酵母菌的培养与分离Word格式.docx
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取一小块果皮,不需冲洗,直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中,置2
8—30C,培养24小时,可见培养液变混浊。
2、培养,用无菌吸管取上述培养后培养液0、1ml,注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,置28一30C再培养24小时或稍长(过长则霉菌长出)。
3、观察:
用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央得0、1%美蓝染色液中,混匀后加盖玻片制成水浸片,先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌得形态与出芽生殖情况.
活酵母菌可使美蓝还原,从而使菌体不着色,用此方法可判断酵母菌得死活。
4、分离:
马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板•用划线法分离酵母菌培养液,
从而得到单个菌落.挑取单个菌落反复再次划线分离纯化,最终可获得纯培养。
六、实验注意事项
1、配制培养基时,应注意琼脂得加量,不同规格及批次得琼脂得加量应由实验确定,不能照搬书上得加量。
2、对培养基加热时应注意琼脂得糊底与暴沸.
3、灭菌锅操作时,首先应注意水一定要加足够,排气要彻底,其次灭菌期间不要离开人,灭菌结束后,关闭电源,拔掉插头,最后放气一定要缓慢,均匀,气放彻底才能开锅,取锅内物品,应小心,防止烫伤。
4、接种前应注意无菌工作台得消毒与杀菌,接种时应注意手与接种工具得消毒。
七、实验结果得观察及记录
1、24小时,观察试管内培养液得情况并作记录,每组转接2支试管.
2、48小时,观察试管内培养液得情况,镜检培养液内菌得数量,粗略判断就是否为酵母菌并作记录,每人蘸取培养液进行划线分离,并作记录.
3、72小时后,观察培养皿内菌得生长得情况,挑取单个菌落进一步划线分离,直到为纯菌落。
4、每组转接10支斜面试管,备用。
八、实验得延伸
自然条件下酿造苹果酒,葡萄酒、猕猴桃酒.
七实验报告要求
1、实验完毕后,每位同学都应独立作出实验报告,实验报告应类似于小型论文格式。
2、实验报告内容包括:
(1)立题意义。
(2)实验设计.
(3)实验步骤详细记录。
(4)对实验结果得分析讨论与总结。
(5)实验延伸。
(6)实验心得体会。
附1:
果酒得酿制方法
-、目得要求了解果酒酿制原理,学习苹果酒酿制技术。
二、基本原理果酒就是一类营养丰富、含酒精度低得上乘饮料。
它就是用含一定糖分与水分得果实压汁,经微生物发酵而成.其生化作用,除酒精发酵得主产物外,还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等得形成;
同时,陈酿期中,各种酸类与醇类得酯化反应,赋予果酒特殊得香味;
果酒中得单宁、色素、果屑微粒及蛋白质(包括酵母尸体)等得氧化与下沉,使酒液澄清、风味增浓。
各种果酒以原料而称名。
除坚果外,所有栽培果,野生果均可做酿果酒得原料。
本实验以苹果酒为例,学习其酿制方法.
三、实验材料
1、菌种在7°
Be'
麦芽汁琼脂斜面培养基上得葡萄酒酵母(s、cerevisaeellip
soieleus).
2、器材苹果汁培养基,7°
麦芽汁培养基,10ml/管、100ml/三角瓶等装量,白糖,食用酒精,亚硫酸,果胶酶,发酵缸,破碎机,果汁分离器等.
