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基因工程复习资料
第二章 分子克隆工具酶
基因工程工具酶
⏹限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割
⏹DNA甲基化酶——用于DNA分子的甲基化
⏹核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割
⏹核酸聚合酶——用于DNA和RNA的合成
⏹核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接
⏹核酸末端修饰酶——用于DNA和RNA的末端修饰
⏹其它酶类——用于生物细胞的破壁,转化,核酸纯化,检测等。
第一节 限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)
一、限制性内切酶的发现历史
核酸酶:
催化核酸酯键的水解
核酸外切酶:
作用于核酸链的末端(3′或5′),逐个水解核苷酸。
核酸内切酶:
从核酸分子内部切断3′,5′磷酸二酯键。
限制性核酸内切酶:
在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。
1、细菌的限制——修饰现象
细菌的限制——修饰作用
发现细菌的限制(restriction)现象:
寄主控制的专一性
phageλK
R-M系统的作用:
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。
保护自身的DNA不受制;破坏外源DNA使之迅速降解
细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA,为避免自身DNA的降解,细菌可以修饰(甲基化酶)自身DNA,未被修饰的外来DNA则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰,则可免予被降解。
限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶,其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染,是细胞中的一种防御机制。
由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。
2、限制性核酸内切酶的发现
限制性核酸内切酶(restrictionendonuelease)
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
它是可以将外来的DNA切断,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶(简称限制酶)。
✓1968Linn和Arber从E.coliB中发现限制酶Ⅰ
✓1970Smith(美)在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ
✓1978W.Arber,H.O.Smith,Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。
✓限制性核酸内切酶(限制酶):
在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列,并对DNA分子进行切割的一种酶。
✓功能:
降解不同源DNA,而不降解同源DNA。
3、限制性核酸内切酶的命名
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。
限制酶的命名是根据细菌种类而定,以EcoRI为例:
E
Escherichia
(属)
co
coli
(种)
R
RY13
(品系)
I
首先发现
在此类细菌中发现的顺序
4、限制与修饰系统的种类
特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
限制和修饰活性
双功能
单一功能
双功能
识别与切割位点
分别,随机切割,相距较远
同一位点
相距5-10bp
对基因工程中意义
无用
非常有用
意义不大
Ⅰ型限制酶(无用)
1968年,M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。
1分子量:
30万dal左右
2组成:
3种亚基
a.特异性亚基:
具特异性识别DNA序列的特性。
b.修饰亚基:
具甲基化酶活性。
c.限制亚基:
具核酸内切酶活性。
3辅助因子:
需Mg2+、ATP和SAM。
4识别和切割位点:
不一致(距识别位点5’一侧数千碱基处随机切割DNA分子)。
Ⅱ型限制酶(十分有用)
1970年,H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。
1分子量:
2万~10万dal(较小)
2组成:
一种多肽,常以同源二聚体形式存在。
3辅助因子:
无需辅助因子,或只需Mg2+。
4识别和切割位点:
相一致。
Ⅲ型限制酶(无用)
1组成:
两个亚基
a.M亚基:
负责位点的识别与修饰。
b.R亚基:
具核酸酶的活性。
2辅助因子:
需Mg2+、ATP和SAM
3识别和切割位点:
不一致(距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子)。
二、限制性核酸内切酶识别的序列
绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的,因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。
在DNA分子双链的特异性识别序列部位,切割DNA分子,产生链的断裂。
2个单链断裂部位在DNA分子上的分布,通常不是彼此直接相对。
断裂结果形成的DNA片段,具有互补的单链延伸末端。
1、限制酶识别序列的长度(限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基,最常见的为6个碱基)
4个碱基识别位点:
Sau3AⅠ↓GATC
5个碱基识别位点:
EcoRⅡ↓CCWGG
NciⅠCC↓SGG
6个碱基识别位点:
EcoRⅠG↓AATTC
HindⅢ A↓AGCTT
7个碱基识别位点:
BbvCⅠ CC↓TCAGC
PpuMⅠ RG↓GWCCY
8个碱基识别位点:
NotⅠGC↓GGCCGC
SfiⅠGGCCNNNN↓NGGCC
