色谱纯度HPLC分析方法验证报告样式.docx
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色谱纯度HPLC分析方法验证报告样式
×××色谱纯度分析方法验证报告
设备验证方案历史记录
×××色谱纯度分析方法验证报告批准----------------------------------------------------3
1.验证目的---------------------------------------------------------------------------4
2.色谱纯度分析方法-------------------------------------------------------------------4
2.1仪器------------------------------------------------------------------------------4
2.2试剂------------------------------------------------------------------------------4
2.3标准品----------------------------------------------------------------------------4
2.4色谱条件--------------------------------------------------------------------------4
2.5溶液配制--------------------------------------------------------------------------5
2.6进样操作--------------------------------------------------------------------------5
3.方法验证---------------------------------------------------------------------------6
3.1专属性----------------------------------------------------------------------------6
3.2系统适用性试验--------------------------------------------------------------------9
3.3精密度----------------------------------------------------------------------------9
3.4线性及范围------------------------------------------------------------------------11
3.5准确度----------------------------------------------------------------------------17
3.6检测限及定量限--------------------------------------------------------------------20
4.验证评价及结论---------------------------------------------------------------------21
5.附件-------------------------------------------------------------------------------21
×××色谱纯度分析方法验证报告批准
对本验证方案批准表示同意其验证项目和可接受标准、验证方法和本方案内的各种表格格式、内容。
在执行本方案的过程中可能会遇到阻碍本方案精确地完成的缺陷。
较小的偏差可以在《偏差报告》内陈述。
较大的偏差,如,方法的修改,测试/评估参数,接受标准等只有在附带有经过批准的补充材料的情况下才予以承认。
所有经批准的偏差报告和补充材料都应附在批准前的验证报告内。
方案起草
签名
日期
质检中心
方案审核
签名
日期
质检中心QC
总工程师
质量部QA
方案批准
签名
日期
质量副总
1.摘要
我们按照USP30专论的方法测定×××的色谱纯度。
方法的原理是采用HPLC方法,在233nm检测波长下测定,以×××为参考标准,进行色谱纯度的定量分析。
