成红曲色素表现出一定的负效应。
而添加1.0g/L硫酸镁、0.1g/L(硫酸锌和硫酸锰)所得的红曲色素色阶均显著高于不添加任何无机盐类的试验方案。
因此,1.0g/L硫酸镁、0.1g/L(硫酸锌和硫酸锰)对红曲色素的合成具有显著的促进作用。
2.4葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁和硫酸锌+硫酸锰较佳组合质量浓度的筛选结果以上考察红曲霉JR对碳源、氮源和无机盐需求特性的实验结果表明,宜选用葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、硫酸锌和硫酸锰作为发酵培养基的组分。
由于发酵培养基配方对发酵水平的提高具有非常重要的作用,目前已广泛应用正交实验设计、响应面设计6以及均匀设计7等优化方法对发酵培养基配方进行考察优化,效果非常显著。
DPS数据处理系统(dataprocessingsystem)也是一种强有力的培养基优化软件,它不仅包含实验设计方法,而且还可以对实验结果进行有效的统计分析8,目前已成功地应用于许多发酵培养基的考察和优化中9。
鉴于此,本文应用DPS软件(DPSv7.05版)的二次正交旋转组合实验设计方法对这些因素进行进一步考察,以放瓶时的红曲色素色阶为实验考察目标。
具体的实验设计及其结果见表5。
表5二次正交旋转组合设计方案及实验结果Tab.5Experimentaldesignandresultsofrotationalquadraticorthogonalexperimentdesign组数X1(葡萄糖)X2(蛋白胨)X3(硫酸镁)X4(硫酸锌+硫酸锰)红曲色素色价/UmL-111111140.4211-1-1158.231-11-191.441-1-1185.45-111-1187.26-11-11137.47-1-111113.08-1-1-1-186.09-1.6818000115.6101.6818000187.6110-1.68180055.41201.681800182.81300-1.68180152.214001.6818087.215000-1.681848.4160001.681872.8170000150.0180000144.6190000143.2200000150.4210000140.4220000142.6230000138.8根据表5所示的实验结果,为了直观地说明葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁和微量元素(硫酸锌、硫酸锰)对红曲色素色阶的影响,用DPS软件作出以两两自变量互作效应的三维曲面图,如图1所示:
73111994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:
/江西农业大学学报第31卷图1响应曲面函数的三维图Fig.13Dchartfortheresponsefunction图1-a显示了葡萄糖与蛋白胨的交互作用,发酵培养基中蛋白胨浓度对红曲色素色阶影响极大,而葡萄糖没有表现出明显的影响,当蛋白胨由6.64g/L逐渐增加至13.36g/L时,红曲色素色阶呈显著的上升趋势;
图1-b显示了葡萄糖与硫酸镁的交互作用,在实验值范围内,二者的交互效应也不显著;
图1-c显示了葡萄糖与微量元素的交互作用,发酵培养基中微量元素浓度对红曲色素色阶影响较大,而葡萄糖没有表现出明显的影响,当微量元素为0.1g/L,红曲色素色阶达到最高;
图1-d显示了蛋白胨与硫酸镁的交互作用,硫酸镁对红曲色素色阶没有表现明显的影响,而蛋白胨呈现明显的正效应;
图1-e显示了蛋白胨与微量元素的交互作用,当发酵培养基中微量元素的浓度在中心点,蛋白胨的浓度为最大值时,红曲色素色阶达到最大;
图1-f显示了硫酸镁与微量元素的交互作用,硫酸镁对红曲色素色阶没有表现明显的影响,微量元素的浓度在中心点,红曲色素色阶达到最大。
由以上结果可以说明,发酵培养基中蛋白胨以及微量元素的用量对红曲色素色阶影响显著,而葡萄糖以及硫酸镁没有表现出明显的效应。
综合各因素之间的交互效应,可对获得较高红曲色素色阶的发酵培养基配方进行预测:
蛋白胨在实验值范围内宜选用最大水平值(+1.6818),即浓度为13.36g/L;
微量元素的浓度可控制在中心点(0),即浓度为0.1g/L;
另外,发酵培养基中的葡萄糖和硫酸镁在实验值范围内没有表现明显的效应,考虑到培养基成本,二者的浓度在实验值范围内均可选用最小水平值(-1.6818),即浓度为33.18g/L和0.66g/L。
因此,由二次正交旋转组合设计所推测出的红曲霉JR产红曲色素的较佳发酵培养基配方为:
葡萄糖33.18g/L,蛋白胨13.36g/L,MgSO40.66g/L,MnSO40.1g/L,ZnSO40.1g/L。
对该发酵培养基配83111994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:
红曲霉JR产红曲色素液态发酵培养基配方的筛选方进行发酵验证,放瓶时的红曲色素色阶达到203.4U/mL,比二次正交旋转组合实验设计中的初始发酵培养基配方(葡萄糖50g/L、蛋白胨10g/L、MgSO41.0g/L、MnSO40.1g/L、ZnSO40.1g/L)下的红曲色素色阶(145.6U/mL)提高了将近39.70%。
3结论本文对红曲霉JR产红曲色素的营养需求特性进行了初步研究:
(1)考察了红曲霉JR对碳源的需求特性,结果表明在所选用的碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和大米粉)中,葡萄糖最利于红曲色素的合成。
(2)考察了红曲霉JR对氮源的需求特性,结果表明在所选用的氮源(蛋白胨、玉米浆、酵母膏、黄豆饼粉、硫酸铵和硝酸钠)中,蛋白胨最利于红曲色素的合成。
(3)考察了红曲霉JR对无机盐的需求特性,结果表明磷酸二氢钾对红曲色素的合成具有一定的负作用,硫酸镁、硫酸锌和硫酸锰则具有显著促进作用。
(4)根据考察红曲霉JR营养需求特性所得到的实验结果,应用二次正交旋转组合实验设计方法对发酵培养基选用的葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、硫酸锌和硫酸锰进行了进一步考察。
结果表明,发酵培养基中蛋白胨以及微量元素的用量对红曲色素色阶影响显著,而葡萄糖以及硫酸镁没有表现出明显的效应。
综合各因素之间的交互效应,获得的较佳发酵培养基配方为:
葡萄糖33.18g/L,蛋白胨13.36g/L,Mg2SO40.66g/L,MnSO40.1g/L,ZnSO40.1g/L。
该发酵培养基配方下红曲色素色阶达到203.4U/mL,比二次正交旋转组合实验设计中的初始发酵培养基配方(葡萄糖50g/L、蛋白胨10g/L、MgSO41.0g/L、MnSO40.1g/L、ZnSO40.1g/L)下的红曲色素色阶(145.6U/mL)提高了将近39.70%。
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491-498.93111994-2012ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:
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