RTPCR实验报告.docx
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RTPCR实验报告.docx
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RTPCR实验报告
逆转录pcr
rt-pcr为反转录rcr(reversetranscriptionpcr
)和实时pcr(realtimepcr)共同的缩写。
逆转录pcr,或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr,rt-pcr),是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr中,一条rna链被逆转录成为互补dna,再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作"逆转录",由依赖rna的dna聚合酶(逆转录酶)来完成。
随后,dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶h降解,留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种rna的含量。
(检测基因表达的方法,参见northernblot法。
)
rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-timepcr)。
为了与逆转录pcr相区别,通常被写作"定量pcr"(quantitativepcr)或者rtq-pcr(real-timequantitativepcr)。
实时pcr
实时pcr(real-timepcr),属于定量pcr(q-pcr)的一种,以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
realtimepcr的定量使用萤光色素,目前有二种方法。
一种是在dsdna中插入特异的萤光色素;另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针(probe)。
realtimepcr与reversetranscriptionpcr相结合,能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rtpcr的组合又被称之为"定量rt-pcr(quantitativert-pcr)"
rt-pcr技术相关试剂
oligo:
多聚体,相当于mrna引物
amv(m-mlv):
逆转录酶
dntp:
脱氧核苷酸
rnase:
rna酶抑制剂
pcrbuffer:
rt-pcr缓冲液
mgcl2:
2价镁离子
pcr各步骤的目的
(一)预变性:
破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
使dna充分变性,减少dna复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的dna模板,最好不要吝
啬这个步骤。
此外,在一些使用热启动taq酶的反应中,还可激活taq酶,从而使pcr反应得以顺利进行。
(二)变性--退火--延伸循环:
①模板dna的变性:
模板dna经加热至93℃左右一定时间后,使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板dna与引物的退火(复性):
模板dna经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板dna单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:
dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下,以dntp为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链。
(三)pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟
用pcr仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因:
1.延伸时间取决于待扩增dna片段的长度。
(当然是在反应体系一定的条件下)例如,使用taqdna聚合酶,72度时的碱基掺入率为35-100bp/s,因此延伸速率为1kb/min。
2.根据延伸速率推得,扩增1kb以内的dna片段1min即可,而3-4kb则需要3-4min,依次照推。
通常在最后一轮要适当的将
延伸时间延长至4-10min,这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。
3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外,还有一个作用是:
在用普通taq酶进行pcr扩增时在产物末端加a尾的作用,可以直接用于ta克隆的进行。
什么是半定量pcr
半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitativereversetranscriptionandpolymerasechainreaction,sqrt-pcr)是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方法,通过mrna反转录成cdna,再进行pcr扩增,并测定pcr产物的数量,可以推测样品中特异mrna的相对数量。
以半定量rt-pcr为基础建立起来的mrna含量测定技术,较含内标化的rt-pcr定量测定的mrna的方法更为简便可行。
这种方法不另设'内标准,排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异,而且具有明显的剂量-效益关系和良好的重复性。
步骤:
1.抽提rna,2.反转录获得cdna,3.以cdna为模板做pcr注意:
步骤1,
rna抽提质量一定要好,注意污染。
内参的选择,常用的有βactin和gapdh俩中。
步骤3,半定量rt-pcr应该再两管中进行,既内参和目的基因各一管,这样便于控制,做图的时候可以放在一各泳道里跑!
指数期和平台期一定要摸清楚!
