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实验技术
分子生物学实验指导
实验一、植物基因组DNA的分离
一.实验目的
掌握从植物组织中分离纯化基因组DNA的方法。
二.实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl).十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethylammomumbromide,简称为CTAB).十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA.RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。
三.实验材料与试剂
材料:
凤仙花幼叶
试剂:
1.2%CTAB抽提缓冲溶液:
CTAB4gNaCl16.364g;
2.1MTris-HCl20ml (PH8.0):
0.5MEDTA8ml,先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,冷却后0.2-1%2-巯基乙醇(400ul);
3.氯仿-异戊醇(24:
1):
先加96ml氯仿,再加4ml异戊醇,摇匀即可。
四.实验步骤
1.2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
2.取少量叶片(约1g)置于研钵中,用液氮磨至粉状;
3.加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液,轻轻搅动;
4.将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中,磨碎液的高度约占管的三分之二;
5.置于65℃的水浴槽或恒温箱中,每隔10min轻轻摇动,40min后取出;
6.冷却2min后,加入氯仿-异戊醇(24:
1)至满管,剧烈振荡2~3min,使两者混合均匀;
7.放入离心机中10000rpm离心10min,与此同时,将600µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中;
8.10000rpm离心1min后,移液器轻轻地吸取上清液,转入含有异丙醇的离心管内,将离心管慢慢上下摇动30sec,使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物;
9.10000rpm离心1min后,立即倒掉液体,注意勿将白色DNA沉淀倒出,将离心管倒立于铺开的纸巾上;
10.60sec后,直立离心管,加入720µl的75%乙醇及80µl5M的醋酸钠,轻轻转动,用手指弹管尖,使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中;
11.放置30min,使DNA块状物的不纯物溶解;
12.10000rpm离心1min后,倒掉液体,再加入800µl75%的乙醇洗涤DNA;
13.10000rpm离心30sec后,立即倒掉液体,将离心管倒立于铺开的纸巾上;数分钟后,直立离心管,干燥DNA(自然风干或用风筒吹干);
14.加入50µl0.5×TE(含RNase)缓冲液,使DNA溶解,置于37℃恒温箱约15h,使RNA消解;
置于-20℃保存.备用。
五.实验注意事项
1.叶片磨得越细越好;
2.移液器的使用;
3.由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。
实验二质粒DNA的提取
一.实验目的
通过本实验掌握碱裂解法提取质粒。
二.实验原理
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
质粒DNA尚在上清中。
三.仪器与试剂
仪器
1. 恒温培养箱
2. 恒温摇床
3. 台式离心机
4. 高压灭菌锅
(二) 试剂
1.溶液I
50mmol/L葡萄糖
25mmol/LTris·HCl(pH8.0)
10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2.溶液II
0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合
3.溶液III
5mol/L乙酸钾60mL
冰乙酸11.5mL
水28.5mL
4.TE缓冲液
10mmol/LTris·HCl
1mmol/LEDTA(pH8.0)
70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
四.实验步骤
1.在5ml含相应抗生素Amp的LB液体培养基中接入单菌落,于37℃振荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中,10000r/min离心1min。
3.吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。
4.将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中,涡旋,使沉淀溶解。
5.加200μL溶液II(新鲜配制),盖紧管皿,快速颠倒5次,混匀内容物,将Eppendo
管放在冰上。
6.加入150μL溶液III(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置5min。
7.10000r/min,离心5min,将上清夜转至另一Eppendorf管中。
8.向上清夜加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min。
10000r/min离心5min。
倒去上清夜,把Eppendorf管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
9.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清夜,真空抽干或空气中
干燥。
10.50μLTE缓冲液,使DNA完全溶解,-20℃保存。
实验三琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一.实验目的
1.掌握制不同浓度的琼脂糖凝胶的方法。
2.学会用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法。
二.实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,如pUC19质粒,有3种构型:
超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA),开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂(opencircularDNA,简称ocDNA),线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂(linearDNA, 简称LDNA)。