当识别序列为4个和6个碱基时,它们可识别的序列在完全随机的情况下,平均每256个和4096个碱基中会出现一个识别位点(44=256,46=4096)。
限制性内切核酸酶
2、限制酶识别序列的结构
II型限制性核酸内切酶的基本特性
识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。
Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)
切口:
平端切口、粘端切口
3、限制酶切割的位置
DNA在限制性核酸内切酶的作用下,使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点,用↓或/表示。
切割的位点:
一般在识别序列内部,如G↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓GG、AGCGC↓T等。
少数在识别序列的两侧,如↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等
三、限制酶产生的末端
1、限制酶产生匹配粘端
若在对称轴5′侧切割底物,DNA双链交错断开产生5′突出粘性末端。
5′-GAATTC-3′ EcoRl 5′-G-OH P-AATTC-3′
3‘—CTTAAG-5’ 3‘—CTTAA-P +OH-G-5'
若在3‘-侧切割,则产生3’突出粘性末端,如PstⅠ:
5'—CTGCAG-3' Pstl 5'—CTGCA-3' 5'—G-3'
3'-GACGTC-5' 3'—G-5' 十 3'-ACGT-5'
2、限制酶产生平末端
在回文对称轴上同时切割DNA的两条链,则产生平末端,如HaeⅢ(GG↓CC)和EcoRV(GAT↓ATC)。
3、限制酶产生非对称突出末端
许多限制酶切割DNA产生非对称突出末端。
当识别序列为非对称序列时,切割的DNA产物的末端是不同的,如BbcⅠ,它的识别切割位点如:
CC↓TCAGC
GGAGT CG
1.S1核酸酶
(1)特点:
活性:
降解单链核酸(DNA或RNA)为单核苷酸;降解双链核酸的单链区
(2)S1核酸酶的应用----RNA分子的定位
2.Bal31核酸酶
Bal31核酸酶的三种活性:
(1)单链核酸内切
(2)双链核酸外切
(3)双链切口对应链
Bal31核酸酶主要用途:
(1)诱发DNA发生缺失突变
(2)定位测定DNA片断中限制性位点的分布
(3)研究超盘旋DNA分子的二级结构
3.其他核酸酶
外切核酸酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ):
3’至5’外切
RNA酶Ⅰ(RNaseⅠ):
切割DNA-RNA杂合链中的RNA
其他核酸酶:
外切核酸酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ):
3’至5’外切
DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ):
随机切割ss&dsDNA
RNA酶Ⅰ(RNaseⅠ):
切割DNA-RNA杂合链中的RNA
4、同裂酶(来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列)
同序同切酶、同序异切酶、同功多位等。
同序同切酶
5、同尾酶
来源不同,识别的核苷酸靶序列也不相同,但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。
BamHⅠBclⅠBglⅡ三种酶可产生相同的5’GATC粘性末端(配伍末端),由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。
四、DNA末端长度对限制酶切割的影响
限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求,也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸,否则限制酶难以发挥切割活性。
限制性核酸内切酶的活性单位
20μLBuffer中,含1μg底物DNA,于最适反应条件和温度下,保温1小时,能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位,用U表示。
五、位点偏爱(Sitepreference)
对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。
六、酶切反应条件
酶切反应系统应组成:
酶、底物和反应缓冲液,并且还需要合适的反应温度。
1、缓冲液:
常规缓冲液一般包括提供稳定pH的缓冲剂、Mg2+、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)。
2、反应温度:
大多数酶的标准反应温度37度。
3、反应时间:
通常是1小时或更多,许多酶延长反应时间可减少酶量。
4、终止酶切的方法:
EDTA可螯合Mg2+,从而可终止酶切反应;加热。
七、星星活性(Staractivity)
限制性内切酶识别特异性放宽
EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割,但如果缓冲液中甘油浓度超过5%,其识别位点发生松动,可在AATT处发生切割,EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星星活性,用EcoRⅠ*表示。
星星活性可造成位点切割机率不等,降解不完全。
影响因素:
甘油浓度高12-20%;酶过量(>100U/μl);离子强度低(<25mol/l);pH过高(>8.0);加入有机溶剂:
45%聚乙二醇(PEG),8%二甲基亚枫,12%乙醇;二价阳离子。
抑制星星活性的措施:
如减少酶的用量(可避免过分酶切),减少甘油浓度,保证反应体系中无有机溶剂或乙醇,提高离子强度到100~150mM(如果不会抑制酶的活性的话),降低反应pH至pH7.0,以及保证使用Mg2+作为二价阳离子。
八、影响酶活性的因素
限制性核酸内切酶反应影响因素:
温度、缓冲液、时间、反应体积和甘油浓度、DNA纯度和结构等。
1、底物DNA
(1)样品DNA的纯度
RNA与E结合影响有效酶浓度;
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等
加大酶的用量,1mgDNA用10U酶
加大反应总体积
延长反应时间
(2)DNA浓度
[DNA]过大,抑制酶活性,影响酶分子扩散