该方法用于×××原料药在放行及稳定性试验中色谱纯度的测定。
经评价,实验室色谱纯度的条件,包括色谱柱、流动相、检测波长、进样量、浓度等条件完全与USP专论规定的一致。
杂质A,C,D,以及杂质XA、杂质XB和杂质XC是×××实际存在和潜在的杂质。
为了评价实验室的仪器、人员、环境等能否满足色谱纯度测定的要求,按照ICH指南Q2A和Q2B的要求,对分析方法进行了验证,验证的项目包括专属性、系统适用性试验、精密度、线性、范围、准确度、定量限和检测限,验证结果表明,每个验证项目均符合验证标准。
USP色谱纯度的分析方法适合于×××原料药中杂质的测定和控制。
验证结果摘要如下:
a.专属性:
溶剂对杂质的测定没有干扰,×××与相邻杂质XA和杂质D的分离度依次为21.1和13.2,较相邻的杂质D和杂质A的分离度为1.8,杂质XB和XC的分离度为1.6,均大于1.5,表明×××与每个杂质以及每个杂质之间分离度均符合要求。
b.系统适用性试验:
在系统适用性溶液的色谱图中,3-苯甲酰基苯甲酸和×××的分离度R为13.3,大于4;以×××峰计算色谱柱的理论塔板数N为20328,大于2250;×××峰的拖尾因子T为0.83,小于2.0;标准溶液连续进样6次,其主峰面积的RSD为0.51%,小于5%。
c.精密度:
标准溶液重复进样6次,在重复性项下,杂质C,杂质XA,×××,杂质D,杂质A,杂质XB和杂质XC峰面积的RSD依次为0.24%,0.41%,0.51%,0.54%,0.21%,1.6%和0.86%,均小于5%;在中间精密度项下测得的RSD依次为0.20%,0.23%,0.60%,0.60%,0.24%,1.1%和0.49%,均小于5%;F-test结果表明,每个组分的F值均小于F0值5.05,表明方法的中间精密度和重复性之间的精密度无显著性差异。
d.线性和范围:
杂质A的含量在0.02%~0.24%的范围时,它的线性方程为Y=153.713X-0.214,相关系数为0.99996;杂质C的含量在0.02%~0.24%的范围时,它的线性方程为Y=62.854X-0.236,相关系数为0.9999;杂质D的含量在0.02%~0.24%的范围时,它的线性方程为Y=27.520X-0.423,相关系数为0.9999;杂质XA的含量在0.02%~0.24%的范围时,它的线性方程为Y=86.007X-0.725,相关系数为0.9999;杂质XB的含量在0.02%~0.24%的范围时,它的线性方程为Y=13.160X-0.325,相关系数为0.9997;杂质XC的含量在0.02%~0.25%的范围时,它的线性方程为Y=65.240X-1.546,相关系数为0.9998;代表其它杂质的×××含量在0.02%~0.25%的范围时,它的线性方程为Y=33.579X-0.558,相关系数为0.9998;每个杂质的相关系数均大于0.999,表明它们的峰面积与浓度均呈线性关系。
e.准确度:
杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和×××的回收率依次为99.4%,99.2%,98.5%,99.0%,98.7%,98.5%和100.5%,回收率的RSD依次为1.2%,1.8%,1.4%,1.8%,2.9%,2.5%和2.4%;每个杂质的回收率均介于95.0%~105.0%之间。
f.定量限和检测限:
杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和×××的检测限依次为0.0002%,0.0002%,0.002%,0.0004%,0.005%,0.001%,它们的定量限依次为0.001%,0.001%,×%,0.002%,0.02%,0.005%,结果表明,方法的灵敏度适合杂质的检测和控制。
2.分析方法
×××USP30专论
2.1仪器:
高效液相色谱仪
Agilent1100HPLC
2.2试剂:
a.乙腈(色谱纯)
b.磷酸二氢钾(分析纯)
c.纯化水
2.3标准品:
a.×××标准品
b.3-苯甲酰基苯甲酸
2.4色谱条件:
a)色谱柱:
YMCPackODS-A,4.6mm×150mm,3µm;
b)pH3.5缓冲液:
称取68.0g磷酸二氢钾,用水溶解并稀释至1000ml,用磷酸调pH值为3.50±0.05,过滤。
c)流动相:
水-乙腈-pH3.5缓冲液=550:
430:
20
配制方法:
用适宜的量筒分别量取过滤的水550ml,乙腈430ml和pH3.5缓冲液20ml,于一合适的试剂瓶中,充分混匀。
在超声波上脱气10分钟。
也可按照待测样品的数量,按照比例配制适量的流动相。
d)检测波长:
233nm;
e)流速:
1.0ml/min;
f)进样量:
20µl。
2.5溶液制备
a)系统适用性溶液:
量取0.5ml标准贮备溶液和3-苯甲酰基苯甲酸贮备溶液1.0ml至10ml容量瓶中,用流动相稀释至刻度,混合均匀。
×××和3-苯甲酰基苯甲酸的浓度依次约为0.01mg/ml和0.005mg/ml。
3-苯甲酰基苯甲酸贮备溶液:
称取3-苯甲酰基苯甲酸标准品5.0mg,置100ml容量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,混合均匀。
b)标准溶液:
标准贮备溶液:
称取×××标准品约10.0mg,置50ml容量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,混合均匀。
精密量取1.0ml至100ml容量瓶中,用流动相稀释至刻度,混合均匀。
浓度约为0.002mg/ml。
c)供试溶液:
称取×××样品约100mg,精密称定,置100ml棕色容量瓶中,加适量流动相,用超声波使溶解,放冷至室温,用流动相稀释至刻度,混合均匀。
该溶液制备应避光操作。
2.6进样操作
2.6.1仪器准备
按照高效液相色谱仪操作规程准备仪器,设定流速为1.0ml/min,设定检测器波长为233nm。
待仪器平衡后,开始进样操作。
2.6.2系统适用性试验:
系统平衡后,取系统适用性溶液进样,记录色谱图,3-苯甲酰基苯甲酸和×××的相对保留时间依次为0.8和1.0;3-苯甲酰基苯甲酸和×××的分离度R至少为4。
以×××峰计算色谱柱的理论塔板数N,应不少于2250;×××峰的拖尾因子T,不大于2.0。
标准溶液连续进样6次,记录色谱图,其主峰面积的RSD≤5%。
2.6.3空白测试:
取流动相进样,记录色谱图。
在样品的测试中忽略溶剂峰。
2.6.4样品测定
取供试品溶液进样,记录色谱图至主峰保留时间的7倍,以峰面积计算杂质的含量。
2.6.5计算公式:
按公式
(1)计算×××中单个杂质含量;按公式
(2)计算×××中总杂质的含量。
单个杂质含量(%)=
公式
(1)
总杂质含量(%)=
公式
(2)
式中:
WS→×××标准品的重量,mg;
Wi→×××的样品的重量,mg;
Ai→样品色谱图中单个杂质的峰面积;
As→标准溶液中主峰的峰面积。
P→×××USP标准品的含量
→样品色谱图中总杂质的峰面积,等于
=A总面积-A×××。
2.6.6结果判定:
供试品中单个杂质不大于0.2%,总杂质不大于1.0%。
3.方法验证
3.1专属性
3.1.1空白测试:
取溶剂流动相进样,记录色谱图,做为空白,确定溶剂对杂质测定有无干扰,在样品测定图谱中溶剂峰应忽略。
色谱图见KP0-BLANK000000.D。
3.1.2单个杂质的定性
3.1.2.1杂质定性溶液:
依次取“3.4.1.1杂质标准贮备液”项下杂质A、杂质C、杂质D和杂质XA、杂质XB、杂质XC的标准贮备溶液2.0ml,各至一个25ml容量瓶中,用流动相稀释至刻度,混合均匀。
3.1.2.2取每个杂质溶液分别进样,记录色谱图。
记录每个杂质的保留时间,用保留时间对每个杂质进行定性,结果填写在表1-1。
按照保留时间顺序,杂质C,XA,D,A,XB,XC的保留时间依次为2.218min,5.168min,11.402min,12.019min,17.191min,17.960min。
它们的色谱图见KP0-000001.D,KP0-000003.D,KP0-000005.D,KP0-000006.D,KP0-000008.D,KP0-000009.D。
表1-1各杂质的定性
杂质名称
浓度(μg/ml)
保留时间(min)
杂质C
8.0
2.218
杂质D
8.2
11.402
杂质A
8.0
12.019
3.1.3杂质和×××的分离度测试
以重复性项下的色谱图进行评价,记录各组分的出峰顺序和保留时间,并计算相邻组分之间的分离度R,数据见表1-2。
色谱图见KP0-000014.D。
3.1.4×××加入已知杂质的分离度测试
3.1.4.1溶液制备
称取×××样品10mg,加入线性项下标准贮备溶液(10μg/ml)2.0ml,再加入流动相溶解并稀释至10ml,混合均匀。
3.1.4.2测定:
取该溶液进样,记录色谱图,记录各组分的出峰顺序和保留时间,计算它们的相对保留时间(RRT)(×××为1.0)和相邻组分之间的分离度R,数据见表1-3。
色谱图见KP0-000026.D。
表1-2杂质和×××分离度测试
出峰顺序
名称
保留时间(min)
分离度R
1
杂质C
2.218
-
2
杂质XA
5.216
21.0
3
×××
7.786
12.4
4
杂质D
11.476
13.3
5
杂质A
12.069
1.8
表1-3×××加入已知杂质的分离度测试
出峰顺序
名称
保留时间(min)
RRT
分离度R
1
杂质C
2.212
0.28
-
2
杂质XA
5.210
0.67
21.1
3
×××
7.795
1.0
12.6
4
杂质D
11.475
1.47
13.2
5
杂质A
12.066
1.55
1.8
3.1.6专属性评价标准
1)溶剂对杂质的测定无明显干扰;
2)杂质A和杂质D的分离度不小于1.0;其它每个相邻组分之间的分离度R均应大于1.5;
3.1.7验证结果及评价
溶剂对杂质的测定没有干扰,×××与相邻杂质XA和杂质D的分离度依次为21.1和13.2,较相邻的杂质D和杂质A的分离度为1.8,杂质XB和XC的分离度为1.6,均大于1.5,表明×××与每个杂质以及每个杂质之间分离度均符合要求。
方法的专属性符合验证标准。
3.2系统适用性试验
3.2.1按照×××色谱纯度分析方法进行:
3.2.2分离度:
系统平衡后,取系统适用性溶液进样,记录色谱图,3-苯甲酰基苯甲酸和×××的相对保留时间依次约为0.8和1.0;计算3-苯甲酰基苯甲酸和×××的分离度。
以×××峰计算色谱柱的理论塔板数N和拖尾因子T。
色谱图见KP0-000039.D。
3.2.4重复性
标准溶液连续进样6次,记录色谱图,计算主峰面积的RSD。
测定数据和结果见表2-1。
色谱图见KP0-000040.D~KP0-000045.D。
3.2.3验证合格标准
1)以×××峰计算色谱柱的理论塔板数N,应不少于2250;
2)×××峰的拖尾因子T,不大于2.0;
3)3-苯甲酰基苯甲酸和×××的分离度R至少为4;
4)标准溶液连续进样6次,其主峰面积的RSD≤5%。
3.2.4系统适用性试验结果及评价:
在系统适用性溶液的色谱图中,3-苯甲酰基苯甲酸和×××的分离度R为13.3,大于4;以×××峰计算色谱柱的理论塔板数N为20328,大于2250;×××峰的拖尾因子T为0.83,小于2.0;标准溶液连续进样6次,其主峰面积的RSD为0.51%,小于5%。
方法的系统适用性试验符合验证标准。
表2-1系统适用性试验数据
No.
1
2
3
4
5
6
平均值
峰面积
67.93
68.38
67.76
68.75
68.16
68.12
68.18
标准偏差S
0.35
RSD
0.51%
分离度R
13.3
理论塔板数N
20328
拖尾因子T
0.83
3.3精密度
3.3.1重复性
3.3.1.1以方法规定的色谱条件,取线性项下No.5线性标准溶液,连续进样6次,记录色谱图,计算各组分峰面积的平均值、标准偏差S和RSD。
以RSD评价方法的重复性。
数据及结果见表3-1。
色谱图见KP0-000014.D~KP0-000019.D。
3.3.1.2验证合格标准:
标准溶液连续重复6次进样,各组分峰面积的相对标准偏差RSD≤5%。
3.3.1.3重复性验证结果及评价
标准溶液重复进样6次,杂质C,杂质XA,×××,杂质D,杂质A峰面积的RSD依次为0.24%,0.41%,0.51%,0.54%,0.21%,1.6%和0.86%,均小于5%,方法的重复性符合标准。
3.3.2中间精密度
另日,由另外一个化验员,按照线性项下No.5线性标准溶液的制备方法配制相同浓度的溶液,在相同的仪器上连续进样6次,记录色谱图。
计算各组分峰面积的平均值、标准偏差S和RSD,以RSD评价方法的中间精密度,数据及结果见表3-2。
色谱图见KP0-000014.D~KP0-000019.D。
3.3.2.2验证合格标准:
标准溶液连续重复6次进样,各组分峰面积的相对标准偏差RSD≤5%。
3.3.2.3中间精密度验证结果及评价
标准溶液重复进样6次,杂质C,杂质XA,×××,杂质D,杂质A峰面积的RSD依次为0.20%,0.23%,0.60%,0.60%,0.24%,1.1%和0.49%,均小于5%;方法的中间精密度符合标准。
3.3.3精密度的显著性评价
使用F-检验的方法,评价在精密度方面,方法的重复性和中间精密度有无显著性差异。
