发酵工程.docx
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发酵工程
发酵工程
1、发酵是利用微生物培养来生产产物的无氧或需氧的任何过程。
2、现代发酵工程:
是将现代DNA重组及细胞融合技术、酶工程技术、组学及代谢网络调控技术、过程工程优化技术等新技术与传统发酵工程融合,大大提高传统发酵技术水平,拓展传统发酵应用领域和产品范围的一种现代工业生物技术体系。
强调现代生物技术、控制技术和装备技术在发酵工业领域的集成应用。
3、部分利用基因工程技术研制的产品:
人胰岛素、人生长激素(GH)、表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子、白细胞介素-2(IL-2)、尿激酶原、猪生长激素(PGH)、牛生长激素(BGH)、纤维素酶α,β-干扰素、乙型肝炎疫苗、集落刺激因子(CSF)、促红细胞生成素(EPO)、抗血友病因子、组织溶纤原激活剂(t-PA)
4、发酵工程以高产量、高转化率和高效率及低成本为目标的发酵过程优化技术 。
高产量:
微生物生理、遗传、营养及环境因素
高转化率:
微生物代谢途径和过程条件
高效率:
微生物反应动力学和系统优化
低成本:
技术综合及产业化技术集成
5、不同层次的优化技术
6、微生物菌体
药用功能菌体:
茯苓菌→茯苓;担子真菌→灵芝、香菇类;虫草头孢菌;密环菌
工业上常用种类:
链霉菌属、小单孢菌、游动放线菌属、诺卡氏菌属、孢囊链霉菌、链轮丝菌属
第二章
7、发酵工业对菌种的要求:
1.能在价廉原料制备的培养基上迅速生长并生成所需代谢产物,且产量高
2.培养条件易于控制,
3.生长迅速,发酵周期短,
4.满足代谢控制的要求
5.抗噬菌体和杂菌的能力强
6.遗传性状稳定,菌种不易变异退化
7.在发酵过程中产生的泡沫少,这对装料系数,提高单罐产量,降低成本有重要意义
8.对需要添加的前体物质有耐受力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用
9.不是病原菌,同时在系统发育上与病原菌无关,不产生任何有害的生活物质,以保证安全
8、工业上常见的种类:
A.革兰氏阴性无芽孢杆菌(大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、黄单胞菌)
B.革兰氏阳性无芽孢杆菌(短杆菌、:
棒状杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、丙酸杆菌)
C.革兰氏阳性芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌、芽孢梭菌、革兰氏阳性球菌、肠膜状串珠菌)
9、微生物细胞工厂
10、野生型的菌株通常不能被称之为细胞工厂。
野生型菌株代谢速率和产物积累浓度低;
野生型菌株的代谢产物往往是多种产品的混合物,直接用于工业生产时产品分离难度较大;
野生型菌株主要依靠自然进化,速度慢,随机性强,不适合用于工业生产;
多数微生物底物谱较窄,而生物质成分复杂,难以被一种微生物全部利用。
11、细胞工厂的构建策略
基于基因组序列数据、代谢组分析和通量组计算重构代谢网络,是构建生物炼制细胞工厂的基础。
利用计算生物学的方法,整合转录组学、蛋白质组学
和代谢组学数据,理解微生物对不同的细胞内和环境刺激
的应答情况,解析代谢网络结构,确定其中的关键节点,
可设计出新的代谢工程策略,设法调节代谢流向目标产物
产量最大化的方向流动,从而构建高效的细胞工厂。
12、代谢调节是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。
(酶量的调节、酶活性的调节)
13、微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制,以期按照人们的愿望,生产有用的微生物制品。
14、代谢调节方式:
细胞透性的调节
代谢途径区域化
代谢流向的调控
代谢速度的调控
15、在真核微生物细胞里,各种酶系被细胞器隔离分布。
如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上;蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上;DNA合成的某些酶位于细胞核里。