a、苹果汁培养基
粗滤新鲜果汁(蔗糖调至13°
Be,酸度0、5%以下)1000ml
K2HPO40。
1gMgSO4-7H2O0.1g
配好后,加热煮沸3~5分钟,静置10小时以上,过滤、分装,0.7Kg/cm2灭菌2
0分钟
四、实验步骤
(一)酒母培养
1、菌种活化(一级种)取装有10ml苹果汁或7°
麦芽汁培养基1支,按无菌操作法接种葡萄酒酵母菌一环,混匀后置28~30°
C下培养2〜5天(用苹果汁活化菌种时需培养5天以上),镜检酵母繁殖良好,无杂菌即可。
2、母发酵剂制备(二级种)在装有100ml苹果汁培养基得三角瓶中,接1〜
2m1经活化得葡萄酒酵母菌液,于28C下培养2~3天,当培养液表面有气泡产生,嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。
3、生产发酵剂得制备(三级种)方法与母发酵剂相同,只就是采取更大得容器。
一般采用500~1000ml得三角瓶或卡氏罐,盛装占容积1/2〜3/5得果汁培养液,灭菌冷却后,按10%接种量接人母发酵剂,在25〜28C下培养24〜48小时,待发酵正常,镜检无杂菌方可使用。
4、如果使用活性干酵母,添加量为20g/L发酵醪,复水用水量就是干酵母重量得5~10倍.复水用水得温度应保持在40C左右(38〜43C),将酵母静置5~10min后搅拌,酵母在水中得时间不能超过30min。
然后使酵母溶液缓慢冷却到与将被接种发酵醪得温差小于10C,然后直接加入发酵醪。
(二)果酒生产
工艺流程如下:
果胶酶
苹果一分选除杂下清洗一破碎一压榨一粗果汁一果楂、苹果酸、丹宁
活化酵母f母发酵剂f生产发酵剂
蔗糖f发酵f皮渣分离f后发酵f原酒f
f换捅除渣f贮存陈酿f配制f贮存f澄清过滤f装瓶f巴氏灭菌f封口f成品。
(2~3次)
操作要点:
1、分选取成熟苹果,除去腐烂、干疤与伤果。
2、清洗清水充分洗涤,除去果皮上得污物、杂质及药剂,以保证原料干净卫生。
3、破碎为易于压榨,提高出汁率,需进行破碎.用破碎机破碎至果块粒度0。
5cm3左右,并除去果籽。
4、压榨分离破碎后立即进行压榨分离。
分离出得果汁中不得夹带果肉,同时需
添加适量苹果酸调整含量(要求果汁总酸含量为5g/L),并加入0、1~0.15g/L得果
胶酶,促进果胶分解,使果汁澄清并提高酒得风味。
由于苹果汁易被自身含有得多酚氧化酶氧化,故需加SQ还原剂抑制酶活性,同时SO也具有杀菌、防腐与澄清果汁作用。
SQ来源,除工厂应用液态SQ外,实验室常加入亚硫酸钠(NazSQ)与偏重亚硫酸钾(K2S2Q),其用量为果汁量得0、02%即可。
5、前发酵取澄清果汁放入经干热灭菌得发酵缸中,装量占缸容积得4/5,按3
~5%得接种量接入酵母生产发酵剂进行发酵,保持品温在18〜22C之间,最高勿超过2
5C,发酵应在7~12天内结束。
一般苹果汁糖分约为11%经发酵后,酒精含量约达6%以上,前发酵结束后,原酒酒度应大于8%(V),残糖<20g/L,总酸(苹果酸)>5g/L.
6、后发酵前发酵结束后,迅速将酒液与皮渣分离,酒汁转入经干热灭菌得发酵缸中,进行后发酵,使残糖继续分解。
期间,控制品温在18〜22C之间,不要超过25C,时间1个月,即得原酒。
要求残糖含量小于2g/L以下,挥发酸(以醋酸计)小于0。
6g/L,总酸(以苹果酸计)大于5g/L。
7、换桶除渣为使已澄清得原酒与其酒脚(沉淀物)及时分离,以免酒脚产生异味而影响酒质,故需进行换桶(缸)。
换桶次数新酒每年换三次.
8、贮存陈酿应满桶贮存。
陈酿即酒得老熟,经长期密闭贮存,可使酒质澄清、风味醇厚。
贮存室温8〜16C,存期半年以上。
9、配制原酒贮存半年后可开始配制。
配制时,按工艺规定将不同原酒按一定配比相混,然后添加适量得糖、酒精、继续贮存半年以上。
10、澄清过滤可采用冷冻法使其澄清,即于-4C左右存放7天,然后冷过滤•澄
清后得酒置-5~-7C下冷冻3天不发生混浊沉淀,或暴露空气中氧化4天不变混浊即为合格.
11、装瓶灭菌装瓶后需进行巴氏灭菌,即在63C下处理15分钟,冷却后封口保
存。
五、实验报告
1、简述苹果酒得酿制法.
2、二氧化硫在果酒酿制中得作用就是什么?
六、思考题
1、酵母菌酿酒得原理就是什么?
