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3.4.1基本原理29
3.4.2疏水介质的选择30
3.4.3疏水作用层析实验操作30
3.4.4疏水作用层析的应用31
第4章活性与纯度分析32
4.1酶活性的测定32
4.1.1酶活性的基本概念32
4.1.2米氏方程32
4.1.3酶活性测定的主要方法35
4.1.4酶活性测定的原则36
4.1.5活性测定反应的终止36
4.2电泳37
4.2.1基本原理37
4.2.2影响电泳的因素38
4.2.3区带电泳的分类39
4.2.4电泳技术的应用40
第5章蛋白质纯化研究进展45
5.1离子交换层析进展45
5.1.1离子交换纤维素46
5.1.2离子交换葡聚糖凝胶46
5.1.3交联凝胶离子交换剂48
5.2凝胶过滤层析进展48
5.2.1交联葡聚糖49
5.2.2聚丙烯酰胺凝胶50
5.2.3琼脂糖凝胶50
5.2.4比较坚硬的凝胶过滤介质50
5.3亲和层析进展51
5.3.1亲和层析的类型51
5.3.2展望54
5.4电泳进展55
5.4.1圆盘电泳56
5.4.2垂直电泳57
5.4.3水平电泳58
第6章计算机模拟“蛋白质纯化”研究59
6.1计算机模拟蛋白质纯化系统简介60
6.2样品15号的纯化61
6.2.1样品的初始条件61
6.2.2纯化路线的设计61
6.2.3盐析64
6.2.4阴离子交换层析66
6.2.5凝胶过滤层析69
6.2.6其它路线72
6.2.7结果与讨论74
6.2.8结论76
第1章前言
生命科学是21世纪的带头学科,在现代生命科学最前沿的科研领域中,以研究人类基因组结构和功能为主的“蛋白质组计划”已经成为生命科学研究者的重要课题,并带动了整个生命科学的发展。
90年代以来,虽然蛋白质纯化技术得到快速发展,但蛋白质工程产物的分离纯化成本约占其全部成本的60%~80%,因此蛋白质分离纯化技术越来越重要。
生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。
纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性,然后通过实验选择出最有效的纯化流程。
在下游纯化中,可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时,去除各种污染物。
1.1分离纯化方法
1.1.1蛋白质(包括酶)的抽提
1、离心法
蛋白质分子在其溶液中能够运动和扩散,同时受重力场的作用还有沉降的趋势,分子越来越大,扩散越慢而沉降很快;
反之,分子越小越易扩散但沉降则越慢,甚至不能自然沉降。
因此,需借助离心力场,外加各种密度的介质使蛋白质沉淀,以达到分离的目的。
2、沉淀法
沉淀使溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
它是分离纯化蛋白质最常用的方法。
通过沉淀,将目的蛋白转入固相沉淀或留在液相中与杂质分离。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。
不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的,溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关,溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶剂的pH、离子强度或极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在蛋白质分离中最常用的几种沉淀办法是:
(1)等电点沉淀法
(2)盐析沉淀法
(3)有机溶剂沉淀法
(4)有机聚合物沉淀法
3、透析法
1.1.2蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化是利用其物理和化学性质的差异,即以分子的大小,形状,溶解度,等电点,亲疏水性以及其它分子的亲和性等性质建立起来的。
不同蛋白质纯化要依据蛋白质的性质差异和纯化要求的不同,采取不同的纯化工艺。
以此相对应的分离纯化方法参见表1-1:
表1-1蛋白质物理和化学性质以及分离纯化方法
蛋白质物理和化学性质
分离纯化方法
分子的大小和形状
密度梯度离心超过滤渗透、
分子筛层析
等电点和电荷
制备电泳等电聚焦层析(电泳)
离子交换层析吸附层析
溶解度
盐析盐溶有机溶剂沉淀
等电点沉淀溶液萃取技术
与其他分子的亲和性
亲和层析金属鳌合亲和层析
共价层析等
亲疏水性
疏水作用层析反相层析
1.2分离纯化的一般流程
1、生物材料的预处理及细胞破碎
2、蛋白质的抽提
3、蛋白质粗品的制备
4、粗品的进一步分离纯化,纯品的制备
5、最后制成冻干粉或者使蛋白质结晶及保存
图1-1蛋白质分离纯化的一般程序
1.3分离纯化的注意事项
蛋白质种类很多,性质差异也很大,又处于不同的体系中,因此,不可能有一个固定的纯化路线适用于各类蛋白质的分离:
1、要选择一种含有较多的目的蛋白质的生物材料;
2、分离步骤要尽可能少,因为提纯的每一步都不可避免地损失部分产品;
3、要建立一个方便灵敏的分析方法。
对酶来说,通常是测定它的活性及其蛋白质含量;
4、尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性。
这除了要求分离流程快速外,分离过程通常保持在低温(4℃)条件下进行。
要避免一切过激因素的影响,因此要注意选择缓冲剂的pH和缓冲容量。
操作过程尽可能是样品中的蛋白质的浓度维持在较高水平。
需要提醒注意的是,即使在提纯过程中很小心,蛋白质结构也要发生一定的变化,因此,提纯后的蛋白质,即使其活力基本上得以保留,它的构象也有可能不同于天然蛋白质构象或者完整功能的构象。
1.4各种纯化技术的使用
所有纯化技术,包括凝胶过滤,离子交换,疏水作用层析和亲和层析都可以用于大规模蛋白质分离纯化。
尽管这些方法可以使用,但每一种方法都有其局限性,这点在设计中是必须注意考虑。
最好是从上一步到下一步条件变化最少。
疏水作用层析可以紧接离子交换层析,这样缓冲液的变化最少,因为大多数蛋白色谱可以在高浓度下和疏水介质结合得更为牢固。
除了更换缓冲溶液之外,凝胶过滤更适用于作为产品最后纯化成型,因为产品的体积很小。
亲和层析是实验室蛋白质纯化的有力方法。
第2章盐析
2.1盐析定义
利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中,溶解度降低而沉淀,从而与其他成分分离的方法。
这种在高分子溶液中加入大量盐,使之析出沉淀的过程,称为盐析。
2.2盐析原理
盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的,也是蛋白质和酶提纯工作应用最早,至今仍广泛使用的方法。
其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加(此时称为盐溶);
当盐浓度不断上升时,蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出,称为蛋白质的盐析。
这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力,当水中加入少量盐类时,由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响,使蛋白质在水中溶解度增大。
