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取3.0g果肉组织,加入3mL冷丙酮,冰浴磨成匀浆后于4℃下12,000×
取1mL上清液,加入100µ
L20%的四氯化钛溶液(溶于浓盐酸,V/V)和200µ
L浓氨水,混匀反应5min后离心15min。
沉淀部分用冷丙酮洗涤4次以减少色素的干扰,最后将沉淀溶于1.5mL1mmol/LH2SO4溶液中,于410nm测定溶液的吸光度值。
按同法作H2O2标准曲线。
H2O2含量以nmol·
min-1gFW-1表示。
ProchazkovaD,SairamRK,SrivastavaGC,etal.Oxidativestressandantioxidantactivityasthebasisofsenescenceinmaizeleaves.PlantSci.2001,161:
765-771.
3.细胞膜完整的测定
参照LesterandBruton(1986)的方法并修改。
分别于处理后0、2、4、6、8、10天在果实的赤道部位取皮下3-5mm处果肉组织10g,用无离子水充分冲洗3次后,置于滤纸上吸干多余水分,放入含40mL无离子水的烧杯中,用电导率仪测其初始和3h后(25℃)的电导率。
然后将烧杯及组织在95℃下水浴30min后测定最终的电导率。
细胞膜完整率由下式计算:
细胞膜完整率(%)=[1-(3h后电导率/最终电导率)]×
100%
LesterGE,BrutonBD.Relationshipofnettedmuskmelonfruitwaterlosstopostharveststoragelife.J.Amer.Soc.Hort.Sci.1986,111,727-731.
4.丙二醛(MDA)含量测定
参照Hodgesetal.(1999)的方法并修改。
取3.0g果肉组织,加入5mL100g/L三氯乙酸(TCA)溶液研磨成匀浆后,于4℃12,000×
g条件下离心20min。
取2mL上清液(对照空白管中加入2mL100g/LTCA溶液代替提取液),加入2mL0.67%的2-硫代巴比妥酸(TBA)溶液(用TCA配制),混合后煮沸20min,取出冷却后再离心一次。
分别测定反应液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值,按下式计算反应混合物中MDA的浓度,然后计算出果实样品中MDA含量。
MDA含量用每克鲜重所含的丙二醛含量表示(以µ
mol·
gFW-1表示)。
反应液中CMDA(mol/L)=6.45×
(OD532-OD600)-0.56×
OD450
丙二醛含量
式中CMDA—反应混合液中丙二醛浓度,µ
mol/L;
V—样品提取液总体积,mL;
Vs—测定时所取样品提取液体积,mL;
m—样品质量,g
HodgesDM,DeLongJM,ForneyCF,etal.Improvingthethiobarbituricacidreactive-substanceassayforestimatinglipidperoxidationinplanttissuescontaininganthocyaninandotherinterferingcompounds.Planta.1999,207:
604-611.
5.NADPH氧化酶活性测定
参照Morreetal.(2000)方法提取细胞膜微膜囊。
取3.0g果肉组织,加入5mL提取液,在冰浴中充分研磨,用四层纱布过滤,滤出液于4℃、7500r/min离心15min,上清液于4℃、18000r/min离心40min,沉淀用1mL悬浮液稀释,得到粗的细胞膜微膜囊提取液。
其中,提取液含:
25mmol/LMes-Tris(pH7.8)、0.25mol/L蔗糖、3mmol/LEDTA、0.9%PVP、5mmol/LDTT、1mmol/LPMSF;
悬浮液含:
5mmol/LTris-Mes(pH7.8)、0.25mol/L蔗糖、5mmol/LKCl、5mmol/LDTT、1mmol/LPMSF。
NADPH氧化酶活性测定:
参照Sagi等(2001)方法并修改。
采用上述胞膜微膜囊,通过NADPH氧化酶产生的活性氧氧化XTT的量来表示该酶活性。
反应体系由2mL50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5),0.5mmol/LXTT,100µ
mol/LNADPH和200µ
L的细胞膜微膜囊组成,最后加入NADPH启动酶促反应,以蒸馏水作参比,记录反应体系2min内在470nm处吸光度值的变化,酶活性表示为△OD470/min/mgprotien。
SagiM,FluhrR.Superoxideproductionbyplanthomologuesofthegp91phoxNADPHoxidase.Modulationofactivitybycalciumandbytobaccomosaicvirusinfection[J].plantPhysiology,2001,126(3):
1281-1290.