2、果酒酿制中为何要加入果胶酶?
实验二酵母菌得鉴定
酒精生产中所用酵母菌在微生物学中得分类依据就是什么
微生物学得类别分门、纲、目、科、属、种,生产酒精用酵母菌属于微生物中得真菌门、子囊菌纲、原子囊菌亚纲、内孢霉目、内孢霉科、啤酒酵母属、卡尔斯伯酵母属等。
酵母菌得分类依据就是根据它得形态特征、生理生化反应特征来确定得。
在分类前将菌体细胞进行分离纯化,得到由单细胞长成得菌落,然后再进行形态特征与生理生化鉴定。
(一)形态特征得鉴定
把酵母菌接种到麦芽汁固体培养基上,让它长成菌落,观察其菌落得形态、颜色、质地、边缘、表面等特征。
把它再接种到液体麦芽汁培养基中,观察就是否能产生醭、
试管或培养仪器表面壁上能否形成菌环,培养液中就是否产生沉淀、混浊程度等。
另外,还要取样在显微镜下观察其单细胞得形态、大小、能否形成孢子、孢子得大小以及繁殖方式等.
(二)生理生化特征得鉴定酵母菌得生理生化特征主要表现为发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖类得能力.同时,还需测定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精,利用硝酸盐还就是硫酸盐,发酵产酸、产醋、耐温、耐酸、抗重金属离子、抗杂菌性等得能力.最后,根据以上得出得形态特征与生理生化特征,查阅有关资料,把具有相同特征得一类酵母菌,就可以归属于某一属.
怎样鉴定酵母菌在液体培养基中得培养特征?
将酵母菌种接种于米曲汁或麦芽汁液体培养基中,放于恒温培养箱内以28-30°
C保
温培养18—24、24—48、48-72小时,取出观察各个时期液体培养基表面有无白色浮膜物—醭得存在,各个不同时期培养基中有无沉淀或沉淀得多少、有无混浊与混浊程度、试管或其它培养器壁上有无菌环形成,最后取出各个不同时期得样液,注入酵母细胞计数器-—血球计中,放置显微镜下观察单个细胞得形态变化情况、液泡得大小、细胞数增加得多少以及培养基中pH值得变化情况等,并测定其酒精与二氧化碳得生产量。
然后根据不同得反应情况,作好详细得原始记录,便于以后培养菌种时比较与参考。
酵母菌生理生化试验
一、酵母菌糖发酵试验
(一)实验目得了解鉴别酵母菌得实验方法。
(二)实验原理
酵母菌在厌氧条件下能分解糖类,产生各种有机酸、气体与其它产物。
酵母菌种类不同对各种糖类得发酵能力各异.因此,这就是鉴别酵母菌种类得一项重要依据。
酸得产生可根据培养基中溴甲酚紫(pH6、8-5、2由紫变黄)或溴麝香草酚蓝(pH7、6—6、0由蓝变黄)指标剂颜色得改变来确定。
产气可由发酵管气泡得产生予以证实。
(三)材料
糖发酵基础液,1、6%溴甲酚紫或0、2%溴麝香草酚蓝溶液,葡萄糖、乳糖、半乳糖与麦芽糖,啤酒酵母斜面菌种.
(四)实验内容
1、糖发酵基础液配制好后,按培养液容量得1%7卩入糖,分装于杜氏发酵管中(培养液得高度约为4—5厘米),再在试管内加入倒置得小玻管(约0、4X2、0—2、5厘米)一支。
每种糖设三个重复管,〈121C>高压灭菌15分钟。
2、将酵母分别接入上述各发酵管中,置〈30C〉下培养48—72小时,另以不接种者作对照
3、如产酸则培养液pH值下降而变黄色;
如产气,则必先产酸,并在杜氏小管顶端出现气泡.
4、结果记录。
以“”表示产酸,“<0"
〉表示产气,“+”表示产酸产气,“—”表示无变化,“碱”表示产碱。
二、酵母菌碳源同化试验
(一)实验目得了解酵母菌对各种碳源得利用情况。
(二)实验原理
碳就是酵母菌细胞得重要组成成分,约占酵母菌体重量得50%,为酵母菌生命活动提供所需得能量与组成其结构得物质。
酵母菌对各种碳源得利用,因种类不同而异。
这就是酵母菌分类鉴定得一个重要依据.