但盐浓度增加到一定程度时,蛋白质表面的电荷大量被中和,水化膜被破坏,于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。
盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。
2.3盐的选择
蛋白质盐析常用中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最广的是硫酸铵,其优点是温度系数小而溶解度大(25℃时饱和溶解度为4.1mol/L,即767g/L;
0℃时饱和溶解度为3.9mol/L,即676g/L),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来,而且硫酸铵价廉易得,分段效果比其他盐好,不容易引起蛋白质变性。
应用硫酸铵时,对蛋白氮的测定有干扰,缓冲能力比较差,故有时也应用硫酸钠,如盐析免疫球蛋白,用硫酸钠的效果也不错,硫酸钠的缺点是30℃以上溶解度太低。
其他的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好,但也由于溶解度太低,受温度影响大,故应用不广。
硫酸铵浓溶液的pH在4.5~5.5之间,市售的硫酸铵常含有少量游离硫酸,pH值往往降至4.5以下,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。
2.4影响盐析的因素
1、蛋白质的浓度:
盐析时,溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响,既可影响蛋白质沉淀极限,又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高,所需盐的饱和度极限愈低,但杂蛋白的共沉作用也随之增加,从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
2、离子强度:
各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同,析出的成分就不同,饱和度为50%时,少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出;
饱和度为33%时γ球蛋白析出。
3、盐的性质:
最有效的盐是多电荷阴离子。
4、PH值:
一般说来,蛋白质所带净电荷越多,它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质,也就改变了蛋白质的溶解度。
在等电点时,蛋白质溶解度最小容易沉淀析出,因此,盐析时除个别情况外,pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。
5、温度:
盐析时温度要求并不严格,一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质,则应于低温下盐析。
6、蛋白质沉淀时间:
蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜,以形成较大沉淀而易于分离。
2.5脱盐
蛋白质、酶用盐析法沉淀分离后,常需脱盐才能获得纯品。
最常用的脱盐方法是透析法。
把蛋白质溶液装入透析袋中,袋的二端用线扎紧,然后用蒸馏水或缓冲液进行透析,这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中,蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内,通过不断更换蒸馏水或缓冲液,直至袋内盐分透析完毕。
透析需要较长时间,常在低温下进行,并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。
第3章层析技术
3.1离子交换层析
离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
1848年,Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。
本世纪40年代,出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。
50年代,离子交换层析进入生物化学领域,应用于氨基酸的分析。
目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法,广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
常用的离子交换剂有:
离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。
3.1.1基本原理
离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管中进行的。
离子交换剂为人工合成的多聚物,其上带有许多可电离基团,根据这些基团所带电荷不同,可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。
含有欲被分离的离子的溶液通过离子交换柱时,各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争性结合。
任何离子通过柱时的移动速率决定于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。
离子交换剂是由基质、荷电基团和反离子构成,在水中呈不溶解状态,能释放出反离子。
同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合,结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。
假定以RA代表阳离子交换剂,在溶液中解离。
解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的交换反应,反应式如下:
RA+B+
=
RB+A+
该反应能以极快的速率达到平衡,平衡的移动遵循质量作用定律。
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力,结合力的大小取决于离子交换剂的选择性。
离子交换剂的选择性可用其反应的平衡常数K表示:
K=[RB][A+]/[RA][B+]。
如果反应溶液中[A+]等于[B+],则K=[RB]/[RA]。
若K>
1,即[RB]>
[RA],表示离子交换剂对B+的结合力大于A+;
若K=1,即[RB]=[RA],表示离子交换剂对A+和B+的结合力相同;
若K<
1,即[RB]<
[RA],表示离子交换剂对B+的结合力小于A+。
K值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数,故称K值为离子交换剂对A+和B+的选择系数。
溶液中的离子与交换剂上的离子进行交换,一般来说,电性越强,越易交换。
对于阳离子树脂,在常温常压的稀溶液中,交换量随交换离子的电价增大而增大;
两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力,主要决定于它们的理化性质和特定的条件下呈现的离子状态。
当PH<
pI时,能被阴离子交换剂吸附。
若在相同pI条件下,且pI>
