蛋白纯化protocol.docx
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蛋白纯化protocol.docx
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蛋白纯化protocol
常见的实验注意事项
●珍贵的亲和层析树脂常常发生结块该如何办?
可用0.1NNaOH/0.1%SDS洗结块
●Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该如何办?
尽快用0.1NHCl冲洗
●Nandrop:
帐号李大伟教师(lidw)密码:
62732710
●自己的超声波:
用大10头,功率600W;用小3头,功率不大于200W
●若是pcr不成功,可能是pfu出了问题,或许是pfu没有活力(太多,太少或buffer不对)
●做酶切回收的质粒必然要用kit提
●质粒连不上可能是胶回收问题,最好加异丙醇,终浓度可达50%
●做SDS-PAGE的30%丙烯酰胺必然要过滤
●蛋白质离心浓缩必然要用水平转子
●蛋白质纯化必然用milliQ的水,最好每步都加1mMDTT
●所有的FPLC柱子和填料必然要用20%乙醇保留
●monoQ结合蛋白质洗脱不下来,可能都被monoQ吸附上杂质或长菌,可能是柱子上滤膜出了问题
MonoQ洗柱子的方式:
(实在不行从头灌柱)isopropanol10vol;1MNaCl10vol;HCl,饱和EDTA,0.5%triton,一些CTAB,10vol;1MNaCl10vol;0.0MNaCl10vol每周都要洗一次
Superpose6洗柱子的方式:
(实在不行从头灌柱)isopropanol10vol;1MNaCl10vol;0.5MHCl,饱和EDTA,0.5%triton,一些CTAB,10vol;1MNaCl10vol;0.0MNaCl10vol
pH8调到用1M溶液调pH值pH6.01:
4,一样是1:
10
pet15b加上MetMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM共21个氨基酸
pet32b除去trxMHHHHHHSSGLGGENLYFQGS共21个氨基酸
300ml10NNaOH非精制胰蛋白胨/L
370ml10NNaOH精制胰蛋白胨
Tev:
◆可溶于碱的污染物
0.1mol/LNaOH洗涤Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤结合缓冲液洗涤
能够除去诸如脂类、蛋白质和核酸这种的污染物。
◆关于疏水性污染物
乙醇溶液(如70%的乙醇)或非离子型的去污剂洗涤
能够除去脂类和其他的疏水性物质。
◆金属污染物
EDTA饱和的10mmol/LHCl(即pH=2)处置柱子
◆沉淀物杂质
去污剂、尿素和盐酸胍,可将柱子在6mol/L的尿素中平稳和温育,然后用去离子水缓和冲液洗涤
Centrifugesamplestoavoidtheriskofnon-specificbindingofthetargetmoleculetoa
filter.Samplessuchasserumcanbefilteredthroughglasswooltoremoveremaininglipids.
Non-specificcause:
proteinsbindingtomediumand/ortotheplastictubesorthepresence
ofproteinaggregatesthatco-precipitatewiththeimmunecomplex
ItisreportedthatCHAPSstabilizesGRandpreventsnon-specificadsorptionofGRtotubesandmono-beads[andMethodsMol.Biol.176(2001),p.55.||].