16、酶合成的调节:
酶合成的诱导和酶合成的阻遏
17、酶活性调节是指一定数量的酶,通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。
调节方式:
激活已有酶的活性、抑制已有酶的活性。
18、反馈抑制:
反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑制。
无分支代谢途径的调节和有分支代谢途径的调节
19、初级代谢对次级代谢的调节:
碳源代谢产物的调节、氮代谢物的调节、磷酸盐的调节、细胞膜透性的调节。
20、提高初级代谢产物产量的方法:
1.使用诱导物
2.除去诱导物——选育组成型产生菌
3.降低分解代谢产物浓度,减少阻遏的发生
4.解除分解代谢阻遏——筛选抗分解代谢阻遏突变株
5.解除反馈抑制——筛选抗反馈抑制突变株
6.防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株
7.改变细胞膜的通透性
8.筛选抗生素抗性突变株
9.选育条件抗性突变株
10.调节生长速率
11.加入酶的竞争性抑制剂
21、常用的提高次级代谢产物产量的方法:
1)补加前体类似物
2)加入诱导物
3)防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生
4)防止氮代谢阻遏的发生
5)筛选耐前体或前体类似物的突变株
6)选育抗抗生素突变株
7)筛选营养缺陷型的回复突变株
8)抗毒性突变株的选育
22、为什么要采用高浓度微生物的培养?
微生物液体发酵大都采用分批培养,这种培养方式的缺点是:
发酵液中最终细胞浓度不高。
如果通过改进工艺技术,使发酵液中微生物细胞增殖到很高的浓度,那么,高浓度的细胞将会产生高浓度的发酵产物,这样就可以大大提高发酵设备的利用率,降低生产成本。
基于这种目的,人们开始研究微生物高细胞浓度的培养技术。
采用高细胞浓度培养技术,发酵液中菌体浓度比分批式培养可高10倍以上。
高细胞浓度培养技术的优点:
可大大提高发酵设备的利用率、节省能源
23、高浓度细胞培养的方法:
流加培养、高细胞浓度连续培养、菌体循环利用等
24、流加培养的控制方式:
无反馈控制(恒速流加、变速流加、指数流加)
反馈控制:
DO-恒定控制、pH-恒定控制、CO2生成速率控制、细胞浓度控制、底物浓度控制)
第三章
25、微生物培养基:
是指可供微生物细胞生长、繁殖所需的一组营养物质和原料、以及其它所必须的条件。
26、培养基类型:
(1)按纯度分类:
合成培养基、天然培养基
(2)按状态分类:
固体培养基、半固体培养基(软琼脂)、液体培养基
(3)按用途分类:
孢子培养基、种子培养基、发酵培养基
27、发酵培养基的成分及来源:
1)碳源:
提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分。
提供合成目的产物所必须的碳成分。
常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇。
2)氮源:
主要用于构成细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物。
有机氮源:
花生饼粉、豆饼粉、棉子饼、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。
无机氮源:
(NH4)2SO4,NH4Cl,NH4NO3,KNO3,NaNO3,NH3
3)无机盐与微量元素:
P、S、Fe、Cl、K、Na、Ca、Zn、Mg、Co、Mn
4)生长因子、前体、产物促进剂
产物促进剂:
指那些非细胞生长所必须的营养物又非前体,但加入后却能提高产量的添加剂。
28、培养基优化的基本原则、目标及基本方法
基本原则:
(1)菌种特性,同化能力
(2)合适的C、N比。
工业发酵培养基的C、N比为100:
(0.2~2.0)
(3)合适的快速利用碳源、氮源。
(4)合适的生理性酸性与碱性
(5)pH、离子强度等
目标:
提高生产率(提高发酵单位、缩短生产时间)价廉的原料替代,降低成本、降低物耗、能耗、三废排放
基本方法:
响应面分析、单因子实验、正交实验、均匀设计、神经网络、聚类分析
29、什么是RSM?