(三)材料
无碳基础培养基,啤酒酵母斜面菌种,0、5%得葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖溶液.
1、液体试管法
(1)每管加无碳基础培养基5毫升,加被测试得某种碳源,并以葡萄糖作为对照。
(2)接入啤酒酵母,<28C〉下培养1—2周,观察结果.
2、生长图谱法
(1)无碳培养基内加入2%寻水洗琼脂,融化后冷却至45〈-50C〉,到至平板。
(2)接种新鲜培养得啤酒酵母于1毫升无菌生理盐水内,搅匀后倒入上述未凝平板内,摇匀待凝。
(3)皿底用特种蜡笔写上被测试各种碳源得标记。
(4)用不锈钢匙,按标记加入相应得米粒大小得碳源,并以葡萄糖作对照。
(5)<
28°
C〉下培养24—48小时后观察结果.
3、结果观察
(1)液体试管中就是否形成醭,环岛等。
(2)生长图谱中测量菌落大小,说明对碳源得利用情况.
三、酵母菌氮源同化试验
(一)实验目得了解酵母菌对各种氮源得利用情况。
(二)实验原理酵母菌蛋白酶不分泌于菌体外,故酵母菌对复杂得蛋白质不能利用,酵母菌对一些较简单得含氮化合物得利用程度也不一致。
无氮基础培养基,啤酒酵母斜面菌,0、5%得蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵与尿素溶液.(四)实验内容
1、液体试管法方法同二,以被测试得氮源代替碳源,不加任何氮源作空白对照.
2、生长图谱法
方法同二,以被测试得氮源代替碳源,不加任何氮化物作空白对照。
3、结果观察
(1)液体试管中溶液pH值得变化。
(2)生长图谱中测量形成菌落得大小,说明对各种氮源得利用情况.
四、酵母菌生长曲线得测定试验
(一)实验目得掌握单细胞微生物群体生长曲线得几种测定方法.
(二)实验原理
酵母菌属于单细胞真核型微生物,把一定数量得酵母菌接种于得液体培养基中,在适宜得温度下培养时,它得生长过程具有一定得规律性。
在其生长过程中,定时取样测定酵母菌细胞数量,然后以酵母菌细胞数得对数作纵坐标,生长时间作横坐标,绘制所得得曲线叫生长曲线.此生长曲线大致可划分为四个阶段:
调整期、对数生长期、稳定期与衰退期。
酵母菌增殖培养基,苹果酒酵母斜面菌种.
(四)实验内容
1、将培养24小时左右得酵母斜面菌种,用无菌水洗下菌苔,以3000转/分得速率离心,
得菌体。
将酵母菌体沉淀物再用无菌水洗2—3次后,制备酵母菌悬液(细胞数量约10
6左右/毫升),测数备用。
2、取上述菌悬液1毫升于盛有清亮得酵母增殖培养液得试管中,〈25C>下培养,以此为起始时间,记录起始溶液得细胞数。
并在培养1,2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,20,22,24小时时分别取样检测酵母菌细胞数量.
3、酵母菌细胞数量得检测
方法①:
活菌计数法。
此法就是将以上定时取出得被检样品作一系列稀释后,取一定量体积(在0、1-1毫升之间)得稀释液涂布于盛有固体培养基得培养皿内,在<25C〉下培养24小时左右,计算培养皿内菌落数就可测出溶液中活菌数量。
方法②:
血球计数板计数法。
此法就是先将以上定时取出得被检样品作一系列稀释后,使菌落数约为105—106个/毫升,取一滴稀释液滴于血球计数板内,在显微镜下直接计算细胞总数.
4、绘制生长曲线
以酵母菌细胞数得对数作为纵坐标,以培养时间作为横坐标,画出酵母菌得生长曲线。
并分析酵母菌群体得生长规律.
五、实验结果得观察及记录(见表1-2)
六、思考题
1、为什么碘液反映无色糖化即可结束?
2、煮沸强度对麦芽汁质量有什么影响?