(3)DNA样品的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基,受其影响的酶有BclI、MboI等,但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。
大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基,受其影响的酶有EcoRII等。
哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基。
(4)识别位点及邻近位点特异性序列
如:
pBR322DNA有4个NarⅠ切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。
XmaⅢ切点(CGGCCG)在GGCGGCCGCC时不切割。
(5)DNA二级/三级结构
如:
超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需酶多
(6)提取时混入杂质可改变识别特异性
如:
高浓度Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。
2、反应系统因素
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性,即所谓的Staractivity(星星活性)现象。
EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列,但在甘油浓度超过5%(v/v)时,也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。
(1)缓冲液(无菌、无污染)
(2)金属离子
如:
Ⅱ型酶需Mg2+,若以Mn2+代替Mg2+(如HindⅢ,EcoRI)则特异性改变。
离子浓度不合适会抑制酶活。
(3)牛血清蛋白(BSA)
BSA是酶稳定剂,可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。
过量BSA会引起电泳拖尾。
二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇:
维持酶活性的稳定。
Tris-HCl或Tris-Ac:
维持酶活性适合的pH环境。
限制性核酸内切酶的应用
☐重组DNA前的切割
☐构建新质粒
☐构建物理图谱
☐DNA分子杂交
☐用限制性内切酶消化受体DNA
☐制备DNA探针
☐亚克隆以用作序列分析
☐基因定位,DNA同源性研究
第二节 甲基化酶(methylase)
☐Ⅱ类R-M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两种酶分子组成。
大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶。
☐甲基化酶也称修饰酶(modificationenzyme),用来修饰限制酶的识别序列,使得该序列可以被限制性内切酶识别而免于切割。
一、甲基化酶的种类
1、Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。
2、Dcm甲基化酶Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列,在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。
二、甲基化对限制酶切的影响
1、修饰酶切位点2、产生新的酶切位点3、对基因组作图的影响
第三节DNA聚合酶(DNApolymerase)
指在DNA(或RNA)模板指导下,以4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)为底物,在引物3’-OH末端聚合DNA链的一类酶。
DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。
真核细胞DNA聚合酶种类及作用
在高等真核细胞中现已分离到五种DNA聚合酶,即DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε。
其中α、β、δ和ε存在于细胞核中,γ存在于线粒体中。
⏹DNA聚合酶α染色体的DNA复制
⏹DNA聚合酶β分子较小,参与DNA的修复。
⏹DNA聚合酶γ与线粒体DNA复制有关
⏹DNA聚合酶δ染色体的DNA复制,作用相当于polIII。
⏹DNA聚合酶ε类似于polI,主要参与DNA的修复
⏹DNA聚合酶α与DNA聚合酶δ共同完成DNA复制一般认为DNA聚合酶α仅仅是合成引物,引物再被与DNA聚合酶δ所延伸。
高等真核细胞的DNA聚合酶和细菌DNA聚合酶的性质相似。
它们也以四种脱氧核苷三磷酸作为底物。
聚合反应需要模板和引物以及金属Mg2+(或Mn2+),链的延长方向为5'→3'。
真核细胞的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活力。
真核细胞中DNA的复制过程极可能与原核生物类似,真核生物复制叉的移动速度较慢,但复制总速度可能比原核生物快。
DNA聚合酶种类及作用:
1、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
2、KlenowDNA聚合酶
3、T4噬菌体DNA聚合酶
4、T7噬菌体DNA聚合酶
5、耐热DNA聚合酶
DNA聚合酶共同点:
把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端,催化核苷酸的聚合作用,而不发生从引物模板上解离的情况。
DNA聚合酶的分类:
聚合酶Ⅰ(polⅠ)
聚合酶Ⅱ(polⅡ),聚合酶Ⅲ(polⅢ)。
(参与DNA复制)
DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较:
DNA聚合酶的特点:
①需模板(DNA或RNA);
②需引物;
③具有三种酶活性:
5′→3′聚合酶活性;
5′→3′外切酶活性
3′→5′外切酶活性。
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(E.coliDNApolymerase)
来源:
E.coli,由染色体DNA基因编码。
商品上用的此酶来源于PhageNM964整合的溶源性E.coli。
结构:
单链多肽链,MW=109,000D。
1、大肠杆菌DNA聚合酶I的活性
⏹5′→3′的DNA聚合酶活性
⏹5′→3′的核酸外切酶活性