响应面设计方法(RSM)是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法。
30、响应面设计方法适用范围:
1)确信或怀疑因素对指标存在非线性影响;
2)因素个数2-7个,一般不超过4个,经典的3个;
3)所有因素均为计量值数据;
4)试验区域已接近最优区域;
5)基于2水平的全因子正交试验。
31、Plackett–Burman(PB)、CentralCompositeDesign(CCD)、Box-BehnkenDesign(BBD)是最常用的实验设计方法
32、响应面方法分类:
Box-Behnken试验设计(BBD)、中心复合试验设计(CCD)
33、中心复合试验设计
中心复合设计是在2水平全因子和分部试验设计的基础上发展出来的一种试验设计方法,它是2水平全因子和分部试验设计的拓展。
通过对2水平试验增加一个设计点(相当于增加了一个水平),从而可以对评价指标(输出变量)和因素间的非线性关系进行评估。
34、消毒与灭菌的区别?
消毒:
杀灭病源微生物。
灭菌:
杀灭所有微生物
消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。
一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。
例如,巴氏消毒法,是将物料加热至60℃维持30min,以杀死不耐高温的微生物营养细胞。
灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物,包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。
消毒不一定能达到灭菌要求,而灭菌则可达到消毒的目的。
35、灭菌的方法:
化学药物灭菌、紫外线或电离辐射、空气的过滤除菌、加热灭菌(湿热、干热、火焰)
36、间歇灭菌:
将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中,通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程,也称实罐灭菌。
连续灭菌:
将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。
37、空气除菌的方法:
1)辐射杀菌:
高能阴极射线、X射线、γ、β射线、紫外线
2)热杀菌;3)静电除菌;过滤除菌
38、空气过滤除菌:
绝对过滤:
过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。
如聚乙烯醇缩甲醛树脂(PVF)制成的0.3m的微孔滤膜。
深层介质过滤:
介质的孔隙一般大于微生物细胞。
如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。
39、空气过滤器(过滤除菌的关键设备)
★★第四章
40、生物反应动力学
41、基质的消耗速度:
r=-ds/dt(g.L-1.s-1)
基质的消耗比速:
σ=-ds/dt/X(h-1、s-1)
42、(Monod方程)菌体的生长比速:
μ=μmaxS/(Ks+S)
米氏方程:
ν=νmaxS/(Ks+S)
43、初级代谢产物:
微生物合成主要供给细胞生长的一类物质。
如氨基酸、核苷酸等等,这些物质称为初级代谢产物。
44、次级代谢产物:
对细胞的代谢功能没有明显的影响,一般是在稳定期形成,如抗生素等,
这一类化合物称为次级代谢产物。
45、发酵的三分类与Pirt方程:
一类发酵:
产物的形成和菌体的生长相偶联
二类发酵:
产物的形成和菌体的生长部分偶联
三类发酵:
产物的形成和菌体的生长非偶联
Pirt方程:
π=a+bμ
a=0、b≠0:
可表示一类发酵
a≠0、b=0:
可表示二类发酵
a≠0、b≠0:
可表示三类发酵
46、基质消耗动力学的基本概念
维持消耗(m):
指维持细胞最低活性所需消耗的能量,一般来讲,单位重量的细胞在单位时间内用于维持消耗所需的基质的量是一个常数。
X
S(底物)─→X(菌体)+P(产物)+维持
物料衡算:
ds/dt=ds1/dt+ds2/dt+ds3/dt
σ=μ/YX/S+μ/YP/S+m
m:
维持消耗系数
YX/S:
细胞对基质的理论得率系数
YP/S:
产物对基质的理论得率系数
47、发酵动力学分类:
根据生长有否偶联:
偶联型,产物形成速度与生长速度密切相关
混合型,产物形成速度与生长部分相关
非偶联型,产物形成速度与生长速度无关
48、发酵方法:
好氧发酵:
液体表面培养发酵、固体表面培养、深层通风发酵(分批式操作、半分批式操作、反复分批式操作、反复半分批式操作、连续式操作)
厌氧发酵:
深层发酵
发酵方法:
分批发酵法、补料分批发酵法、连续发酵法(开放式连续发酵、封闭式连续发酵)
第五章计算题
第五章发酵罐的设计
49、搅拌器的作用:
打碎气泡,提高氧的利用率,促进传质和传热
50、挡板作用:
改变液流方向,消除液面中心旋涡,提高搅拌混合效果,提高湍流强度。
51、消泡器作用:
打碎泡沫,防止逃逸
52、通用式发酵罐的优缺点:
优点:
适用范围广,便于控温,醪液混合效果好,罐压高。
缺点:
搅拌功率消耗大,每立方米需2千瓦左右;罐内结构复杂,不易清洗,死角多,易渗漏,易染菌。
培养菌丝体时,搅拌易受伤。
需庞大的无菌空气制备系统,投资高,能耗高。
53、自吸式发酵罐特点:
不用空压机,在搅拌时或液体高速喷射时自动吸入空气。
自吸式发酵罐的优缺点:
优点:
不需另设空气制备系统,投资少,能耗低,吸入的气泡小,溶氧效果好,是通用罐的3倍.
缺点:
搅拌转速要求高,如20立方米罐,要求400rpm,而通用罐<200rpm,功率消耗大,产生泡沫多,装料系数减少,≤70%;空气过滤器的阻力要求小;发酵罐内压力低,仅有0.1-0.2kg/cm2,易染菌,主要用于饲料酵母,液体醋等粗放的通风发酵。
54、定子的作用:
将气体与液体混匀,甩出,将大气泡打碎,促进溶氧。
转子的作用:
将转子内的液体甩出,形成内部真空,将气体吸入。
55、气升式发酵罐特点及结构:
利用压缩空气的动能使醪液翻动,以减去机械搅拌和挡板,节省动力;罐外冷却,减少了罐内附件。
优点:
结构简单,附件少,容易制造,维修和清洗。
取消了搅拌转动,减少了投资,节省动力约50%,对菌体无损伤。
密封性能好,不易染菌。
能自消泡,不须加消泡剂。
装料系数高,可达80%-90%。
缺点:
耗气量非常大。
混合与通气相耦合问题,很难在不改变通气的条件下改变混合状况。
循环周期长,2.5分钟以上,对于好氧菌,不能满足溶氧需要。
对于粘度大的醪液,相间混和接触较差。
无菌空气压力高,罐压低,罐底易出现沉淀。
降温也比较困难。
第六章
56、改进单纯形法:
由于发酵罐无法同时进行几组中心点的实验,因此,利用上述统计法将引起较大误差。
对这种情形可采用单纯形法进行优化。
单纯形法是一种非统计优化技术,它能自我修正因误差引起的球形的反向移动,而且下组实验是由前几组实验的结果所确定的,因此,最终将能指向最优化的条件。
57、实验设计与优化:
发酵罐中最主要的影响因子有搅拌转速、通气量和pH值。
下面就以这3个因子的优化为例来说明单纯形法。
3个因子的单纯形是一个四面体,因此最初需要进行4组实验。
每个因子的高低水平可随机确定或根据文献报道值来确定。
根据这4组实验结果,将最差的一组去掉,然后用1组新的实验代替。
这组新的实验的设计准则为:
最佳3组变量值的平均值的2倍减去最差组的变量值。
用类似方法直至找到最优化的条件。
58、摇瓶与罐培养的差异