这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。
因此电泳后呈3条带,超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。
三.仪器与试剂
(一)仪器
1.琼脂糖凝胶电泳系统
2.凝胶成像系统
3.微波炉
4.移液枪
(二)试剂
1.5×TAE(5倍体积的TAE贮存液)
配1000ml5×TAE:
Tris242g
冰乙酸57.1ml
0.5mol/lEDTA100ml(pH8.0)
2.凝胶加样缓冲液(6×)
溴酚蓝0.25%
蔗糖40%(w/v)
3.琼脂糖
4.溴化乙锭溶液(EB)0.5μg/ml
四.实验步骤
1.制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。
可参照下表:
琼脂糖凝胶浓度/%线性DNA的有效分离范围/kb
0.3 5~60
0.6 1~20
0.7 0.8~10
0.9 0.5~7
1.2 0.4~6
1.5 0.2~4
2.0 0.1~3
称取0.3g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入30ml1×TAE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化,取出摇匀,则为1%琼脂糖凝胶液,按100ml的凝胶加5μl的EB。
2.胶板的制备
取有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙)。
将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。
将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
待胶凝固后,取出梳子,取下橡皮膏,放在电泳槽内。
加入电泳缓冲液至电泳槽中。
3.加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品(可将上一次实验产物作电泳材料)加入加样孔中(记录点样顺序及点样量)。
4.电泳
接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极,DNA片段从负极向正极移动)。
DNA的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过5V/cm。
当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处,停止电泳。
实验四RAPD-PCR技术
一.实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
二.实验原理
运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。
这种方法即为RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA,随机扩增的多态性DNA)。
RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增。
琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片断的多态性,这些扩增产物DNA片断的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。
RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点。
这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3’端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段。
因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入.缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加.缺少或发生分子量的改变。
通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。
分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。
因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。
另外,RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。
三.仪器与试剂
(一)仪器
1.PCR热循环仪
2.PCR管
3.琼脂糖凝胶电泳系统
4.凝胶成像系统
(二)材料与试剂
1.随机引物(10mer)(5μmol/L):
购买成品。
2.Tag酶
3.10×缓冲液
4.MgCl2:
25mmol/L
5.dNTP:
每种2.5mmol/L
四.实验步骤
1.PCR反应体系:
反应物体积/μL
10×buffer2.5
dNTP2.0
随机引物1.0(约5pmol)
MgCl22.0
Taq酶1个单位
Template1(约50ng)
加水至总体积25μL,混匀稍离心。
2.PCR热循环程序
①.94℃预变性2min
②.94℃变性1min
③.36℃退火1min
④.72℃延伸1min
⑤.重复步骤②~④30次;
⑥.72℃延伸10min
3.琼脂糖凝胶电泳
配制0.7%琼脂糖凝胶,取5μL扩增产物电泳。
稳压50-100V(电压低带型整齐,分辨率高)。
电泳结束后,紫外灯下观察结果。
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备
一.实验目的
通过本实验,掌握用CaCl2制备新鲜的感受态。
二.实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。
能接受外源DNA。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
三.仪器.材料与试剂
(一)仪器
1.超净工作台
2.低温离心机
3.恒温摇床
(二)试剂
1.LB平板
2.LB液体培养基
配制每升培养基,应在950ml去离子水中加入:
胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g
酵母提取液(bacto-yeastextract)5g
NaCl10g
摇动容器直至溶质完全溶解,用NaOH调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。
3.氨苄青霉素(Amp)
用无菌水配制成100mg/ml溶液,置-20℃冰箱保存。
4.2倍TSS致敏缓冲液(20ml)