载体:
7.5ul
NEBbuffer21ul
T4dnapol
100mm
100mmDtt0.5ul
反映体系于22℃30min后,75℃20min将酶灭活。
(另:
一个文献上没有说明的优势,NEBT4DNAPOL在一般的限制性内切酶Buffer中的活性为100%,也确实是说,载体酶切后不用乙醇沉淀,就能够够直接用于T4处置,简化了实验流程,节省时刻pfu也能够,
实验室协议
前期工作
1.进查是不是已经有结构发表,专门注意unreleased部份
2.进cn.expasy.org搜索目标基因,输入基因名,找出对应的种属
把之下载,看看那个蛋白质的大体性质,如是不是有发表的结构、功能、是不是有跨膜区、所含的domain(能够进入、pfam和smart看看)、氨基酸序列、mRNA或genomicDNA序列等。
3.找出蛋白所对应的mRNA序列
若是基因是从他人取得,直接向他人要mRNA序列或DNA序列
若是基因是从库中PCR取得,那么从ncbi()中输入基因名,找出对应的种属。
点击进入,里面有很多文献,介绍内容比较全面,找出mRNAandProtein(s)点击找出mRNA序列或genomicDNA序列
结构预测
1cn.expasy.org中找出
下的
里面的内容很全,有计算计算等电点和分子量
预测蛋白酶可能的酶切位置
Tertiarystructureprediction
在咱们关切的Secondarystructureprediction下
主若是最出名,也是最经常使用的
固然还有也偶然用一下
2.另外一个预测的站点:
那个站点能够预测蛋白质的各个domain的可能位置,能够可能告知咱们在哪里把蛋白切掉比较适合,里面的结果也含有的结果。
1.进查是不是有发表的结构时,发觉有很多没有unreleased部份。
这是不是代表结构已经解出,我要舍弃那个蛋白?
差不多能够这么说。
只是还要看情形,若是他人解出的蛋白质仅是部份序列,那若是做别的片段或全长就能够够做。
仍是确实是若是做复合物也仍是能够做。
omain的复合物,这种情形下还能够做那个蛋白的结构吗?
若是做得和他人的不一样,也是能够做的。
若是很类似的话,发文章就很难发好杂志。
3.有些蛋白在搜索结果是Noexactmatchesfound,sofuzzysearchused,这是不是代表没有做出结构?
差不多能够这么说。
3.寻觅同源的结构:
在UniprotKnowledgebase当选择Proteinstructuresequence.再输入序列即可运行.
一样以为最小的大于0.01(或同源性低于30%以上;有时e-20,),就以为没有同源的结构被解出.
越小,不同越小.
设计引物
我最经常使用的软件的generunner,下面是我按generunner的内容来介绍如何设计引物
1.实验室经常使用的载体:
gstmt(载体模板是pgex-4T-2,TEV,通过LIC方式连接,GSTtag,氨苄抗性)
32bmt(载体模板是pet32b,TEV,通过LIC方式连接,Histag和Trxtag,氨苄抗性)
32bsumomt(载体模板是pet32b,TEV,通过LIC方式连接,sumotag和两个Histag,氨苄抗性)
2.实验室经常使用的菌种:
克隆菌种:
DH5α
表达菌种:
BL21(DE3),Rosetta2(DE3),RosettagamiBplys(DE3)
更多的见另外一个表
3.设计primer一样是在上述的二级结构预测的基础上进行的,有点常见的要求:
a:
一样匹配的碱基18个左右,我主若是依照匹配碱基的温度大于等于54度。
温度=A或T含量×2+G或C含量×4
b:
把酶切位点加在匹配的碱基的5’端,注意不要错位避免产生乱码。
c:
若是不想通过T载体连接,一样要求在酶切位点外加3-4个爱惜碱基。
d:
要认真查所设计的酶切位点,避免所表达的蛋白碱基也有设计的酶切位点
e:
最好在设计以后再认真检查所有的引物一遍。
Theprotocolofexpressgene
LICProtocol
1.载体(必然要用kit提质粒,必需是从无甲基化菌种提的质粒,无dcm,dam甲基化)用STUI单酶切(bufferM,takara),PCR产物(PCR尽可能少用Taq)别离用凝胶回收(必然要回收)后,载体(能够不用凝胶回收,直接乙醇沉淀即可)重溶20-40ul,PCR重溶30-50ul.