⏹3′→5′的核酸外切酶活性
⏹交换(置换)反应
5′→3′聚合酶活性
5′→3′外切酶活性
3′→5′外切酶活性
交换反应:
如果只有一种dNTP存在,3′→5′外切核酸酶活性将从3′-OH端降解DNA,然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反应,直到露出与该dNTP互补的碱基。
2、大肠杆菌DNA聚合酶I的用途
切口平移(Nicktranslation)法标记DNA,制备32P标记的探针
DNApolⅠ的5‘→3’聚合活性和5‘→3’外切酶活性协同作用,可以使DNA一条链上的切口从5‘→3’方向移动,这种反应叫做缺刻平移(nicktranslation)。
DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通过DNA缺口平移,制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。
此时,DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’聚合酶活性同时发生。
DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通过DNA缺口平移,制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。
32P标记的DNA杂交探针的制备
探针:
用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针。
标记物:
探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。
分子杂交:
探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交(molecularhybridization)。
二、KlenowDNA聚合酶
来源:
E.coliDNAPolymeraseⅠ经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970)
Klenow酶的基本用途:
☐补平由核酸内切酶产生的3′凹端
☐DNA片段的同位素末端标记
☐cDNA第二链的合成
☐双脱氧末端终止法测定DNA序列
补平由核酸内切酶产生的3′凹端:
DNA片段的同位素末端标记:
Klenow在有底物存在时则聚合;无底物时只进行3′→5′外切。
但Klenow作用不如T4DNA聚合酶3′→5′外切酶活性。
三、T4DNA聚合酶
来源:
T4Phage感染的E.coli
结构:
MW=114,000d
活性:
5′→3′聚合活性;
3′→5′外切活性,对单链活性大于双链DNA,外切酶活性比Klenow大200倍
用途:
填补或标记限制酶切后产生的3′-凹缺末端。
(同Klenow)
四、T7DNA聚合酶
来源:
T7Phage感染的E.coli
结构:
由2个蛋白亚基组成:
T7phagegene5蛋白+宿主硫氧还蛋白
活性:
5′→3′聚合,持续反应时间最长,所以合成的DNA链长。
故在DNA测序中很优越。
3′→5′外切,是Klenow聚合酶的1000倍。
用途:
复制较长的模板,在测序中可读出较长的序列,用填补或交换反应快速进行末端标记。
Ø活性与T4DNApol、KlenowDNApol一样。
Ø定点突变中互补链的合成。
修饰的T7DNA聚合酶(测序酶)
来源:
天然T7DNA聚合酶经修饰处理
结构:
同T7聚合酶。
用还原剂、分子氧、低浓度Fe2+与酶保温几天,可使PhageT7gene5蛋白N-端3′→5′外切酶活性中心失活(O-修饰)。
即:
5′→3′聚合酶作用提高,持续性长。
3′→5′外切作用下降99%以上。
五、TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus)
来源:
从耐热细胞中纯化,已有基因工程酶多种。
结构:
单亚基MW=94,000d。
活性:
聚合最适温度为75-80℃,不具3′→5′外切酶活性,具5′→3′外切活性。
用途:
PCR反应。
测序,高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。
六、反转录酶(reversetranscriptase)依赖于RNA的DNA聚合酶
来源:
来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。
来自能表达Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的E.coli。
结构和活性:
酶类别
肽链
5’-3’聚合活性
RNAseH
AMV
α62,000
β94,000
+
+++
M-MLV
84,000
+
+
⏹5‘→3‘的DNA聚合酶活性(需要Mg2+)
⏹5‘→3‘RNA核酸外切酶活性(RNAseH)
⏹3‘→5‘RNA核酸外切酶活性(RNAseH)
产生含5′磷酸及3′羟基的长4~20个碱基的核苷酸。
反
转录酶的基本特性:
以RNA为模板聚合cDNA链。
反转录酶的基本特性:
双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。
反转录酶用途:
对RNA-DNA杂交体中的RNA特异性地降解,免除了在反转录完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。
七、末端转移酶(terminaltransferase)(末端脱氧核苷酸转移酶(TdT))
来源:
来自小牛胸腺,只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。
结构:
MW=60,000d.
活性:
催化dNTP掺入DNA3′-OH末端,形成同聚物末端;反应不需模板DNA,需Co2+或Mg2+。
用途:
克隆DNA片段时加上互补同聚物末端,便于与载体连接。
末端标记
来TdT的基本特性:
不需要模板的DNA聚合酶,随机掺入dNTPs。
第四节 其他分子克隆工具酶
☐依赖于DNA的RNA聚合酶
☐连接酶
☐T4多核苷酸激酶
☐碱性磷酸酶
☐核酸酶
☐核酸酶抑制剂
☐琼脂糖酶
☐DNA结合蛋白
☐其他酶
一、依赖于DNA的RNA聚合酶(DNAdependentRNApolymerase)
来源(包括三种酶)
ØT7、T4噬菌体RNA聚合酶在
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