表1酵母菌分属鉴定结果
菌种号
形态特征
生理特征
群体
个体
假菌丝
子囊孢子
葡萄糖
发酵
类淀粉化合物得生成
硝酸钾同化
肌醇同化
其她
巨大菌落
沉淀
瞨
环
岛
细胞形状大小
无性繁殖方式
Kleyn
Gorodkowa
马铃薯块
石膏块
表2酵母种得鉴定结果记录
菌株
糖发酵
糖同化
菌落
瞨膜
细胞形态大小
假菌丝
子囊孢子
葡萄糖
乳糖
半乳糖
麦芽糖
蜜
糖
蔗糖
棉子糖
纤维
海藻糖
L
阿拉伯糖
D
木糖
可溶性淀粉
山梨糖
氮源同化
醇类同化
在无维生素培养基上生长
维生素需要
硝酸钾
硫酸铵
乙醇
甘油
山梨醇
卫矛醇
赤藓醇
阿东醇
肌醇
甘
露醇
牛奶反应
油脂分解
抗放线菌酮
产生类淀粉
于
3
7C
生长
耐高渗透压
生物素
微生素
Bi
B2
B6
微
生素
Bi
2
叶酸
烟酸
泛酸钙
对氨基苯甲酸
附1麦芽汁培养基得制备:
麦芽汁制备俗称糖化.所谓糖化就是指将麦芽与辅料中高分子贮藏物质(如蛋白质、淀粉、半纤维素等机器分解中间产物)通过麦芽中各种水解酶类(或外加酶制剂)作用降解为低分子物质并溶于水得过程。
溶解于水得各种干物质称为浸出物,糖化后未经过滤得料液称为糖化醪,过滤后得清夜称为麦芽汁,麦芽汁中浸出物含量与原料干物质之比(质量分数)称为无水浸出率.
方法一
⑴取50g麦芽,在EBC标准磨上粉碎;
(2)将已经粉碎好得麦芽粉放入已称重得糖化杯中,加200mL46C水,不断搅拌并在46C
水浴中保温30min;
(3)使醪液以1C/min速率升温到70C。
此时杯内加入100mL70S水,保持恒温.
(4)5min后用玻璃棒取麦芽汁1滴,置于白滴板上,再加碘液1滴,混合后观察碘液颜
色变化。
直到碘液呈纯黄色不再变色,停止保温,糖化结束。
(5)在10~15min内急剧冷却到室温;
(6)冲洗搅玻璃棒拌器,擦干糖化杯外壁,加水使其内容物准确称量为450g;
(7)用玻璃棒搅拌糖化杯,并注于漏斗中进行过滤,即获得麦芽汁。
方法二
称取市售麦芽粉或大麦经浸泡、发芽、干燥、粉碎得麦芽粉,按每Kg麦芽粉加入60-65C
温热水3、5-4kg.于55-60C保温糖化3-4小时,用碘液检查,然后4层纱布过滤,过滤液中加鸡蛋白加水20mL,调匀之生出丰富得泡沫为止,然后倒在糖化液中搅拌煮沸后用4层纱布过滤,即得到澄清、透明得麦芽汁,灭菌后方可备用.
附2酵母菌鉴定常用培养基
1、酵母菌生孢培养基
(1)麦氏琼脂
葡萄糖1g
KCL1.8g
酵母浸膏2.5g
醋酸钠8°
2g
琼脂12g
蒸馏水1000ml
115C灭菌20min
(2)胡萝卜培养基
将葫萝卜切成得6~7cm得长条,下后上薄,装入培养管中,加水1ml,杀菌,即成.
(3)Gorodkowa氏培养基
消化蛋白1g
葡萄糖0•1g
氯化钠0.5g
琼脂1o2g
水100ml
2.12.5%豆芽汁培养基
黄豆芽125g加1L,煮沸半小时,过滤后补足水至1Lo115C灭菌30min
3.0。
6%酵母浸汁
加60g干酵母粉于1L水中,必要时加入一些蛋清以澄清滤液层滤纸过滤;
115C火菌15min.
121C火菌15min,趁热用双
4、同化碳源基础培养基
(NH4)2SO0、5%,KH2PO"
、1%MgSO—7HO0、05%,酵母膏0、02%,水洗琼脂2%
115°
C灭菌15min
同化碳源液体培养基
(NT)2SO40、5%KHPO4,MgSO4—7HO0O5%CaCl2-母膏0、02%,糖或其它碳
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