6.超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性测定
粗酶液的提取:
参照LacanandBaccou(1998)的方法并修改。
取3.0g果肉组织,加入3mL100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5,含5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)和2%PVPP(W/V)),冰浴条件下研磨成匀浆后于4℃、12,000×
g离心30min,上清液立即用于酶活性测定。
LacanD,BaccouJ.Highlevelsofantioxidantenzymescorrelatewithdelayedsenescenceinnonnettedmuskmelonfruits.Planta,1998,204:
377-382.
SOD的活性测定:
参照OberleyandSpitz(1985)的方法并修改。
取5mL指形管4支,2支为测定管,另2支为对照管,依次加入1.5mL50mmol/L磷酸缓冲液、0.3mL130mmol/L甲硫氨酸(MET)溶液、0.3mL750µ
mol/L氮蓝四唑(NBT)溶液、0.3mL100µ
mol/LEDTA-Na2溶液、0.3mL粗酶液,最后加入0.3mL20µ
mol/L核黄素。
其中对照2支管以缓冲液代替酶液,混匀后将1支对照管置于暗处,其它各管于4000LUX日光灯下反应15min。
至反应结束后,以不照光管做空白参比,于560nm处分别测定其它各管的吸光度值。
SOD活性以每毫克蛋白抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原的50%为一个酶活性单位(U·
mgprotein-1)表示。
OberleyL,SpitzD.Nitrobluetetrazolium.In:
GreenwaldW.A.(ed.).Handbookofmethodsofoxygenradicalresearch.CRCpress,BocaRaton,5Fla.pp.1985,217-220.
CAT的活性测定:
参照Clairbone(1985)的方法并修改。
反应体系包括2mL10mmol/LH202(用50mmol/L、pH7.5的磷酸缓冲液配制)和200µ
L粗酶液。
在240nm处测定2min内样品的吸光值。
CAT活性以△OD470·
min-1·
mgprotein-1表示。
ClairboneA,Catalaseactivity.In:
GreenwaldW.A.(ed.)Handbookofmethodsofoxygenradicalresearch.CRCpress,BocaRaton.,1985,5Fla.pp:
283-284.
7.过氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)活性的测定
粗酶液制备:
取3.0g果肉组织,加入3mLpH7.5的50mmol/L磷酸提取缓冲液(内含4%PVPP(W/V),1mmol/L聚乙二醇,1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),0.01%TritonX-100(V/V)),冰浴条件下研磨成匀浆,4℃、15,000×
g离心20min,取上清液为各自粗酶液。
POD活性测定:
参照Venisse(2002)等的方法并修改。
POD反应体系为2.5mL0.025mol/L愈创木酚、0.2mL0.25mol/LH2O2和0.2mL粗酶液。
加酶液后1min开始记录反应体系每分钟的吸光值变化,连续测定2min。
以每小时吸光值变化0.01为1个活性单位(U)。
POD活性表示为U/mgprotein。
重复测定3次。
VenisseJS,MalnoyM,FaizeM,etal.ModulationofdefensesofMalusspp.duringcompatibleandincompatibleinteractionswithErwiniaamylovora[J].Mol.Plant-MicrobeInter.,2002,15:
1204-1212.
PPO活性测定:
参照Chenetal.(2000)的方法并做修改。
PPO反应体系包括2mL0.05mol/LpH7.0磷酸缓冲液、0.5mL0.05mol/L邻苯二酚和0.2mL粗酶液。
加酶液后1min于420nm处开始记录反应体系每分钟的吸光值变化,连续测定2min。
酶活性以每分钟内吸光度变化0.01为1个活性单位(U)。
样品重复测3次。
ChenC,Bé
langerRR,BenhameuN,etal.Defenseenzymesinducedincucumberrootsbytreatmentwithplantgrowth-promotingrhizobacteria(PGPR)andPythiumaphanidermatum[J].Physiol.Mol.PlantPathol.2000,56:
13-23.
二苯丙烷代谢相关酶活性及代谢产物含量测定
1.总酚和类黄酮含量的测定
参照PirieandMullins(1976)的方法。
取3.0g果肉组织,加入5mL预冷的1%HCl–甲醇在冰浴条件下充分研磨提取,4℃、12,000×
g离心10min。
取上清液分别于280nm和325nm测定总酚和类黄酮含量。
总酚含量表示为OD280·
gFW-1;
类黄酮含量表示为OD325·
gFW-1。
样品重复测定3次。
PirieA,MullinsMG.Changesinanthocyaninandphenoliccontentofgrapevineleafandfruittissuetreatedwithsucrose,nitrateandabscisicacid[J].PlantPhysiol.,1976,58:
468-472.