摇瓶的试验条件放大到生产罐或小发酵罐的试验条件转移到大发酵罐时,它们所得产物的产量往往不完全一致,特别是产抗生素的新菌株,差异更大,当然也有一致的巧合。
引起这种差异的原因本质上是由这两种试验规模变化所引起的。
它们引起的差异是很复杂的。
引起摇瓶和罐培养的差异主要原因为:
1)体积氧传递系数(KLa)和溶解氧的差异;Kd在摇瓶发酵和罐发酵中的差异很大,Kd值也可能差几倍。
罐中的(Kd)一般都大于摇瓶。
2)CO2浓度的差异;CO2在水中的溶解度随外界压力的增大而增加。
发酵罐处于正压状态,而摇瓶基本上是常压状态,所以罐中培养液的CO2浓度明显大于摇瓶
3)菌丝受机械损伤的差异;罐发酵时,菌体,特别是丝状菌,却受到搅拌叶的剪切力的影响而受损。
其受损程度远远大于摇瓶发酵。
综上所述,上述三个原因就可能造成摇瓶发酵和罐发酵结果之间存在着差异。
如果菌株要求较高的KLa值和溶解氧时,罐中生产能力就有可能高于摇瓶,并随KLa和溶氧水平上升而提高。
如果菌株对机械损伤是比较敏感的,则罐中生产能力就会低于摇瓶,并随搅拌强度的增强而降低。
有时菌株对溶氧和搅拌强度都敏感,其结果就随发酵罐的特性而不同。
59、放大的方法:
单位体积输入功率相等、保持KLa不变、单位体积空气流量相同、空气直线流速相同
第七章
60、发酵过程的主要控制参数
1.pH值(酸碱度)
2.温度(℃)
3.溶解氧浓度
4.基质含量
5.空气流量
6.压力
7.搅拌转速
8.搅拌功率
9.粘度
10.浊度
11.料液流量
12.产物浓度
13.氧化还原电位
14.废气中的氧含量
15.废气中的CO2含量
16.菌丝形态
17.菌体浓度
发酵过程引起变化的原因:
1)发酵热是引起发酵过程温度变化的原因
2)pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件
61、泡沫对发酵的影响及其控制:
少量泡沫的作用:
一定数量的泡沫是正常现象,可以增加气液接触面积,导致氧传递速率增加;
大量的泡沫引起许多负作用:
发酵罐的装料系数减少、氧传递系数减小;增加了菌群的非均一性;造成大量逃液,增加染菌机会;严重时通气搅拌无法进行,菌体呼吸受到阻碍,导致代谢异常或菌体自溶;消泡剂的添加将给提取工序带来困难。
62、泡沫的消除:
(一)调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制,以减少泡沫形成的机会。
(二)采用菌种选育的方法,筛选不产生流态泡沫的菌种,来消除起泡的内在因素。
(三)采用机械消泡或化学消泡剂来消除已形成的泡沫。
63、消泡剂的作用:
降低泡沫液膜的机械强度;降低液膜的表面黏度;兼有两者的作用,达到破裂泡沫的目的。
64、作为理想的消泡剂,应具备下列条件:
1)消泡剂必须是表面活性剂,且具有较低的表面张力,消泡作用迅速,效率高;
2)应该在低浓度时具有消泡活性;
3)应该具有持久的消泡或抑泡性能,以防止形成新的泡沫;
4)应该对微生物、人类和动物无毒性;
5)应该对产物的提取不产生影响;
6)不会在使用、运输中引起任何危害;
7)来源方便,成本低;
8)应该对氧传递不产生影响;
9)能耐高温灭菌。
65、常用的消泡剂:
天然油脂类(豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和猪油等)、脂肪酸和酯类、聚醚类(聚氧丙稀甘油(GP型)和聚氧乙烯氧丙稀甘油(GPE型,泡敌))、硅酮类。
以天然油脂类和聚醚类在生物发酵中最为常用
66、控制溶氧的工艺手段:
1.改变通气速率(通气量的改变)、2.改变搅拌速度、3.改变气体组成中的氧分压
4.改变罐压、5.改变发酵液的理化性质、6.加入传氧中间介质
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