3.3.3.1步骤
(1)取各组分重复性和中间精密度项下的峰面积的标准偏差S;
(2)选择显著性水平α=0.05;
(3)从表3-1和表3-2获得峰面积的标准偏差S,确定S1和S2(S1>S2);
(4)计算F值,F=S12/S22;
(5)计算自由度(n2-1,n1-1)=(5,5),n2=n1=6;
(6)查阅在α=0.05,自由度为(5,5),单侧检验的F0=5.05;
(7)数据和结果见表3-3。
3.3.3.2验证合格标准
每个组分的F应小于F0,即表明方法的重复性和中间精密度之间无显著性差异。
3.3.3.3验证结果及评价
每个组分的F应小于F0,表明方法中间精密度和重复性之间的精密度无显著性差异。
3.3.4精密度验证结果及评价
标准溶液重复进样6次,在重复性项下,杂质C,杂质XA,×××,杂质D,杂质A,杂质XB和杂质XC峰面积的RSD依次为0.24%,0.41%,0.51%,0.54%,0.21%,1.6%和0.86%,均小于5%;在中间精密度项下测得的RSD依次为0.20%,0.23%,0.60%,0.60%,0.24%,1.1%和0.49%,均小于5%;F-test结果表明,每个组分的F值均小于F0值5.05,表明方法的中间精密度和重复性之间的精密度无显著性差异。
方法的精密度符合验证标准。
表3-1重复性试验数据
组分
峰面积
平均值
S
RSD
1
2
3
4
5
6
杂质C
125.75
126.03
126.08
126.63
126.27
125.99
126.13
0.297
0.24%
杂质XA
170.09
170.75
170.79
170.99
171.92
169.98
170.75
0.701
0.41%
×××
72.30
71.58
71.83
72.18
72.63
72.22
72.12
0.369
0.51%
杂质D
55.72
55.81
55.80
56.01
55.99
55.18
55.75
0.302
0.54%
杂质A
308.44
307.59
308.16
308.36
307.76
306.72
307.84
0.641
0.21%
表3-2中间精密度试验数据
组分
峰面积
平均值
S
RSD
1
2
3
4
5
6
杂质C
126.28
126.15
126.07
126.60
126.30
126.70
126.35
0.249
0.20%
杂质XA
170.92
171.07
171.30
170.39
171.52
171.17
171.06
0.387
0.23%
×××
72.70
72.18
72.58
71.67
72.15
71.67
72.16
0.436
0.60%
杂质D
56.57
56.33
55.61
56.35
56.12
56.43
56.24
0.340
0.60%
杂质A
309.00
308.71
308.40
309.97
308.92
310.23
309.20
0.728
0.24%
表3-3重复性和中间精密度有无显著性差异的评价
组分名称
重复性的
S
中间精密度的S
F=S12/S22
(S1>S2)
接受标准F0
结论
杂质C
0.297
0.249
1.42
5.05
合格
杂质XA
0.701
0.387
3.28
5.05
合格
×××
0.369
0.436
1.40
5.05
合格
杂质D
0.302
0.340
1.27
5.05
合格
杂质A
0.641
0.728
1.29
5.05
合格
3.4线性及范围
3.4.1溶液制备
3.4.1.1标准贮备液
分别精密称取以下标准品:
杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和×××标准品适量,分别至一个容量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,混合均匀,得到每个组分的标准贮备液。
每个成分的浓度均约为0.10mg/ml。
(备注:
为保证线性范围,浓度应充分精确,并根据含量折纯)。
3.4.1.2标准贮备溶液(a):
分别量取每个杂质和×××的标准贮备液各5.0ml,至一个50.0ml容量瓶中,用流动相稀释至刻度,混合均匀。
每个组分的浓度均约为10μg/ml。
3.4.1.3标准溶液
分别取标准贮备溶液(a)0.5ml,1.0ml,2.0ml,
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