2.木质素含量的测定
参照Morrison(1972)方法并修改。
取3.0g果肉组织与预冷的5mL95%乙醇研磨,4℃、12,000×
g离心10min,沉淀物用95%乙醇冲洗3次,再用乙醇:
正己烷=1:
2(V/V)冲洗3次,收集沉淀使其干燥,干燥物溶于1mL25%溴化乙酰冰醋酸溶液中,70℃恒温水浴30min,然后加1mL2mol/LNaOH中止反应。
再加2mL冰醋酸和0.1mL7.5mol/L羟胺盐酸,离心,取上清液0.02mL,用冰醋酸定容至5mL,280nm下测定样品吸光值,样品重复测3次。
木质素含量以OD280·
gFW-1表示。
MorrisonIM.Asemi-micromethodfromthedeterminationofliginanditsuseinpredictingthedigestibilityofforagecrops[J].Sci.FoodAgric.,1972,23:
455-463.
3.苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定
参照曹建康(2007)方法并修改。
取3.0g果肉组织,加入5ml经4℃预冷的0.1MpH8.8的硼酸缓冲液(含10%(w/v)PVPP,1mMEDTA和50mMβ-巯基乙醇)在冰浴条件下研磨匀浆,然后于4℃、11250r/min离心20min,收集上清液并立即用于酶活性测定。
酶促反应体系为:
取三支试管分别标记为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,然后向Ⅰ和Ⅱ两支试管分别加入3ml7mML-苯丙氨酸溶液(用50mM硼酸缓冲液配制)并在37℃水浴保温5min,之后向Ⅰ和Ⅲ两只试管中分别加入500µ
L粗酶液立即37℃水浴保温1h,保温完后立即在290nm下测定其吸光度值,以Ⅱ和Ⅲ混合后测定的吸光度值为初始值,Ⅰ中测定值为终止值。
以提取液代替酶液按照上述方法测得的吸光值分别作为初始值和终止值的对照。
每小时吸光值变化0.01为1个活性单位(U)。
PAL活性表示为U/mgprotein。
曹建康主编.果蔬采后生理生化实验指导[M].中国轻工业出版社,2007
4.4-香豆酰-辅酶A连接酶(4CL)活性测定
参照朱明华等(1990)方法并修改。
取3.0g果肉组织,加入3mL0.2mol/LTris-HCL缓冲液(含25%甘油、0.1mol/LDTT、pH8.0)及少量石英砂,然后于4℃、15,000×
g条件下离心20min,收集上清液并立即用于酶活测定。
反应液包括0.45mL15μmol/LMg2+(硫酸镁或氯化镁),0.15mL5μmol/mLp-香豆酸,0.15mL50umol/mLATP,0.15mL1μmol/mLCoA以及0.5mL酶液。
40℃下反应10min,在333nm处测定光吸收,以每分钟内OD333变化0.1为1个活性单位(U)。
酶活性单位为U·
mgprotein-1,对照不加香豆酸。
朱明华,欧阳观察,薛应龙.黄瓜免疫诱导过程中G6PD、PAL、4CL、PPO活性和木质素含量的变化[J].上海农业学报,1990,6:
21-26.
5.肉桂酸羟化酶(C4H)活性测定
参照Lamb和Rubery(1975)的方法并修改。
取3.0g果肉组织,加入5mL提取液(50mmol/LTris-HCI:
pH8.9,15mmol/Lβ-疏基乙醇,4mmol/LMgCl2,5mmol/LVc,10μmol/LLeupeptin(亮抑酶肽),1mmol/LPMSF,0.15%PVPP,10%甘油),在冰浴条件下充分研磨后,于4℃、12000×
g下离心20min,上清液即为C4H粗酶提取液。
酶反应液组成为:
0.8mL酶提取液,2.2mL缓冲液(2μmol/L反式肉桂酸,50mmol/LTris-HCI:
pH8.9,2μmol/LNADPNa2,5μmol/LG-6-pNa)。
立即在340nm处比色。
参比为不加酶提取液(加入.08mL蒸馏水)。
OD值每小时变化0.01为一个酶活性单位(U),酶活性单位为U·
mgprotein-1。
LambCJ,RuberyPH.Aspectrophotometricassayforcinnamicacid4-hydroxylaseactivity.Anal.Biochem.1975,68:
554-561.
6.查尔酮异构酶(CHI)活性测定
参照Latunde-DadaandLucas(2001)方法略做修改。
反应体系包括60mM磷酸缓冲液(pH8.0,含50mMKCN抑制POD活性)、20µ
L三羟基查尔酮和200µ
在加入酶液之前,反应体系在30℃下保温平衡5min;
加酶液后,立即测定混合液在400nm下的初始吸光度值,然后在30℃下保温60min后立即加入500µ
L5NHCl中止反应。
测定终止反应后400nm下的吸光度值。
酶活性以每小时每毫克蛋白产生的异构查尔酮的纳摩尔数表示(nmol·
h-1·
mgprotein-1)。
Latunde-DadaAO,LucasJA.Theplantdefenceactivatoracibenzolar-S-methylprimescowpea[Vignaunguiculata(L.)Walp.]seedlingsforrapidinductionofresistance.PhysiologicalandMolecularPlantPathology,2001,58:
199-208.