pH时,pI越高,碱性越强,就越容易被阳离子交换剂吸附。
离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团,吸附溶液中相反电荷的离子或离子化合物,被吸附的物质随后为带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。
由于各种离子或离子化合物对交换剂的结合力不同,因而洗脱的速率有快有慢,形成了层析层。
图3-1原理图
图3-2原理图
3.1.2离子交换剂的种类和性质
1、离子交换剂的基质
离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成,聚苯乙烯离子交换剂(又称为聚苯乙烯树脂)是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。
聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。
但它与水的亲和力较小,具有较强的疏水性,容易引起蛋白的变性。
故一般常用于分离小分子物质,如无机离子、氨基酸、核苷酸等。
以纤维素(Cellulose)、球状纤维素(Sephacel)、葡聚糖(Sephadex)、琼脂糖(Sepharose)为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力,适合于分离蛋白质等大分子物质,葡聚糖离子交换剂一般以SephadexG-25和G-50为基质,琼脂糖离子交换剂一般以SepharoseCL-6B为基质。
关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
2、离子交换剂的电荷基团
根据与基质共价结合的电荷基团的性质,可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。
阳离子交换剂的电荷基团带负电,可以交换阳离子物质。
根据电荷基团的解离度不同,又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。
它们的区别在于它们电荷基团完全解离的pH范围,强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离,而弱酸型完全解离的pH范围则较小,如羧甲基在pH小于6时就失去了交换能力。
一般结合磺酸基团(-SO3H),如磺酸甲基(简写为SM)、磺酸乙基(SE)等为强酸型离子交换剂,结合磷酸基团(-PO3H2)和亚磷酸基团(-PO2H)为中等酸型离子交换剂,结合酚羟基(-OH)或羧基(-COOH),如羧甲基(CM)为弱酸型离子交换剂。
一般来讲强酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子小,弱酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子大。
阴离子交换剂的电荷基团带正电,可以交换阴离子物质。
同样根据电荷基团的解离度不同,可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。
一般结合季胺基团(-N(CH3)3),如季胺乙基(QAE)为强碱型离子交换剂,结合叔胺(-N(CH3)2)、仲胺(-NHCH3)、伯胺(-NH2)等为中等或弱碱型离子交换剂,如结合二乙基氨基乙基(DEAE)为弱碱型离子交换剂。
一般来讲强碱型离子交换剂对OH-离子的结合力比Cl-离子小,弱酸型离子交换剂对OH-离子的结合力比Cl-离子大。
3、交换容量
交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量,它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。
通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量,又称为总交换容量,它只和离子交换剂本身的性质有关。
在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量,它不仅与所用的离子交换剂有关,还与实验条件有很大的关系,一般又称为有效交换容量。
后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。
影响交换容量的因素很多,主要可以分为两个方面,一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。
这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。
样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。
一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入,这样样品组分与离子交换剂作用面积大。
分离小分子样品,可以选择较小孔隙的交换剂,因为小分子可以自由的进入孔隙,而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。
对于较大分子样品,可以选择小颗粒交换剂,因为对于很大的分子,一般不能进入孔隙内部,交换只限于颗粒表面,而小颗粒的离子交换剂表面积大。
另一些影响因素如实验中的离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。
一般pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大,如对于弱酸型离子交换剂在pH较高时,电荷基团充分解离,交换容量大,而在较低的pH时,电荷基团不易解离,交换容量小。
同时pH也影响样品组分的带电性。
尤其对于蛋白质等两性物质,在离子交换层析中要选择合适的pH以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。
一般来说,离子强度增大,交换容量下降。
实验中增大离子强度进行洗脱,就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。
离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数(meq/mg或meq/ml)来表示。
通常可以由滴定法测定。
阳离子交换剂首先用HCl处理,使其平衡离子为H+。
再用水洗至中性,对于强酸型离子交换剂,用NaCl充分置换出H+,再用标准浓度的NaOH滴定生成的HCl,就可以计算出离子交换剂的交换容量;
对于弱酸型离子交换剂,用一定量的碱将H+充分置换出来,再用酸滴定,计算出离子交换剂消耗的碱量,就可以算出交换容量。
阴离子交换剂的交换容量也可以用类似的方法测定。
对于一些常用于蛋白质分离的离子交换剂也通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示,一般这种表示方法对于分离蛋白质等生物大分子具有更大的参考价值。
实验前可以参阅相应的产品介绍了解各种离子交换剂的交换容量。
3.1.3离子交换层析实验操作
离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
1、离子交换剂预处理和装柱