2.pfu结尾处置
Fragment(PCR)7ul
Pfu()0.25
dATP(10mM)takara0.5
pfuBuffer(×10无Mgcl2)1
25mMMgcl2
H2O1
Total10ul
72度反映30min
Fragment(Vector)7ul
Pfu()ul
dTTP(10mM)ul
pfuBuffer(×10无Mgcl2)1
25mMMgcl2
H2O1
Total10ul
72度反映30min
72度反映30min
3.连接
Fragment(PCR)10ul
Fragment(Vector)5ul
T4ligaseBuffer2ul
H2
不用调pH直接连接有点,不加连接酶不行
16度放置2-20小时,加入感受态细胞DH5alpha或top10,置于冰上30min,42度热激90s,冰上放置5min,将菌液涂于相应抗性的Amp平板上。
4.把平板放置在37度培育箱中,一样培育12-20小时.挑选克隆小摇并进行验证.
5.Transformedtherightplasmidtoexpressioncell(BL21(DE3),Rossetta(DE3),ER2566)andexpressthetarget.
6.TheexpresscellwasaddedtoLBbuffercontaintherightresistance,andshakeat37degree.WhentheOD600reachat0.6-0.8,addIPTGtotheLBbuffermakethefinalconcentrationofIPTGis1mM,andshake3-5hat37degreeor25degreeovernight.
7.Centrifugedthecellat4000rpm15min,collecttheprecipitation.
GST蛋白的纯化方式
所有的水必需是MillQ的水!
!
!
蛋白纯化进程尽可能减少泡沫
1.1/20-1/50体积的缓冲液(20mMTrisand500mMNaCl,0.1-1mg/mllysozyme,1mMDTT后加,0.1%-1%tritonX-100(一样在最后用于长晶体的蛋白时不要))搅起细胞,常常要用研磨器把大跎的菌体分散,一样加入1mMPMSF,4度放置30分钟,再4度冰上超声破碎细胞(6min,2secon,4secoff,30%功率)。
2.4度12000rpm离心1小时.若是蛋白是可溶的,搜集上清。
若是不可溶,那么搜集沉淀,另外用别的方式处置包涵体,有时要留样跑胶。
3.对上清归并,把溶液调为TrispH7.3,能够上GSTbeads(见后面如何平稳的柱子)
4.用恒流泵循环过GSTbeads3次,每次流速约2ml/min.
5.用buffer(20mMTrisand500mMNaCl,1mMDTT)洗柱子10个柱体积,把液体流尽。
下面的方式选一个
6a.可用1-2柱体积的buffer(20mMTrisand150mMNaCl,这时pH值或盐浓度能够改变,1mMDTT),再加1/100体积的TEV蛋白酶4度留宿切。
第二天搜集液体。
柱子能够用(0.1Msodiumacetate+0.5MNaCl,pH4.5)的溶液洗,或下面的溶液洗。
若是是第一次做,最好先保留,等SDS-PAGE结果出来后再说。
6b.用含10mMGSH(还原型的谷胱甘肽)的buffer(20mMTris,150mMNaCl,1mMDTT,这时必然要调pH值,保证pH值要对,因为谷胱甘肽很酸)。
若是保留的话,要加甘油至最终10-15%的甘油并保留在-86度。
最后GSTbeads保留20%乙醇中,在4度的冰箱中保留。
GSTbeads的再生方式:
washingthegelwith2-3bedvolumesofalternatinghighpH(0.1MTris-HCl+0.5MNaCl,pH8.5)andlowpH(0.1Msodiumacetate+0.5MNaCl,pH4.5)buffers.Thiscycleshouldberepeated3times
GSTbeads的平稳方式:
equilibrationwith3-5bedvolumesof缓冲液(20mMTrisand500mMNaCl,1mMDTT)
His蛋白的纯化方式
所有的水必需是MillQ的水!
!
!