7.肉桂醇脱氢酶(CAD)活性测定
参照Goffner(1992)的测定方法:
取3.0g果肉组织,加入3mL预冷的0.1mmol/LpH6.25的磷酸缓冲溶液(PBS)(内含15mmol/L-巯基乙醇和2%聚乙二醇(PEG)及约0.1gPVPP),冰浴条件下充分研磨,4℃、18000×
g离心20min,上清液用于酶活性测定。
取200μL酶粗提液加800μL反应液(含10mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP),5mmol/L反式肉桂酸),以200μLPBS加800μL反应液为对照,37℃水浴30min,1mol/LHCl终止反应(如有沉淀离心除去)后在340nm处测吸光值,每分钟变化0.001吸光度值为一个酶活性单位,结果以U·
测定3次重复。
GoffnerD,JoffroyI,GrimaPJ,etal.Purificationandcharacterizationofisoformsofcinnamylalcoholdenydro-genasefromEucalyptusxylem[J].Planta,1992,188
(1):
48-53.
三抗坏血酸(ASA)-谷胱甘肽(GSH)循环相关指标测定
1.抗坏血酸(ASA)和脱氢抗坏血酸(DHA)测定:
参照Turcsanyietal.(2000)并作修改。
取果肉组织3.0g加5mL预冷的100mmol/L盐酸在冰浴下充分研磨,然后在4℃、7800r/min条件下离心10min,上清液立即用于ASA和DHA的测定。
ASA的测定:
取100µ
L上清液加入2mL100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)再加入0.5mL蒸馏水在265nm下测定其吸光度值。
总ASA的测定:
L上清液加入2mL100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)再加入0.5mL2mmol/LDTT置于室温下(25℃)反应8min使DHA全部还原为ASA,之后在265nm下测定其吸光度值。
则DHA含量=总ASA含量-ASA含量。
EnikoT,TomL,MatthiasP,JeremyB.Doesascorbateinthemesophyllcellwallsformthefirstlineofdefenceagainstozone?
Testingtheconceptusingbroadbean(ViciafabaL.).JournalofExperimentalBotany.2000,51(346):
901-910.
2.还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)测定:
参照Breheetal.(1976)并作修改。
取3g果肉组织,加入5mL冰冷的6%的偏磷酸(pH2.8),冰浴研磨,匀浆液于4℃、12500r/min离心20min,取上清液来立即测定GSH和GSSG的含量或储存在-20℃下等待测定。
总的GSH和GSSG含量测定如下:
500μL提取液加2.5mL反应液包含800μL反应液1(110mmol•L-1Na2HPO4•7H20,40mmol•L-1NaH2PO4•H2O,15mmol•L-1EDTA,0.3mmol•L-1DTNB,0.04%BSA)、800μL反应液2(1mmol•L-1EDTA,50mmol•L-1咪唑和0.02%BSA)、800μL反应液3(5%Na2HPO4,pH7.5的溶液稀释50倍)和100μL9.0mmol•L-1NADPH。
以6%的偏磷酸(pH2.8)代替提取液作为对照,蒸馏水作参比,在412nm下测其吸光值,则OD总GSH+GSSG=OD样品-OD对照。
GSSG含量测定如下:
500μL提取液加入2.5mL乙烯吡啶(稀释50倍)在25°
C下水浴1h,以6%的偏磷酸(pH2.8)代替提取液作为对照,蒸馏水作参比,在412nm下测其吸光值,则ODGSSG=OD样品-OD对照。
GSH的含量可以从总的GSH和GSSG含量中减去GSSG含量获得。
BreheJE,BurchHB.Enzymaticassayforglutathione.Anal.Biochem.,1976,74,
315–319.
3.抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定:
参照Nakano和Asada(1981)方法并修改。
称取3g果肉组织,加入3mL经4℃预冷的100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5,含1mmol/LEDTA),在冰浴条件下研磨成匀浆,于4℃、12000×
g离心30min,收集上清液,用于APX活性的测定。
酶促反应体系由2mL100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5,含1mmol/LEDTA),0.8mL3mmol/L抗坏血酸,200µ
L粗酶液和0.5mL0.5mmol/LH2O2组成,最后加入H2O2启动酶促反应。
从启动后15s开始记录反应体系在290nm的吸光度值,连续测
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