对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒,以保证有较好的均匀度,对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。
溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理,使之成为带H+或OH-的交换剂型。
阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理,使最终转为-OH-型或盐型交换剂;
对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理,使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。
已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。
为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层,要适当加压装柱,同时使柱床压紧,减少死体积,有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗,直至达到充分平衡方可使用。
2、加样与洗脱
加样:
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度,所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围,同时要注意离子强度应低,可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。
样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前,以离心法除去。
为了达到满意的分离效果,上样量要适当,不要超过柱的负荷能力。
柱的负荷能力可用交换容量来推算,通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%。
洗脱:
已结合样品的离子交换前,可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱,也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂的组份分离完全,往往需要逐步改变pH或离子强度,其中最简单的方法是阶段洗脱法,即分次将不同pH与离子强度的溶液加入,使不同成分逐步洗脱。
由于这种洗脱pH与离子强度的变化大,使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱,纯度较差,不适宜精细的分离。
最好的洗脱方法是连续梯度洗脱。
两个容器放于同一水平上,第一个容器盛有一定pH的缓冲液,第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液,两容器连通,第一个容器与柱相连,当溶液由第一容器流入柱时,第二容器中的溶液就会自动来补充,经搅拌与第一容器的溶液相混合,这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。
第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算:
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积:
C1、C2分别表示容器中溶液的浓度;
V为流出体积对总体积之比。
当A1=A2时为线性梯度,当A1>A2时为凹形梯度,A1>A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求:
(1)洗脱液体积应足够大,一般要几十倍于床体积,从而使分离的各峰不致于太拥挤。
(2)梯度的上限要足够高,使紧密吸附的物质能被洗脱下来。
(3)梯度不要上升太快,要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。
目的物的过早解吸,会引起区带扩散;
而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
3、洗脱馏份的分析
按一定体积(5-10ml/管)收集的洗脱液可逐管进行测定,得到层析图谱。
依实验目的的不同,可采用适宜的检测方法(生物活性测定、免疫学测定等)确定图谱中目的物的位置,并回收目的物。
4、离子交换剂的再生与保存
离子交换剂可在柱上再生。
如离子交换纤维素可用2mol/:
NaCl淋洗柱,若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱;
若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生,也可用乙醇洗涤,其顺序为:
0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。
保存离子交换剂时要加防腐剂。
对阴离子交换剂宜用0.002%氯已定(洗必泰),阳离子交换剂可用乙基硫柳汞(0.005%)。
有些产品建立用0.02%叠氮钠。
3.1.4离子交换层析的应用
离子交换层析的应用范围很广,主要有以下几个方面。
1、水处理
离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法,聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。
纯水的制备可以用蒸馏的方法,但要消耗大量的能源,而且制备量小、速度慢,也得不到高纯度。
用离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。
一般是将水依次通过H+型强阳离子交换剂,去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质;
再通过OH-型强阴离子交换剂,去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质,即可得到纯水。
再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化,就可以得到纯度较高的纯水。
离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。
2、分离纯化小分子物质
离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。
例如对氨基酸的分析,使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂,将氨基酸混合液在pH2~3上柱。
这时氨基酸都结合在树脂上,再逐步提高洗脱液的的离子强度和pH,这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来,可以进行分离鉴定。
目前已有全部自动的氨基酸分析仪。
3、分离纯化生物大分子物质
离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的,是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。
由于生物样品中蛋
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