蛋白纯化进程尽可能减少泡沫
1.1/20-1/50体积的缓冲液(20mMTrisand500mMNaCl,0.1-1mg/mllysozyme,5-20mM咪唑,0.1%-1%tritonX-100(一样在最后用于长晶体的蛋白时不要))搅起细胞,常常要用研磨器把大跎的菌体分散,一样加入1mMPMSF,4度放置30分钟,再4度冰上超声破碎细胞(6min,2secon,4secoff,30%功率)。
2.4度12000rpm离心1小时.若是蛋白是可溶的,搜集上清。
若是不可溶,那么搜集沉淀,另外用别的方式处置包涵体。
3.对上清归并,一样情形下不用调溶液的pH值,能够上已经平稳好的Hisbeads(见后面的平稳方式)
4.用恒流泵循环过Hisbeads3次,流速约2ml/min.
5.用buffer(20mMTrisand500mMNaCl,20mM咪唑)洗柱子10个柱体积,把液体流尽。
这一步骤从实验的结果来看仍是要的.
6.用buffer(20mMTrisand500mMNaCl,60mM咪唑那个浓度能够改)洗柱子10个柱体积,把液体流尽。
有时那个步骤会洗下目标蛋白。
7.用buffer(20mMTris,(这时pH能够依照蛋白质的等电点改变),150mMNaCl,250mM-500mM咪唑)或用不含咪唑的、低pH如4的溶液或EGTA或EDTA洗脱洗脱柱子1-2个柱体积,搜集保留。
8.最好通过浓缩的方法把上述搜集液体中的咪唑去掉.若是保留的话,要加甘油至最终10-15%的甘油并保留在-86度.
最后Hisbeads保留20%乙醇中,在4度的冰箱中保留。
Hisbeads的再生方式:
washingthegelwith2-3bedvolumesof50mMEDTA溶液至beads完全变成白色,接着用2-3bedvolumesof水洗,再加2-3bedvolumesof50mMNiCl2溶液beads完全变成兰色.
Hisbeads的平稳方式:
equilibrationwith3-5bedvolumesof缓冲液(20mMTrisand500mMNaCl,1mMDTT)
破细胞溶液:
20mMTrispH8,0.5%triton,10mM咪唑500mMNaCl,没有加pmsf.用60mm咪唑,20mMTrispH8,500mMNaCl漂洗,最后用20mMTrispH8,250mM咪唑,300mMNaCl洗脱;浓缩时必然加盐
所有的水必需是MillQ的水!
!
!
若是是TA克隆转的T载体,平板不长菌,一样有几种缘故:
一、感受态的转化效率;
二、操作的缘故
3、SOC培育基
4、抗性是不是正确
你能够参考以上几点找找缘故。
片段加A后需要进行纯化,纯化在与载体连接。
4、取10ul连接产物(若是做电转化,连接产物需要纯化)加入至100ul化学转化感受态细
胞(DH5α或JM109等感受态细胞,转化效率在5×106cfu/ugpUC19DNA以上)中冰浴
15分钟。
5、42度热击70-90秒(依照离心管厚薄调整时刻)后,再在冰浴15分钟。
6、加入890ulSOC培育基,37℃振荡(150rpm/min)培育1小时
2、什么缘故PCR产物难以插入载体?