半定量rt-pcr与荧光定量real-timepcr最大的区别就在于semi-pcr需要跑电泳根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低而real-timepcr则无需电泳可以实时监测整个pcr的全程并且由给出的ct值及standardcurve来判断gene拷贝数的高低。
所以由上可见semi-pcr不如real-timepcr精确。
至于rt应该指reversetranscription。
为了便于区分我们更偏好使用qpcr来特指real-timepcr
同时要注意realtime-pcr的定性问题,有时候你扩增出来的很有可能只是引物二聚体。
所以要利用meltingcurve,如果是第一次做一个目的基因的realtime-pcr,还是要在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,以确定与你要扩增的目的基因大小一致。
rt-pcr只能通过模板pcr后扩增的结果间接的反应初始模板的量。
而realtime-pcr的结果直接可以看到初始模板的量。
所以,
realitime-pcr更精确些。
篇二:
rt-pcr实验方法
逆转录pcr(rt-pcr)
实验四逆转录pcr(rt-pcr)【实验目的】1.了解用逆转录pcr法获取目的基因的原理。
2.学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反应(pcr)过程利用模板变性,引物退火和引物延伸的多个循环来扩增dna序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,是一个指数增实验四逆转录pcr(rt-pcr)
【实验目的】
1.了解用逆转录pcr法获取目的基因的原理。
2.学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。
【实验原理】
rt-pcr技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异,细胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。
rt-pcr比其他包括northern印迹、rnase保护分析、原位杂交及s1核酸酶分析在内的rna分析技术,更灵敏,更易于操作。
rt-pcr的基本原理(图4.1)。
首先是在逆转录酶的作用下从rna合成cdna,即总rna中的mrna在体外被反向转录合成dna拷贝,因拷贝dna的核苷酸序列完全互补于模板mrna,称之为互补dna(cdna);然后再利用dna聚合酶,以cdna第一链为模板,以四种脱氧核苷三磷酸(dntp)为材料,在引物的引导下复制出大量的cdna或目的片段。
在rt时,有3种引物可选择(表4.1)。
用1)和2)方法,
理论上是扩增的所有的cdna,还要用此产物做pcr的模板继续扩增。
如果用3)方法,先要去/retype/zoom/7b17bdaf89eb172ded63b7a3?
pn=2&x=0&y=1268&raww=535&rawh=340&o=png_6_0_0_135_265_601_383_892.979_1262.879&type=pic&aimh=305.04672897196264&md5sum=388ad1889e15cfe390decc00721a2ce0&sign=8ccc656492&zoom=&png=48793-106221&jpg=0-0"target="_blank">点此查看
由图4.1不难看出,随机引物法是三种方法中特异性最低的。
引物在整个转录本的多个位点退火,产生短的,部分长度的cdna。
这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的rna模板获得cdna。
为了获得最长的cdna,需要按经验确定每个rna样品中引物与rna的比例。
随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。
因为使用随机引物从总rna合成的cdna主要是核糖体rna,所以模板一般选用poly(a)+rna。
oligo(dt)起始比随机引物特异性高。
它同大多数真核细胞mrna3端所发现的poly(a)尾杂交。
因为poly(a)+rna大概占总rna的1%到2%,所以与使用随机引物相比,cdna的数量和复杂度要少得多。
因为其较高的特异性,oligo(dt)一般不需要对rna和引物的比例及poly(a)+选择进行优化。
建议每20μl反应体系使用0.5μgoligo(dt)。
oligo(dt)12-18适用于多数rt-pcr。
基因特异性引物(gsp)对于逆转录步骤是特异性最好的引物。
gsp是反义寡聚核苷,可以特异性地同rna目的序列杂交,而不象随机引物或oligo(dt)那样同所有rna退火。
用于设计pcr引物的规则同样适用于逆转录反应gsp的设计。
gsp可以同与mrna3最末端退火的扩增引物序列相同,或gsp可以设计为与反向扩增引物的下游退火。
已经制备好的双链cdna和一般dna一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需
有适当的接头(linker),接头可以是在pcr引物上增加限制性内切酶识别位点片段,经pcr扩增后再克隆入相应的载体;也可以利用末端转移酶在载体和双链cdna的末端接上一段寡聚dg和dc或dt和da尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。
本实验是要从小鼠肝脏组织中获取fas配体基因,fas配体(fasl)是一分子量约为40u的ii型跨膜糖蛋白,属tnf家族成员。
活化的t细胞可表达fas和fasl,并通过fas/fasl系统介导细胞凋亡作用,保持机体免疫系统的自稳态。
近年研究发现在部分癌细胞中fasl表达增强,并与肿瘤的复发转移有关。
我们采用rt-pcr方法克隆fasl全长cdna并构建其表达载体,可以为进一步研究fasl的功能提供条件。
在上下游引物的5'端分别加上了限制酶切位点及其保护碱基(即hindiii和bamhi),以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆到原核表达载体pgfpuv上(附录图4.3)。
为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白,我们改造了pgfpuv,在其上加了6×his标签。
【试剂与器材】
(一)试剂
1.总rna(或mrna)
2.rna酶抑制蛋白(rnaseinhibitor):
40u/ml
3.dntp混合物(各10mm)
4.oligo(dt)12-18:
2.5?