PEG(3350-8000)4g(聚乙二醇,需灭菌)
1MCaCl22ml(需灭菌)
DMSO2ml(不能高压灭菌)
用LB液体培养基定容至20ml(不加Amp)。
四.实验步骤
1.挑取保存菌少许,划于LB平板,37℃过夜。
2.挑取一个单菌落接于200mLLB液体培养基的三角瓶中,18℃,150-250rpm振荡培养20h左右,使OD600=0.3-0.4。
3.用冰预冷的2倍TSS致敏缓冲液于菌液(1:
1)中,冰上温和摇匀,分装至1.5ml预冷的离心管中,并立刻放入液氮中冷却,然后放到-70℃保存。
实验六重组质粒的连接.转化及筛选
一.实验目的
通过本实验学会重组DNA连接.转化以及筛选重组子的方法。
二.实验原理
因载体质粒pBS带有Ampr基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBSDNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。
此为初步的抗性筛选。
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是DNA连接酶的作用下,有Mg2+.ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种:
T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步:
首先,T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物;然后,酶-AMP复合物再结合到具有5′磷酸基和3′羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后,产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法,为了防止载体本身的自连,可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。
因此人们找到了一个折中温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。
重组质粒转化宿主细胞后,还需对转化菌落进行筛选鉴定。
利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。
现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列,此结构称为lacZ′基因。
LacZ′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。
宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性,但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。
LacZ′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补,这种现象称为α互补。
由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)显色出来,它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。
因此,任何携带着lacZ′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后,便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶,在IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)诱导后,在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。
而当有外源DNA片段插入到位于lacZ′中的多克隆位点后,就会破坏α肽链的阅读框,从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽,而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶,因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。
三.仪器.材料与试剂
(一) 仪器
1.恒温摇床
2.恒温水浴锅
3.恒温培养箱
4.低温离心机
(二)试剂
1.连接反应缓冲液(10X)
2.T4DNA连接酶
3.X-gal储液(20mg/ml)
4.IPTG储液(200mg/ml)
5.EcoRI酶
6.DH5α
7.λDNA
8.pUC19质粒
四.实验步骤
(一)质粒重组
1.在灭菌的Eppendorf管中,加入pUC19质粒2μL(2μg/μL),2μL酶切缓冲液,1μLEcoRI酶,无菌双蒸水15μL,至反应混合物总体积为20μL。
离心混匀,37℃反应3h(酶及缓冲液应放在冰上)。
2.在另一无菌Eppendorf管中,加λDNA1.5μg,加1μL酶切反应液,1μLEcoRI酶,无菌双蒸水补到10μL,37℃反应3h。
3.反应完毕后,各取2μL酶解液做电泳分析。
4.分别将余下的酶解液加入1/10体积的3mol/LKAc(pH5.2)溶液,再加2倍体积的无水乙醇,-20℃冰箱,2h(沉淀DNA)。
12000r/min4℃离心15min,弃上清,加70%乙醇洗沉淀物,再离心,去上清,真空干燥后,加5μLTE溶液。
将酶切后的2个DNA片段混合于一管中,加T4DNA连接酶缓冲液1μL,T4DNA连接酶1μL,16℃保温14h,并做转化实验。
(二)连接产物的转化
1.取100μl贮存于-70℃钙化菌,冰浴化开;
2.加入适量连接产物(一般不超过10μl),轻轻混匀,冰浴20min;
3.于42℃热休克90s,迅速转移至冰浴中,继续冰浴2-3min;
4.加入LB液体培养基200μl,于37℃缓摇孵育45min;
5.将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板(根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG),待胶表面没有液体流动时,37℃温箱倒置培养12-16hr。
6.放于4℃数小时,使显色完全(带有重组质粒转化子由于丧失了β半乳糖苷酶活性,为白色菌落,而没有携带重组质粒转化子的为蓝色菌落)。
学时分配:
实验一:
植物基因组DNA的分离,4个学时;
实验二:
质粒DNA的提取,3个学时;
实验三:
琼脂糖凝胶电泳检测DNA,3个学时;
实验四:
RAPD-PCR技术,6个学时;
实验五:
大肠杆菌感受态细胞的制备,6个学时;
实验六:
重组质粒的连接.转化及筛选,12个学时。
考核方式:
实验操作加实验报告(各50%)
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