A、确认PCR反映利用的Taq酶在PCR产物的3’端是不是附加了“A”。
高保真Taq酶扩增
的PCR产物是平端,不能直接用于TA克隆;PCR产物保留时刻不要太长,长时刻保留
的PCR产物会脱去结尾的“A”碱基。
B、胶回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时刻太长。
C、确认感受态细胞的转化效率,利用的感受态细胞1ngpUC18质粒至少应取得1000个以
上的转化子,如有问题,从头制备感受态细胞。
D、确认抗生素利用是不是正确,pBM-T载体为Amp抗性,工作浓度100ug/ml。
E、最好利用新配制的平板培育基。
F、连接中利用了不适当的载体:
插入片段比例,关于极小的PCR产物进行克隆,极可能
因为PCR产物严峻过量,致使无菌落或菌落极少
寄存:
超级感受态细胞必需从干冰输送包装箱掏出直接放入–80°C冰箱的底部。
必然不要用液氮来存感受态细胞。
寄存条件:
超级感受态细胞对微小的温度改变也极度灵敏,因此必需寄存在–80°C冰箱的底部。
即便是将细胞从一个冰箱转移到另一个冰箱也会致使转化效率的损失。
采纳BDFalcon的14ml聚丙烯圆底试管:
在转化实验中利用圆底14-mlBDFalcon聚丙烯试管(货号#352059)也是关键之一。
一样的试管容易被b-巯基乙醇降解。
而极为重要的热激步骤的操作也是依照这种型号的试管优化的。
分装细胞:
分装细胞时务必维持置于冰上。
将聚丙烯管放置在冰上等待细胞融化,分装的细胞装入预冷的试管中。
而且,每次转化都用100ml细胞也很重要,减少细胞体积必然减少转化效率。
利用b-巯基乙醇(b-ME):
已经证明b-ME能够帮忙提高转化效率。
Stratagene提供的b-ME已通过稀释,能够直接利用。
其它来源的b-ME利历时请参考相关文献。
利用NZY+肉汤:
Stratagene的超级、高级感受态细胞在热激处置后用NZY+培育基菌落生长最好。
用其它培育基替代往往会造成效率降低。
Ican'tgiveamechanism,butIcantellyouthatonemajormethodofmaking
high-efficiencycompetentcells--andoneofwhichtheremanyvariants--uses
DMSOandDTTtoachievemaxiumumefficiency.Apossiblemechanismwouldbethat
_if_therewereanyperiplasmicDNases,whicharelikelytopossessdisulfide
bonds,theDTT(orBME)willinactivatethem.DTTfacilitatestheinactivation
ofextracellularRNasesforthisreason.
Add7ulDTTsolution/200ulculture,swirlandleaveonicefor5mins.
1.42Mβ-mercaptoethanol
Add1.7μlofβ-mercaptoethanolprovidedwiththiskitorafresh
1:
10dilution(ofa14.2Mstock)ofβ-mercaptoethanol[dilutedin
distilledwater(dH2O)]tothe100μlofcompetentcells,givingafinal
concentrationof25mM.
1.细胞生长状态和密度:
不要用通过量次转接或储于4℃的培育菌,最好从-70℃或-20℃甘油保留的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜,可通过监测培育液的OD600来操纵。
DH5α菌株的OD600为时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情形有所不同),这时比较适合。
密度太高或不足均会阻碍转化效率。
2.质粒的质量和浓度:
用于转化的质粒DNA应主若是超螺旋态DNA(cccDNA)。
转化效率与外源DNA的浓度在必然范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过量或体积过大时,转化效率就会降低。
1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。
一样情形下,DNA溶液的体积不该超过感受态细胞体积的5%。
3.试剂的质量:
所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保留于干燥的冷暗处。
4.避免杂菌和杂DNA的污染:
整个操作进程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处置,所有的试剂都要灭菌,且注意避免被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,不然均会阻碍转化效率或杂DNA的转入,为以后的挑选、鉴定带来没必要要的麻烦。
感受态细胞热击42度150sec离心管壁传热不行
TAE
Superose615.5ml250K17.8ml56KDa18.63ml40KDa
显微镜:
旋纽旋至最小,再开/关
Gilson移液枪:
先把量程调至最大,再拧开螺旋,在前端涂上油脂,一个月最好弄一次,2ul的除外.坚决不能用来吸盐酸和有机溶剂.
超声波:
6min,2secon2secoff,50%功率
为了避免被噬菌体污染,实验室不准有放开瓶的LB溶液,专门是提质粒倒掉的LB溶液,提质粒以后的LB溶液,收菌后瓶子中剩余的LB溶液,实验室的大废液要马上到洗手间倒掉.
恒温干燥机:
绝对不能留宿,最后一个人关实验室门时把之关掉,以防
灭菌锅:
用之前把水加到脚刻度处,用完以后必然用放水,
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