mol/l
5.10*逆转录合成缓冲液(10?
rtbuffer):
250mmol/ltris-hcl(ph8.3),375mmol/lkcl,15mmol/lmgcl2
6.amv逆转录酶5u/?
l
7.基因特异性5'和3'引物各20?
mol/l
8.tapdna聚合酶5u/?
l
9.10*pcr缓冲液:
500mmol/lkcl,100mmol/ltris?
cl,在25℃下,ph9.0,1.0%tritonx-100,15mmol/lmgcl2。
(二)器材
1)pcr仪,
2)pcr管,
3)微量移液器
【操作方法】
(一)逆转录:
1)建立rt反应体系:
2)涡旋混匀,42℃反应1小时,95℃加热5分钟,然后置于冰上。
(二)pcr扩增:
1)建立pcr反应体系:
2)将上述反应体系涡旋混匀,按下列程序运行循环:
step2-4运行30个循环,其中复性温度主要依据引物的不同而不同。
(三)取10-20ulpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,余下的pcr产物-20℃保存。
【注意事项与提示】
1.逆转录反应过程,需建立无rnaase环境,以避免rna的降解。
2.成功的逆转录反应决定于高质量的模板rna。
高质量的rna至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如edta或sds。
此外,rt-pcr所遇到的一个潜在的困难是rna中沾染的基因组dna。
使用较好的rna分离方法,如trizolreagent,会减少rna制备物中沾染篇三:
rt-pcr实验方法总结
rt-pcr实验方法总结
rt-pcr实验有三步:
抽提rna,rt,pcr。
要求:
1.做rt前必需测rna浓度,逆转录体系对rna量还是有一些要求,常用500ng或1ug。
2.rt按要求做,一般不会出太大问题。
3.pcr,按常规。
但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cdna存在,不是单改变mg2+浓度、退火温度能解决的。
1)rt和pcr时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?
必须
在rt时,引物设计有3种方法即a:
random9mers;b:
oligodt-adaptorprimer;和c:
特异的下游引物。
如果用a和b方法,是扩增的所有的cdna(理论上),还要用此产物做pcr的模板继续扩增。
如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?
/retype/zoom/e0c5d6ebaeaad1f346933f1e?
pn=5&x=0&y=474&raww=16&rawh=16&o=png_6_0_0_438_601_18_18_893.25_1263.375&type=pic&aimh=16&md5sum=86a939f122dd0d749a911550d24d3d30&sign=a7f1328b61&zoom=&png=2074-8806&jpg=0-0"target="_blank">点此查看
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pcr试剂pcr对照特异性
pcr试剂盒
pcr克隆试剂盒
rnarnase
检测/
去除
rt-pcr试剂rt-pcr标准品定量pcr试剂定量pcr标记总rna分离纯化盒pcr产物纯化核酸酶聚合酶反转录酶rt-pcr实验方法大全
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2007-7-10热门指数:
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rt-pcr实验有三步:
抽提rna,rt,pcr。
要求:
1.做rt前必需测rna浓度,逆转录体系对rna量还是有一些要求,常用500ng或1ug。
2.rt按要求做,一般不会出太大问题。
3.pcr,按常规。
但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cdna存在,不是单改变mg2浓度、退火温度能解决的。
1)rt和pcr时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?
必须
在rt时,引物设计有3种方法即a:
random9mers;b:
oligodt-adaptorprimer;和c:
特异的下游引物。
如果用a和b方法,是扩增的所有的cdna(理论上),还要用此产物做pcr的模板继续扩增。
问题:
在做rt-pcr遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!
(注:
已肯定该基因在两种组织中都表达,篇四:
rt-pcr实验方法总结大全
rt-pcr实验方法总结大全
rt-pcr实验有三步:
抽提rna,rt,pcr。
要求:
1.做rt前必需测rna浓度,逆转录体系对rna量还是有一些要求,常用500ng或1ug。
2.rt按要求做,一般不会出太大问题。
3.pcr,按常规。
但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cdna存在,不是单改变mg2+浓度、退火温度能解决的。
1)rt和pcr时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?
必须
在rt时,引物设计有3种方法即a:
random9mers;b:
oligodt-adaptorprimer;和c:
特异的下游引物。
如果用a和b方法,是扩增的所有的cdna(理论上),还要用此产物做pcr的模板继续扩增。
问题:
在做rt-pcr遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!
(注:
已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)
从这两种组织中提取的rna的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?
请高手指教!
解答:
1.rt-pcr有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再pcr。
但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于pcr的进行,当然也可能是我买的kit不太好。
(promega)。
2.rt-pcr应具备的条件
高质量的rna(保留后可做5',3'race);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑rna的浓度或是cdna的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将rna的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。
3.race
我做过race(3'race是宝生物的kit;5'race是gibico),但现在再进行另一个同源基因的3'race时却怎么也p不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(race的方法),而另一个基因的3'utr却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3'utr太长的缘故,我都快绿了,有无
rt-pcr的常用内标b-actin和gapdh的使用有选择性吗?
比如不同的细胞,不同的刺激。
有关内参:
rt-pcr内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。
问:
我曾经作过同一管的pcr,内有actin和目的基因引物。
虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、mg2+加倍)。
请教mxbdna2003,你是如何处理同一管的pcr的各成分的浓度?
答:
itshoulddeterminedtheamountofrna.butitnotforthequantitityofthepcr.itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplate<(forrtandpcr)andbettrerforpublicationandeditor
ifhedonnotknowthepreoceduremuch.buttheamountjustusingaccuratepiptteiswrong.itshoudberememberedtodotheinnercontrolofhousekeepinggeneeverytime.
在同一管中做rt,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶本来就是过量的^-^,(平时做pcr的时候,完全可以再省一些taq酶的,半斤八两就可以了,我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。
mg就跟不能变了,一变整个体系就变了。
能看到均一条带就很好了。
关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上3、5摸总是必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间。
有关内参的建议:
一定要做内参的,每一次,我想。
不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都谈了,再说一边我得观点,1、半定量和定量rt-pcr做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量,除非你能准确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。
2、以电泳为基础的半定量rt-pcr本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的,3、半定量rt-pcr应该再两管中进行,除非内参基因和目的基因表达相同,长度差不多,gc含量相似,或者实在穷的要省pcr管和taq。
关于平台期和线性期的问题,实际上线性期是指数期,只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。
看上去任何一个时期都可以,实际上是不对的,因为牵涉到酶促动力学的问题,这个我也不懂,有一些专门的文章,好像,涉及到很多化学的东西。
我们学医的,也没必要知道那些,但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系,这种反应单靠改变其中一种成分没有用的,酶一直是过量,再加酶也没用,引物ntp都是这样。
烟鬼正传,最好选线性期的开始阶段,但是要在你的凝胶成像分辨范围内,所以选一个这两种的契合点。
给你一张图你就明白了,再开始的时候酸的是切线,这图我在***帖过。
关于引物设计,再可能的情况下,除了常规要求之外,最好兼顾跨内含子(不过,根据要求,还可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组pcr)、长度小于500bp-600bp等等。
引物当然要设计成一样的退火温度,即使不再一管中,也要一样的,要在一台机器里啊。
我的引物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这样任何几个都可以拿来披,也不用查。
我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件涉及的在好,有些基因在它出软件的时候,还没发现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了,怎么考虑内含子的问题呢?
18s的引物也和著名的βactin一样是设计的,只要拿到序列就可以了,但是限制是只能用总rna为模板,但是比actin和bubulin等可准多了,更不要说gapdh这个破烂了。
18s除了在细胞中更相同(量)外,主要是它占的比例远远高于看家基因,所以定量更加准确,我想,不知对不对,请几位主任和eeflying指教。
我认为,就像你用某一种东西的数量去概括,因该选那种多的东西,说一座房子是由2000块砖造成的,比说又29根梁更准确吧。
更不要说没有看家基因不看家的缺点,因为他是服务于整
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